場地實際重金屬復合污染土壤生態毒性效應定量評價

馬喆，王美娥，姜瑢，陳衛平

1. 中國科學院生態環境研究中心，城市與區域國家重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學，北京 100049

近年來，隨著我國經濟結構調整和經濟增長方式轉變，城鎮工業企業搬遷遺留場地的土壤污染問題日益突出[1]。原環境保護部2014年調查報告顯示，我國工業廢棄地點位超標率為34.9%，主要涉及礦山開采、有色金屬冶煉、電鍍、制革、化工生產和加工等行業[2]。調查研究發現，電鍍污染場地中鎘（Cd）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鋅（Zn）和鎳（Ni）復合污染嚴重[3-4]。復合污染的聯合毒性效應定量評價是污染土壤生態風險評估的關鍵內容，尤其在場地風險評估中，場地特異性（site-specific）是必須要考慮的重要因子。

目前對復合污染生態效應的評價通常采用“自下而上”效應評價（bottom-up evaluation）方法，即根據污染物的作用方式，基于單一污染物毒性數據，采用濃度加合模型（concentration addition, CA）、獨立作用模型（independent action, IA）或復合指數模型（combination index, CI）進行毒性效應定量估算。然而，這種方法需要大量毒性數據，并且由于毒性數據庫中的數據大多來自實驗室模擬試驗，在外推到野外實際污染土壤中往往會出現數量級的誤差[5]。與之相比，“自上而下”效應評價（top-down evaluation）方法通過原位污染土壤生物試驗，結合生物致毒機理的分析，基于主導污染物識別結果，進行基質整體毒性效應評價，與實際土壤污染特征相關性較強，能夠符合場地風險中場地特異性的要求[6-7]。盡管如此，“自上而下”效應評價方法由于較難定量估算復合污染聯合生態效應，同時缺乏統一的分析程序，其實際應用較少。

蚯蚓是土壤生態系統的重要組成部分，具有分布廣、數量大和對污染物足夠敏感等特點，常被用作土壤污染物毒性評價的模式生物[8]。蚯蚓的污染物暴露通常是通過皮膚或者與皮膚相似的腸道暴露，暴露途徑簡單，毒性效應與蚯蚓體內暴露及土壤環境暴露有關[9]，同時，蚯蚓體內多種生物標志物如丙二醛（MDA）、金屬硫蛋白（MT）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）等，與污染物暴露之間的脅迫-響應關系明顯[10-13]。目前蚯蚓的毒理試驗在場地土壤污染生態風險評估、污染物土壤環境質量標準與基準制定、污染場地修復效果評估等方面均有廣泛應用[14]。

本研究耦合“自下而上”與“自上而下”2種方法，采用多元統計分析手段，構建了既能夠進行定量估算，又具有場地特異性的野外實際場地污染土壤的生態效應定量評價方法。并以江蘇省某廢棄電鍍場地為研究對象，采用蚯蚓土壤微宇宙培養實驗，進行野外實際重金屬復合污染土壤的毒性效應定量評價。本研究旨在建立一套統一的野外實際污染土壤生態效應評價程序，為土壤污染生態風險評估提供技術支撐。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 研究場地描述及土壤樣品采集

本研究土壤取自江蘇省某廢棄電鍍場地，該電鍍廠是長三角地區典型的電鍍加工、金屬和非金屬表面處理企業，1985年建廠，包括電鍍車間、硝酸鋅生產車間及廢水處理池，2014年關停，廠區廢棄至今，現場環境較差，廠區呈正方形，邊長50 m，面積2 500 m2，土地利用類型屬于建設用地。依據《建設用地土壤污染狀況調查技術導則》（HJ 25.1—2019）[15]，采用分區布點法，考慮場地功能分布，在電鍍車間、廢水處理池和硝酸銀生產車間均布設樣點，選取不同重金屬污染程度的13個樣點（S1～S13）進行研究。

每個土樣采用五點混合采樣法采集表層土壤（0～20 cm），將土壤樣品裝入自封袋中做好標記帶回實驗室。將帶回實驗室的土樣置于干燥通風處自然晾干，土樣去除石塊及植物根系等雜物后碾磨，分別過10目和100目尼龍篩備用。

