異菌脲在油菜植株、土壤和水中的代謝途徑及代謝物3,5-DCA的毒性研究

汪震，華修德，施海燕，王鳴華

南京農業大學植物保護學院，南京 210095

異菌脲（iprodione）是二甲酰亞胺類高效廣譜保護性殺菌劑。其作用機理是抑制蛋白激酶，控制許多細胞功能的細胞內信號，包括與碳水化合物結合進入真菌細胞組分，起到干擾作用，既可抑制真菌孢子萌發和產生，也可抑制菌絲生長，主要防治由灰葡萄孢屬[1]、叢梗孢屬[2]、核盤菌屬[3]、小菌核菌屬和交鏈孢屬[4]等引起的多種蔬菜、果樹和果實貯藏期病害[5]。據中國農藥信息網統計，目前我國登記的含有異菌脲的產品有161個，其中登記在油菜上防治油菜菌核病的產品有9個。

化學農藥的代謝產物和代謝途徑受環境因素影響其轉化過程復雜多樣[6]。研究證明，有些農藥代謝物的毒性比母體化合物更大。例如，Zhang等[7]通過細胞毒性試驗發現丙硫菌唑的主要代謝物脫硫丙硫菌唑的細胞毒性高于母體；Gao等[8]研究發現乙蟲腈的代謝產物乙蟲腈亞砜對斑馬魚的毒性是母體的6倍；Liu等[9]報道了吡丙醚在5種土壤中的主要降解產物4-羥基-吡丙醚對蚯蚓的毒性遠高于母體吡丙醚。因此，研究和評估農藥代謝產物的環境風險對食品安全和生態安全具有重要的意義[10-12]。研究表明，異菌脲在植物表面主要通過脫鹵反應發生代謝[13]。此外，研究發現3,5-二氯苯胺（3,5-DCA）是二甲酰胺類殺菌劑（異菌脲、腐霉利和乙烯菌核利）在植物和環境中的代謝產物之一。Ambrus等[14]報道了二甲酰亞胺類殺菌劑在大豆、黃瓜和花生等植物上的主要代謝物之一為3,5-DCA。Rifai等[15]發現3,5-DCA是腐霉利的光解產物。美國環境保護局（U.S. Environmental Protection Agency, US EPA）報道了3,5-DCA比母體化合物具有更強的毒性和持久性[16]。Dom等[17]研究發現，3,5-DCA對羊角月牙藻的72 h-EC50值為14.5 mg·L-1，對大型溞的48 h-EC50值為0.60 mg·L-1。Lai等[18]研究發現異菌脲代謝產物3,5-DCA對斑馬魚成魚的毒性高于母體異菌脲。因此，聯合國糧食與農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO）規定乙烯菌核利的殘留定義為乙烯菌核利及其所有含3,5-DCA部分的代謝產物之和[19]。異菌脲在我國主要用于防治油菜菌核病，其在發揮藥效作用的同時，也會對環境造成污染，還會降解產生代謝產物。因此，開展異菌脲在油菜上的代謝研究至關重要，有助于明確其代謝途徑。同時研究異菌脲代謝產物3,5-DCA的生態毒性對于異菌脲的風險評估具有重要的意義，可為異菌脲的殘留物定義提供參考信息。本文通過室內模擬試驗，采用UPLC-TOF-MS/MS研究異菌脲在油菜植株、土壤和水中的代謝產物，推測異菌脲可能的代謝途徑，并研究了代謝產物3,5-DCA對Hep G2細胞和蚯蚓的毒性。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 供試材料

供試土壤：選用江蘇省南京市0～20 cm未被污染的耕作層土壤，實驗前先將土壤活化一周，將活化后的土壤室內陰干，過2.0 mm篩，置于常溫下備用。供試油菜：采用甘藍型油菜品種（揚油1號），油菜籽購于江蘇金土地種業有限公司。細胞株：選用肝癌Hep G2細胞系為體外實驗模型，由中國科學院細胞庫提供。供試蚯蚓：赤子愛勝蚓（Eiseniafoetida），由江蘇省鎮江市句容蚯蚓養殖場提供，并在實驗室條件下飼養14 d后，選擇體質量在0.30～0.60 g的具有生殖環帶的蚯蚓進行實驗。

1.2 試劑與儀器

異菌脲標準品（99.5%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；3,5-DCA標準品（98%，上海邁瑞爾化學技術有限公司）；色譜純正己烷、乙腈、甲醇（美國TEDIA公司）；CCK-8試劑盒（北京Solarbio生物有限公司），其他化學試劑均為分析純。島津LC 20ADXR液相色譜（Shimadzu，日本）串聯AB SCIEX Triple TOF 5600質譜儀（AB SCIEX，美國）；Forma Series II二氧化碳培養箱（美國Thermo Electron）；M5多功能酶標儀（美國Molecular Dexices）。

