基于IBR模型研究磷化工區溪流水體對斑馬魚的毒性效應

代恒美，郭子毓，徐玉艷，張華，潘莎

貴州醫科大學公共衛生與健康學院，環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴陽 550025

近年來，隨著經濟的快速發展，人們對磷化工產品的需求日益增加，磷化工已成為我國國民經濟的重要支柱產業。然而，磷化工在生產過程中產生的磷（P）、氟（F）、砷（As）和鎘（Cd）等污染物易經大氣沉降、廢水排放及地表徑流等途徑進入周邊水環境，致使區域水環境質量惡化，并對水生生物構成潛在威脅[1-2]。因此，開展磷化工區水環境的生物毒性效應評估對正確認識磷化工污染的生態風險具有重要意義。

斑馬魚（Daniorerio）屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）、鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、短擔尼魚屬（Danio），是一種小型熱帶淡水硬骨魚類。具有產卵量大、易飼養、對毒物刺激較敏感、基因與人類高度同源等特點，是國際標準化組織（International Organization for Standardization, ISO）推薦的生態環境測試模式生物，廣泛應用于環境毒性評價研究中[3]。

當生物受到環境污染物脅迫時，體內自由基產生增多，進而引起氧化應激和氧化損傷。因此，可將生物體內抗氧化酶、抗氧化小分子和脂質過氧化產物等作為反映生物氧化應激的標志物，有效預測環境中污染物的生物效應及毒理學特征[4]。但由于不同生物標志物對環境污染物的敏感程度存在差異，且對污染物脅迫的響應并不同步，因此，采用單一生物標志物評價污染物毒性效應存在一定局限性[5]。整合生物標志物響應指數（integrated biomarker response, IBR）可將不同生物標志物進行綜合分析，能更有效地評價水環境的毒性作用[6]，已被廣泛應用于工業污染對魚類毒性效應評估的研究[7-9]，但關于采用IBR綜合評估磷化工區水環境污染對魚類毒性影響的研究未見報道。

基于此，本研究以某磷化工廠周邊溪流水體為研究對象，以斑馬魚為受試生物，探討在該溪流水體不同暴露時間下斑馬魚肝臟、鰓組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、過氧化物酶（peroxidase, POD）活性及丙二醛（malondialdehyde, MDA）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）含量變化情況，并運用IBR模型綜合評價該溪流水體對斑馬魚的毒性效應，以期為區域水環境污染及風險評估提供理論依據。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗生物及其馴養

斑馬魚購于貴陽某花鳥市場，體長為（2±1） cm，體質量為（0.3±0.1） g。將斑馬魚置于玻璃水族箱中馴養14 d，馴養期間斑馬魚死亡率低于5%。馴養與實驗各項條件保持一致，用水均為充分曝氣的自來水，pH值7±0.5，溫度（23±1） ℃，溶解氧（DO）≥4 mg·L-1；光暗周期為t（光）∶t（暗）=12 h∶12 h；每天早晚喂食2次，及時清除糞便及食物殘渣。馴養結束后隨機挑選身體健壯、反應靈敏、大小基本一致且無明顯疾病和畸形的斑馬魚用于實驗。

1.1.2 儀器與試劑

多功能酶標儀（Multiskan GO，美國Thermo Scientific公司）；微量高速冷凍型離心機（Z216MK，德國HERMLE Labortechnik GmbH公司）；超聲細胞破碎儀（JXFSTPRP-64，上海凈信實業發展有限公司，中國）考馬斯亮藍總蛋白（TP）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、過氧化物酶（POD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒和谷胱甘肽（GSH）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 水樣暴露實驗

實驗分為空白對照組（充分曝氣的自來水）和處理組（4 ℃保存的磷化工區溪流原水樣），每組隨機放入馴養后斑馬魚60尾，每組設3個平行。選用體積為10 L的玻璃魚缸，每個魚缸溶液總體積為8 L。試驗期間24 h連續曝氣，水溫為22～24 ℃。每24 h更換試驗液1次，每天早晚喂食2次。

1.2.2 樣品的制備

實驗開始后，分別于7、14、21和28 d在每組隨機選取數尾魚冷凍麻醉后進行解剖，迅速取出肝臟和鰓并去除表面附帶的結締組織，在4 ℃生理鹽水中漂洗干凈，用濾紙拭干表面水分，稱取約0.1 g組織樣品，按1∶9質量體積比（m∶V）加入預冷生理鹽水作為勻漿介質，在冰水浴條件下，用勻漿器制成10%組織勻漿液。在4 ℃、2 500 r·min-1下離心10 min，取上清液用于酶活性測定。