1.2 蚯蚓毒性效應實驗

本實驗的受試蚯蚓為赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida），購自天津惠裕德生物科技有限公司。實驗前先將蚯蚓在人工培養箱里預培養14 d，培養箱溫度設為（20±1） ℃，濕度75%，光照20%。預培養后選取體質量200～300 mg發育好具有明顯環帶的成蚓進行微宇宙實驗。

本研究采用室內土壤微宇宙實驗。首先取500 g干土，加入一定量的去離子水使其含水量為35%，混合均勻后放入塑料燒杯中。然后在每個燒杯中放置15條蚯蚓，用保鮮膜封口，將保鮮膜上扎幾個小孔，保證蚯蚓可正常呼吸同時減少土壤水分蒸發。將每個燒杯編號，放置于人工氣候箱中（培養箱溫度設定為（20±1） ℃，濕度為75%，光照為20%，白天∶黑夜=12 h∶12 h。根據采集到的土壤量，實驗共設置13個處理（S1～S13），每個處理設置4個重復。培養14 d后，隨機取出8～10條蚯蚓，經24 h濾紙清腸洗凈后，測定蚯蚓體內重金屬含量（干重）和酶活。本實驗暴露過程中各土樣蚯蚓的存活率均在80%以上。

1.3 土壤理化性質及重金屬含量分析

1.3.1 土壤理化性質測定

土壤pH測定采用土水比1∶2.5混合后用pHS-3C型pH計（上海儀電，中國）測定[16]。土壤總有機碳采用鹽酸預處理后，用元素分析儀ElementarVario ELⅢ（Hanau，德國）直接測定[17]。土壤陽離子交換量依據《土壤 陽離子交換量的測定 三氯化六氨合鈷浸提-分光光度法》（HJ 889—2017）[18]測定。土壤重金屬有效態依據《土壤8種有效態元素的測定 二乙烯三胺五乙酸浸提-電感耦合等離子體發射光譜法》（HJ 804—2016）[19]，對2 mm風干土采用二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸提法測定。

1.3.2 重金屬測定

土壤重金屬測定：土壤重金屬含量的測定采用HNO3-HF-HClO4-HCl四酸消解法[20]，采用ICP-MS（7500A，安捷倫，美國）測定樣品中Cd、Ni、Cr和Pb含量，采用ICP-OES（Optima 8300，珀金埃爾默，美國）測定樣品中Zn含量。每批樣品設置3個空白對照組、10%樣品的重復和3個標準物質，其中標準物質使用國家標準土壤物質GSS-27進行質量控制，回收率為83.0%～119%之間。

蚯蚓重金屬累積含量測定：將待測蚯蚓放入有濕潤濾紙的培養皿中，進行24 h吐泥，后用去離子水沖洗干凈，冷凍干燥48 h，使用研缽磨碎后采用微波消解法（GB 5009.268—2016）[21]在微波消解儀（Multiwave PRO, Anton Paar，奧地利）中進行消解，采用ICP-MS（7500A，安捷倫，美國）測定樣品中Cd、Ni、Cr、Pb和Zn含量。每批樣品設置3個空白對照組、10%樣品的重復和3個標準物質，其中標準物質使用國家標準物質豬肝GBW10051（GSB-29）進行質量控制，回收率為85.1%～123%之間。

1.4 蚯蚓生物標志物響應測定

取清腸后蚯蚓3～4條，稱量質量，液氮迅速冷凍，按照樣品質量（g）∶緩沖液體積（mL）=1∶9的比例加入PBS緩沖液（pH=7.4），4 ℃冰浴下使用組織研磨器充分研磨，將研磨好的10%組織勻漿經離心機2 000 r·min-1離心10～15 min，離心后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

蚯蚓生物標志物均使用試劑盒測定，嚴格按照試劑盒內說明進行操作?？偟鞍走x用BCA法，SOD選用WST-1法，CAT選用可見光法，GSH選用微板法，MDA和MT選用酶聯免疫分析（ELISA法）?？偟鞍锥繙y定試劑盒（A045-3-2）、SOD測定試劑盒（A001-3-2）、CAT測定試劑盒（A007-1-1）和GSH測定試劑盒（A006-2-1）購自南京建成生物工程研究所，昆蟲MDA酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒（CD92025）和昆蟲MT酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒（CD92144）購自武漢純度生物有限公司。