1.3 水解

用pH 7的Clark-Lubs緩沖溶液配制5 mg·L-1異菌脲標準溶液，超聲混勻，分裝于棕色容量瓶中，置于25 ℃的恒溫培養箱中避光密閉培養，于0、3、6、12、24和48 h采集水樣分析，設3個重復。

1.4 土壤降解

參照《化學農藥環境安全評價試驗準則》（GB/T 31270—2014），準確稱取50.0 g土壤，加入5 mL濃度為200 mg·L-1的異菌脲丙酮溶液，攪拌均勻，置于避光通風處，待有機溶劑揮發后，再與200 g土壤充分混合，使土壤中的終濃度為4 mg·kg-1，分裝在50 mL離心管中（每管10.0 g），含水量保持在飽和持水量的60%，置于（25±1） ℃黑暗的恒溫恒濕培養箱中培養，分別在0、3、7、14、21、35和63 d取樣分析。記錄所有離心管的原始質量，培養過程中每2 d添加水分使質量保持初始水平，保持土壤原有的持水量。另設不加異菌脲的土壤作為空白對照和溶劑對照，設3個重復。

1.5 植物代謝

按照文獻方法[20-22]，對油菜種子進行消毒和萌發。萌發后選取5～7葉期的健康幼苗，將其移至含Hogland營養液培養瓶中，待其穩定生長后，用小型手持式噴霧在油菜葉表面均勻噴施50 mL 10 mg·L-1的異菌脲水溶液（含0.1% Triton X-100），置于恒溫培養箱內（光周期14 h·d-1，溫度（25±1） ℃，相對濕度75%）培養。在處理后的3 h、6 h、1 d、3 d、6 d、9 d和16 d采集植株樣品檢測，每次隨機取3株。另設不施藥的空白對照和溶劑對照。

1.6 樣品分析方法

1.6.1 樣品提取

土壤：稱取土壤樣品10.0 g于50 mL離心管中，添加5 mL水和30 mL乙腈，渦旋10 min后再超聲15 min，加入2.0 g無水MgSO4和3.0 g NaCl，渦旋5 min，隨后以4 000 r·min-1離心5 min，取一半上清液過無水Na2SO4后減壓濃縮，2 mL色譜乙腈溶解定容，過0.22 μm濾膜，待測。

油菜植株：稱取剪碎后的油菜植株樣品10.0 g于250 mL三角瓶中，加入10 mL水和30 mL乙腈，振蕩1 h，抽濾后置于含有3.0 g NaCl的具塞量筒中，充分振蕩1 min，靜置30 min，取一半上清液，減壓濃縮，用2 mL色譜乙腈定容，過0.22 μm濾膜，待測。

水樣：取2 mL水樣直接進樣分析。

1.6.2 LC-MS儀器檢測條件

LC-MS的分析采用島津LC 20ADXR液相色譜串聯AB SCIEX Triple TOF 5600質譜儀，色譜柱Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×50 mm，2.7 μm；Aglient），流速0.3 mL·min-1，進樣體積5 μL，流動相由0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）組成，采用梯度洗脫：0～0.5 min，90% A；0.5～2.5 min，90%～40% A；2.5～9.0 min，40% A；9.0～10.0 min，40%～5% A；10.0～14.0 min，5% A；14.0～14.2 min，5%～90% A；14.2～16.0 min，90% A。分析時間16 min。

質譜參數：多反應監測模式下，Q-TOF-MS電離模式采用電噴霧離子化正離子源（ESI+），m/z掃描范圍50～500，離子噴霧電壓5 500 V，源溫度550 ℃，霧化氣4.48×106Pa，加熱氣4.48×106Pa，簾氣2.41×106Pa去簇電壓80 V，碰撞能量40 V，碰撞能量擴散20 eV，離子釋放延遲67 ms，離子釋放寬度25 ms。

1.7 細胞毒性

細胞毒性測定選用細胞檢測試劑盒（CCK-8）檢測細胞增殖活性。將生長至對數期的Hep G2細胞以1×105～4×105個·mL-1的初始密度接種于96孔板中，每孔100 μL，將培養板放在培養箱中預培養24 h（37 ℃、5% CO2）；吸出培養液換為不同濃度的含藥培養液（異菌脲濃度為50、100、200、250和300 mg·L-1；3,5-DCA濃度為25、50、100、150和200 mg·L-1），染毒24 h；向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育4 h；用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。按式（1）計算細胞抑制率。