1.2.3 生化指標的測定

SOD通過黃嚷吟及黃嚷吟氧化酶反應產生超氧陰離子自由基，后者與胺鹽可形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，在450 nm處可測定其吸光度值。SOD酶活性單位為U·mg-1protein。

CAT分解H2O2的反應可通過鉬酸銨而中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產生淡黃色的絡合物，可在405 nm處測定其生成量，由此計算H2O2的反應量，計算CAT活性。CAT酶活性單位為U·mg-1protein。

POD通過催化H2O2的反應，測定420 nm處吸光度的變化得出其酶活性。POD酶活性單位為U·mg-1protein。

MDA與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成紅棕色產物，在532 nm處有最大吸收峰，可測定此波長處吸光度值，計算得出MDA含量。MDA含量單位為nmol·mg-1protein。

GSH利用二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應時能產生一種黃色化合物，在420 nm處通過比色定量測定其吸光度值，計算得出GSH含量。GSH含量單位為mg·g-1protein。

測試步驟嚴格按照各試劑盒說明書進行。試驗中每組每個指標測定設3個重復。

1.3 IBR指數評價

根據污染脅迫后該標志物的生物活性是否被激活，若是，令Z=Y，反之，令Z=-Y。|Xmin|表示每個時間點中該標志物均一化數據最小值的絕對值。每個時間點的生物標志物得分（S）計算公式為S=Z+|Xmin|。

繪制星狀圖，計算其面積：星狀圖中各輻射線的長度即為每個指標的Si值，每一組別的IBR為所構成星狀圖面積（即圖中由相鄰指標的輻射線所構成的三角形面積（Ai）之和），計算見式（1）～（3）：

（1）

（2）

（3）

式中：n為所選用的生物標志物總數，?為相鄰兩輻射線的夾角，?=2π/n，Sn+1=S1。

1.4 數據處理與分析

應用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。若數據服從正態分布，采用獨立樣本T檢驗對處理組和對照組進行差異分析，反之，采用非參數檢驗進行分析，P<0.05、P<0.01表明差異顯著。采用Origin 8.0軟件進行圖形繪制。

2 結果（Results）

2.1 溪流水體對斑馬魚肝臟、鰓SOD活性的影響

如圖1所示，斑馬魚暴露7 d時，與對照組相比，處理組肝臟SOD活性顯著升高（P<0.01），此時肝臟SOD活性達最大，是對照組的1.26倍，隨著暴露時間的持續，肝臟SOD活性的上調作用有所緩解。鰓SOD活性變化趨勢與肝臟相似，與對照組相比，在第7天時處理組鰓SOD活性顯著升高（P<0.01），是對照組的1.72倍，隨著暴露時間的延長，鰓SOD活性的上調作用有所緩解。

2.2 溪流水體對斑馬魚肝臟、鰓CAT活性的影響

如圖2所示，斑馬魚暴露7 d時，與對照組相比，處理組肝臟CAT活性顯著升高（P<0.01），此時肝臟CAT活性達最大，是對照組的1.82倍，隨著暴露時間的持續，肝臟CAT活性的促進效應有所降低，但仍高于對照組水平（P<0.01）。鰓CAT活性變化趨勢與肝臟較為相似，與對照組相比，在第7天時處理組鰓CAT活性顯著升高（P<0.01），是對照組的2.67倍，隨著暴露時間的延長，鰓CAT活性的促進效應有所降低，但仍高于對照組水平（P<0.05）。

2.3 溪流水體對斑馬魚肝臟、鰓POD活性的影響

如圖3所示，斑馬魚暴露7 d后，與對照組相比，處理組肝臟POD活性升高，但差異不顯著（P>0.05）；隨著暴露時間的持續，肝臟POD活性的促進效應有所降低，在第28天時處理組肝臟POD活性較對照組顯著性降低（P<0.05），此時，POD活性水平下降至對照組的26.92%。鰓POD活性變化趨勢與肝臟較為相似，與對照組相比，在第7天時處理組鰓POD活性顯著升高（P<0.01），是對照組的2.17倍，隨著暴露時間的延長，鰓POD活性的促進效應有所降低，但仍高于對照組水平（P<0.01）。

圖1 斑馬魚肝臟（a）、鰓（b）超氧化物歧化酶（SOD）活性變化情況注：與對照組相比（*P<0.05，**P<0.01）。Fig. 1 Changes of superoxide dismutase （SOD） activity in liver （a） and gill （b） of zebrafishNote: Compare with the control （*P<0.05, **P<0.01）.

圖2 斑馬魚肝臟（a）、鰓（b）過氧化氫酶（CAT）活性變化情況注：與對照組相比（*P<0.05，**P<0.01）。Fig. 2 Changes of catalase （CAT） activity in liver （a） and gill （b） of zebrafishNote: Compare with the control （*P<0.05, **P<0.01）.