1.5 數據分析

1.5.1 有效生物標志物篩選

首先對生物標志物進行KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）檢驗和Bartlett檢驗，判斷對其進行主成分分析（principal component analysis, PCA）的可行性。然后對生物標志物進行多元分析，通過PCA分析和聚類分析將不同樣點分成多個組，并通過相似性分析（analysis of similarities, ANOSIM）檢驗分組是否具有統計學意義。最后，采用BVSTEP方法篩選有效生物標志物，并對所篩選的有效生物標志物與第一主成分進行回歸分析，得到有效生物標志物與蚯蚓健康狀況的關系。

1.5.2 主導污染物識別

采用典范對應分析（canonical correspondence analysis, CCA）確定生物標志物和污染物暴露指標之間的相關關系，采用方差膨脹因子法（variance inflation factor, VIF）對CCA建模中冗余環境因子進行選擇[22]，最后根據CCA結果篩選出主導污染物。

1.5.3 數據分析

本研究采用Microsoft Excel 2016進行原始數據處理；采用SPSS 24.0對土壤理化性質和土壤重金屬含量進行數據統計性描述，對蚯蚓生物標志物進行單因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）；采用Origin 2018軟件對蚯蚓生物標志物響應進行多元分析；采用R語言進行ANOSIM分析和BVSTEP分析；采用Canoco5軟件進行VIF和CCA分析；采用SPSS 24.0進行多元回歸分析；采用Origin 2018軟件完成作圖。

2 結果與討論（Results and discussion）

2.1 土壤理化性質及重金屬含量

如表1所示，13個場地土壤樣品的Cd、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn等6種重金屬總量和DTPA提取態含量變異較大，變異系數分別為93.8%～309%和114%～315%之間，其中土壤Cd和Zn的總量及DTPA提取態含量均較高。土壤pH值和CEC的變異較小，有機質含量整體較低，大多在1%以下。

表1 供試土壤關鍵理化性質、重金屬總量和DTPA提取態含量Table 1 The total and DTPA extracted heavy metal concentration and the key physical-chemical properties of the tested soils

2.2 蚯蚓組織重金屬生物累積特征

蚯蚓組織重金屬生物累積特征如圖1所示，與以往研究結果一致[23-24]，蚯蚓對不同重金屬的吸收和富集能力不同，對6種重金屬的平均富集系數的大小順序為：Cd>Cu>Zn>Ni>Pb>Cr。其中，Cu和Zn的富集系數接近，這一現象與多數報道結果[25-26]一致，這是因為Cu和Zn元素均為生物必需元素；Cr、Ni和Pb的生物富集系數之間的差異也較小，并且這3種元素與Cd、Cu和Zn相比均明顯較低，這主要是由于這3種元素在土壤中的生物有效性含量較低。同時，蚯蚓對Cd的BCF均值為4.00，而其他元素BCF均值均<1，這是因為土壤中Cd具有較強的遷移性，易被蚯蚓吸收富集[27-28]。譬如，本研究中Cd的DTPA浸提率為7.71%～22.0%，明顯高于其他5種元素；并且蚯蚓能夠通過取食攝入和皮膚直接吸收2種方式吸收累積土壤中的Cd，對于其他元素，取食攝入與土壤成分結合的重金屬，是其進入蚯蚓組織的最主要方式[29]。

此外，本研究采用了野外實際污染土壤，存在多金屬復合污染現象，復合污染元素之間的相互作用能夠影響生物的吸收和累積。Traudt等[30]在植物試驗中發現，重金屬Ni、Cu和Cd復合污染下，植物Lemnaminor對這3種重金屬的吸收均存在競爭作用，但是進入植物組織內以后只有Cu與Cd之間存在著競爭作用。因此，在復合污染生態效應評價中必須考慮污染物的生物累積特征。