細胞抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%

（1）

式中：As為試驗孔吸光度（含有細胞和待測物的培養基）；Ac為對照組吸光度（含有細胞的培養基，無待測物）；Ab為空白孔吸光度（含有培養基，不含細胞和待測物）。

1.8 蚯蚓毒性

按照《化學農藥環境安全評價試驗準則》（GB/T 31270—2014）中蚯蚓急性毒性人工土壤法進行3,5-DCA對蚯蚓的急性毒性實驗，設7個濃度組（10、20、30、40、50、60和70 mg·kg-1），并設空白對照組和溶劑對照組。每個濃度設3個重復，每個重復10條蚯蚓。觀察并記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數（用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無反應則為死亡），及時清除死蚯蚓。統計第7天和第14天的死亡率，計算LC50。同時使用氯乙酰胺作為參比物質中測定蚯蚓對化合物的敏感性。

2 結果與討論（Results and discussion）

2.1 異菌脲在水中代謝產物的鑒定及代謝途徑分析

異菌脲及其代謝產物在水中的提取離子圖如圖1（a）所示。在保留時間為11.81、7.98、8.00、6.91、11.46、11.76和6.53 min分別發現了代謝產物M1（C13H15Cl2N3O4）、M2（C12H15Cl2N3O2）、M4（C8H8Cl2N2O）、M5（C13H14ClN3O3）、M7（C9H6Cl2N2O2）、M8（C9H8Cl2N2O3）和M9（C6H5Cl2N）。根據各代謝產物的分子離子峰、質荷比、典型碎片、二級質譜信息及文獻，確定了代謝物的結構，如表1所示。

圖1 異菌脲（IPR）及其代謝產物在水（a）、油菜植株（b）和土壤（c）樣品中的提取離子圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of iprodione （IPR） and its metabolites from UPLC-TOF-MS/MS analysis in water （a）, rape plant （b） and soil （c） samples

根據代謝產物推斷異菌脲在水中可能的代謝途徑，如圖2所示。因為異菌脲是二甲酰亞胺類殺菌劑，結構式中二氧代咪唑烷的酰胺鍵不穩定，易發生水解反應。此外，還發生了C—N鍵斷裂，N-脫烷基化反應。異菌脲（M0）二氧代咪唑烷4號位酰胺鍵發生水解形成一級代謝產物M1；2號位的羰基水解形成M2，M2的脲酰胺鍵斷裂產生代謝物M4。異菌脲苯環上脫去Cl原子形成M5；還可以通過水解作用形成M7，M7的咪唑烷繼續水解形成代謝物M8，最終水解形成代謝物3,5-DCA（M9）。

2.2 異菌脲在油菜植株中代謝產物的鑒定及代謝途徑分析

異菌脲及其代謝產物在油菜植株上的提取離子圖如圖1（b）所示。保留時間11.81、12.30、11.54和11.46 min分別為M1、M3（C11H13Cl2N3O2）、M6（C10H7Cl2N3O3）和M7這4種代謝物。M3和M6結構式如表1所示。

植物對外源化合物的解毒代謝主要分為3個階段，其中Ⅰ相代謝是由植物酶介導的催化反應和非生物降解過程，包括氧化、水解和還原等[23]。參與Ⅰ相代謝的酶主要包括植物細胞色素P450、漆酶、含銅多酚的氧化酶、羧酸酯酶和硝基還原酶等[24]。同時農藥在植物角質層還會發生光解和非酶介導的水解[25]。Ⅰ相代謝是植物代謝最重要的一步，起到解毒作用。Liu等[26]研究報道了玉米體內P450酶參與了煙嘧磺隆的降解過程；Huang等[27]鑒定表達了水稻2個水稻漆酶基因（LOC_Os01g63180和LOC_Os12g15680），發現能降解莠去津和異丙隆，并檢測到相應代謝物羥基脫氫莠去津（HDHA）和2-OH-異丙基-異丙隆。異菌脲在油菜植株中可能的代謝途徑如圖2所示。進入油菜植株的異菌脲首先進行Ⅰ相代謝，通過水解作用產生M1、M3、M6和M7共4種代謝物，后3種與Ambrus等[14]的研究結果一致，而M1首次在油菜中發現。代謝物M1也在水解試驗中發現，因此可能是M1由植物表面非酶介導的水解過程中產生。綜合分析異菌脲在油菜上產生的代謝產物，推測異菌脲在油菜上的代謝是由于多種植物酶介導的體內代謝與非酶介導的化學降解共同作用的。

2.3 異菌脲在土壤中代謝產物的鑒定及代謝途徑分析

異菌脲在土壤中代謝產物的提取離子圖如圖1（c）所示，發現了5種代謝物（M1、M3、M6、M7和M8）。由圖2可知，異菌脲在土壤中的降解途徑主要是通過非生物降解為代謝物M1和M3，通過生物降解為代謝物M6、M7和M8。Athiel等[28]和Mercadier等[29]提出了土壤微生物降解異菌脲的代謝途徑，微生物可將異菌脲水解為N-（3,5-二氯苯基）-咪唑啉-2,4-二氧咪唑烷（M7）和3,5-二氯苯基脲-乙酸（M8）。Campos等[30]從土壤中分離出菌株C1通過水解可產生代謝物M7和M8?？梢?，異菌脲在土壤中的降解包括水解酶參與的微生物降解，通過水解反應形成代謝產物M7和M8。此外，本文還檢測出代謝產物M6，推測M6是降解過程中的中間產物。Athiel等[28]研究發現，異菌脲可通過非生物轉化形成N-（（3,5-二氯苯基）氨甲?；?N-（異丙基氨甲?；└拾彼?，與本文M1的分子質量和結構式一致，因此推測代謝物M1和M3是通過化學水解形成，是非生物降解途徑。

表1 異菌脲及其代謝產物的質譜信息匯總Table 1 Summary of all MS and MS2 data for metabolites of iprodione

圖2 異菌脲在水、油菜植株和土壤中可能的代謝途徑Fig. 2 Proposed pathways of iprodione in water, rape plants and soil

通過對異菌脲在土壤、水和油菜植株中的代謝產物及代謝途徑研究發現，異菌脲在土壤中的代謝主要是微生物參與的水解反應，在水相中的代謝主要為化學水解，在油菜植株中主要為降解酶參與的N-脫烷基化和水解反應。因此，推測異菌脲的水解作用是其在環境和植株中代謝的主要機制。

2.4 異菌脲及其代謝產物3,5-DCA的細胞毒性

如表2所示，異菌脲對Hep G2的IC50為304.8 mg·L-1，代謝物3,5-DCA的IC50為99.7 mg·L-1，3,5-DCA對Hep G2細胞毒性是異菌脲的3.1倍，表明異菌脲的代謝屬于增毒代謝。3,5-DCA也是乙烯菌核利的代謝產物，Lee等[31]等研究發現3,5-DCA對Hep G2細胞株的存活率有顯著影響，IC50為70.48 mg·L-1，而經228.89 mg·L-1乙烯菌核利暴露的Hep G2細胞的存活率沒有顯著下降，表明其對細胞的毒性也顯著高于母體。

2.5 3,5-DCA對赤子愛勝蚓的急性毒性

參比試驗結果顯示14 d-LC50為28.15 mg a.i.·kg-1（干質量），達到國標中規定的20～80 mg a.i.·kg-1（干質量）范圍，證明實驗蚯蚓對化合物敏感，可用于后續試驗。

人工土壤法測定3,5-DCA對赤子愛勝蚓急性毒性結果如表3所示。結果顯示，3,5-DCA對赤子愛勝蚓7 d、14 d-LC50分別為53.29 mg·kg-1和31.56 mg·kg-1。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》（GB/T 31270—2014）中農藥對蚯蚓的毒性等級劃分，3,5-DCA對赤子愛勝蚓為低毒（>10 mg·kg-1）。根據國際純粹與應用化學聯合會（International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC），人工土壤法下異菌脲對赤子愛勝蚓急性毒性的LC50>500 mg·kg-1，3,5-DCA對赤子愛勝蚓急性毒性約為其母體的15倍以上。由此可知，異菌脲在代謝過程中增加了對土壤生物蚯蚓的毒性效應。

本文通過高分辨質譜，鑒定了異菌脲在水中的7種代謝產物（M1、M2、M4、M5、M7、M8和M9）、土壤中的5種代謝物（M1、M3、M6、M7和M8）和油菜植株中的4種代謝產物（M1、M3、M6和M7），推測了異菌脲的代謝途徑。其中，代謝產物M4和M5為首次在水中發現，M1是油菜植株中新發現的代謝產物，完善了異菌脲的代謝途徑。異菌脲在油菜上的代謝途徑與其在大豆、黃瓜和花生中的代謝途徑相同，主要是通過酰胺鍵的裂解（水解作用）和C—N鍵斷裂（N-脫烷基化）。細胞毒性和蚯蚓毒性試驗結果表明異菌脲的代謝屬于增毒代謝。本文探究了異菌脲在水、土壤和油菜中的代謝產物和代謝途徑，明確了異菌脲在作物和環境中的代謝途徑，并為異菌脲及其代謝物3,5-DCA的生態風險評估提供了相關理論依據。

表2 異菌脲和3,5-二氯苯胺（3,5-DCA）的細胞毒性Table 2 Cytotoxicity of iprodione and 3,5-dichloroaniline （3,5-DCA）

表3 3,5-DCA對赤子愛勝蚓LC50Table 3 The LC50 of 3,5-DCA to Eisenia foetida