2.3 有效生物標志物篩選

對不同污染程度土壤樣品培養下的蚯蚓生物標志物毒性響應進行單因素方差分析，結果如表2所示，6種蚯蚓生物標志物響應均呈顯著差異（P<0.01）。對蚯蚓生物標志物毒性響應數據采用KMO檢驗和Bartlett檢驗，結果表明，KMO為0.503（>0.5）且Bartlett檢驗顯著（P<0.01），表明該數據可以采用PCA進行分析。PCA和聚類分析結果（圖2（a））表明，PC1和PC2的方差貢獻率分別為30.1%和23.6%；不同樣點土壤處理下生物標志物響應可以分為3個組，第1組（G1）包括S3、S7、S8和S9，第2組（G2）包括S2和S13，第3組（G3）包括S1、S4、S5、S6、S10、S11和S12。對分組結果進行ANOSIM分析，結果表明3個分組的樣點之間存在顯著差異（P<0.01）。而對3個組之間土壤重金屬總量、DTPA提取態含量以及蚯蚓生物累積濃度之間的污染物生物體內和體外暴露量進行比較分析發現，重金屬Cd和Zn在G1的3類暴露指標與G3相比均顯著較高（P<0.05），與G2相比升高程度不顯著；而其他的重金屬在3個組之間均無顯著差異（圖3）。因此可以認為，在3個組的樣點土壤培養下蚯蚓健康狀況由好到差的次序如下：G3>G2>G1；PC1從左到右也因此體現了蚯蚓健康狀況由差至好的趨勢。

圖1 蚯蚓組織重金屬的生物累積量（a）和生物富集系數（BCF）（b）注：圖（a）中Cd、Cr、Cu、Ni和Pb采用左邊的縱坐標，Zn采用右邊的縱坐標。Fig. 1 The concentrations （a） and the bioconcentration factors （BCF） （b） of heavy metals in earthwormsNote: In Fig.（a）, Cd, Cr, Cu, Ni and Pb correspond to the ordinate on the left, and Zn corresponds to the ordinate on the right.

通過BVSTEP法進行有效生物標志物篩選，結果表明，GSH、MDA和CAT的組合與其他所有生物標志物的組合顯著相關，因此，它們的組合可以視為所有生物標志物響應的最小數據集。通過3個有效生物標志物響應與主成分1（PC1）的回歸分析結果（圖2（b）～（d））發現，GSH和MDA含量隨著蚯蚓健康狀況的增加而顯著降低（P<0.01），而CAT活性隨著健康狀況的增加而顯著增加（P<0.01）。

2.4 土壤主導污染物識別

進一步采用CCA分析生物標志物響應與土壤重金屬總量、DTPA提取態含量和蚯蚓重金屬生物累積量之間的相關性。采用VIF法對CCA建模中的冗余環境因子進行選擇，結果表明只有DTPA-Cu和DTPA-Pb的VIF值>10（表3），說明兩者之間存在顯著自相關關系（P<0.01），而土壤重金屬總量和蚯蚓生物累積量在6種重金屬之間不存在多種共線性。因此僅對土壤重金屬DTPA提取態含量與生物標志物響應的CCA分析中剔除了DTPA-Cu。CCA分析結果表明，首先，土壤重金屬總量對生物標志物響應變化的相關性顯著的為Cu、Cd、Zn和Pb元素，貢獻率分別為3.90%、54.0%、17.3%和11.8%；土壤重金屬DTPA提取態相關性顯著的元素為Cr、Cd和Zn元素，貢獻率分別為5.40%、53.8%和22.7%；蚯蚓生物累積重金屬相關性顯著的元素為Cd、Cu和Zn元素，貢獻率分別為41.1%、14.6%和28.2%（圖4）。

表2 不同重金屬污染程度的樣點土壤中蚯蚓生物標志物響應的方差分析Table 2 ANOVA of biomarker responses in earthworms treated with different levels of heavy metal contaminated site soil

圖2 蚯蚓生物標志物響應的多元分析注：（a） PCA結合聚類分析；（b～d） 有效生物標志物GSH、MDA、CAT與第一主成分之間的回歸分析結果。Fig. 2 Multivariate analysis of biomarkers responses of earthwormsNote: （a） Principal component analysis （PCA） superimposed with cluster analysis; （b）～（d） Regression analysis between each effective biomarkers GSH, MDA and CAT and the first principle factor.

圖3 不同樣點分組（G1、G2、G3）之間重金屬含量的比較注：（a） 土壤總量；（b） DTPA提取態含量；（c） 蚯蚓體內生物累積量的比較。Fig. 3 Comparison in heavy metal concentrations among the three divided groups （G1, G2, G3）Note: （a） Soil total heavy metal concentrations; （b） DTPA-extracted heavy metal concentrations; （c） Earthworm bioaccumulation of heavy metal concentrations.

由此可見，重金屬Cd和Zn對生物標志物響應變化的貢獻率在3類暴露方式下均較高，綜合以上3個組（G1、G2和G3）體內和體外重金屬暴露量比較結果，可以認為重金屬Cd和Zn為引起蚯蚓生物標志物響應變化的主導污染物。

2.5 重金屬復合污染對蚯蚓生物標志物的毒性效應評價

對3類特征生物標志物響應，即，GSH、MDA和CAT分別進行與主導污染物Cd和Zn的土壤總量、DTPA提取態含量以及蚯蚓生物累積量的逐步回歸，結果如表4所示，蚯蚓GSH含量的變化與土壤Cd總量及Zn的DTPA提取態含量之間存在多元線性關系；蚯蚓MDA含量的變化能夠通過土壤Cd的DTPA提取態含量進行預測；CAT活性的變化能夠通過Zn的土壤總量及蚯蚓生物累積含量進行預測。

由于蚯蚓的GSH含量和CAT活性的變化涉及2種類型的污染物暴露，因此基于表4的回歸方程，進一步采用CA模型來綜合計算2類暴露的復合半效應濃度[31]，結果如圖5所示。以蚯蚓組織GSH含量變化為毒性效應終點的土壤Cd總量及Zn的DTPA提取態含量的復合半效應濃度（EC50mix）在各個樣點均低于實測濃度（圖5（a））；以MDA含量變化為毒性效應終點的EC50值在S3、S7、S8和S9等4個樣點低于實測值（圖5（b））；以蚯蚓組織CAT為毒性效應終點的土壤Zn總量及蚯蚓生物累積含量的EC50mix值在S2、S3、S4、S7、S8、S9和S10等7個樣點低于實測值。以上結果一方面表明，3類有效生物標志物的敏感性從高到低的順序為：GSH>CAT>MDA。這3類生物標志物都與生物的抗氧化系統有關，其中GSH作為一種含有巰基基團的三肽，易與重金屬離子結合，減輕重金屬污染物對蚯蚓組織的損傷；此外，重金屬污染物會造成蚯蚓體內活性氧（ROS）升高，GSH作為一種重要的還原劑底物，在清除ROS的生化反應中起重要作用，并被氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）[12,32]。當GSH消耗量突然増高導致其含量下降時，作為一種對環境污染的應激機制，生物體會誘導合成更多的GSH作為反饋[33]。另一方面，從主成分分析及多元回歸分析的結果中可以發現，不同元素以及不同類型暴露之間（如，與GSH含量變化對應的土壤總Cd與DTPA-Zn），以及同一元素不同暴露之間（如，與CAT活性變化對應的土壤總Zn與蚯蚓組織生物累積Zn）都有可能存在交互作用，而這些污染物暴露之間不存在暴露量變化的相關性。尤其是土壤總Zn與生物累積Zn之間，由于Zn元素對生物的獨特作用，導致蚯蚓的生物累積Zn與土壤總Zn含量之間的相關性不顯著，但是2類暴露均與CAT活性變化有關。

表3 方差膨脹因子分析（VIF）Table 3 Variance inflation factor （VIF） analysis

圖4 蚯蚓生物標志物響應與土壤重金屬（a）、土壤DTPA提取態含量（b）和蚯蚓重金屬累積量（c）的CCA分析結果Fig. 4 CCA analysis of biomarkers responses of earthworms and the concentration of heavy metals （a）, the concentration of DTPA-extracted in soils （b）, and the concentration of heavy metals in earthworms （c）

表4 有效生物標志物響應與重金屬暴露的回歸方程Table 4 Regression equations between the responses of effective biomarkers and heavy metal exposures

圖5 主導污染物暴露的EC50值及其實測值的比較Fig. 5 Comparison of calculated EC50 and measured concentration of dominant heavy metals

綜上所述，本研究結果表明，針對野外實際土壤重金屬復合污染，采用多元統計分析手段，通過有效生物標志物響應、主導污染物的篩選以及聯合效應估算，能夠實現生態效應的定量評價。