2.4 溪流水體對斑馬魚肝臟、鰓MDA含量的影響

如圖4所示，暴露7 d后，與對照組相比，處理組肝臟MDA含量出現顯著性降低（P<0.05），此時，MDA含量水平下降至對照組的16.43%，隨著暴露時間的持續，肝臟MDA含量逐漸恢復到對照組水平。暴露7 d后，與對照組相比，處理組鰓MDA含量顯著升高（P<0.05），此時鰓中MDA含量達最大，是對照組的1.26倍，隨著暴露時間的延長，鰓中MDA含量逐漸呈現降低趨勢。

2.5 溪流水體對斑馬魚肝臟、鰓GSH含量的影響

如圖5所示，暴露7 d后，與對照組相比，處理組肝臟GSH含量無顯著變化（P>0.05），隨著暴露時間的持續，GSH含量出現一定降低，直到第28天有所回升，但仍低于對照組水平（P<0.05）。暴露7 d后，與對照組相比，處理組鰓GSH含量顯著升高（P<0.01），是對照組的1.93倍，隨著暴露時間的延長，GSH含量逐漸下降，直到第28天時顯著低于對照組水平（P<0.05），此時，GSH含量水平下降至對照組的23.62%。

圖3 斑馬魚肝臟（a）、鰓（b）過氧化物酶（POD）活性的變化注：與對照組相比（*P<0.05，**P<0.01）。Fig. 3 Changes of peroxidase （POD） activity in liver （a） and gill （b） of zebrafishNote: Compare with the control （*P<0.05, **P<0.01）.

圖4 斑馬魚肝臟（a）、鰓（b）丙二醛（MDA）含量的變化注：與對照組相比（*P<0.05，**P<0.01）。Fig. 4 Changes of malondialdehyde （MDA） content in liver （a） and gill （b） of zebrafishNote: Compare with the control （*P<0.05, **P<0.01）.

2.6 IBR指數

在溪流水體脅迫下，不同暴露時間點的斑馬魚肝臟、鰓的IBR分析結果如圖6和圖7所示。星狀圖中5個方向軸分別代表5種生物標志物（SOD、CAT、POD、MDA和GSH），該5種生物標志物的響應所構成的星狀圖面積即為IBR值。星狀圖面積越大，表明污染物對生物體的毒性效應越大。在不同暴露時間，處理組肝臟、鰓組織中5種生物標志物受到誘導或抑制。結合IBR模型分析可見：與對照組相比，處理組肝臟組織在7 d和14 d時星狀圖覆蓋面積更大，鰓組織在7 d和28 d時星狀圖覆蓋面積更大，提示溪流水體不同時間脅迫對肝臟、鰓組織產生的毒性存在差異，表明在磷化工區溪流水體脅迫下，不同時間點斑馬魚肝臟、鰓對外界刺激產生防御應激的敏感性不同。

圖5 斑馬魚肝臟（a）、鰓（b）谷胱甘肽（GSH）含量的變化注：與對照組相比（*P<0.05，**P<0.01）。Fig. 5 Changes of glutathione （GSH） content in liver （a） and gill （b） of zebrafishNote: Compare with the control （*P<0.05, **P<0.01）.

圖6 溪流水體脅迫下斑馬魚肝臟整合生物標志物響應指數（IBR）星狀圖Fig. 6 Integrated biomarker response （IBR） index of zebrafish liver under stream water stress

圖7 溪流水體脅迫下斑馬魚鰓IBR星狀圖Fig. 7 IBR of zebrafish gill under stream water stress

從時間-效應分析（圖8）可知，與對照組相比，處理組斑馬魚肝臟組織IBR值總體呈現先升高后降低的變化趨勢，在7 d時達到峰值，為14.76；處理組鰓組織IBR值總體呈現先降低后升高的變化趨勢，在7 d時達到峰值，為13.82，表明當磷化工區溪流水體脅迫至7 d時，對斑馬魚肝臟、鰓組織的毒性作用最強。就不同組織來看（圖9），磷化工區溪流水體對5種生物標志物的影響具有組織器官特異性，處理組肝臟IBR值為33.98，鰓IBR值為30.6，表現為肝臟>鰓，表明磷化工區溪流水體對斑馬魚肝臟產生的影響大于鰓。

3 討論（Discussion）

圖8 溪流水體脅迫下斑馬魚肝臟（a）和鰓（b）的IBR隨時間的變化Fig. 8 Changes of IBR with time in the liver （a） and gill （b） of zebrafish under stream water stress

圖9 溪流水體不同脅迫時間下處理組斑馬魚肝臟和鰓的IBRFig. 9 The IBR value in the liver and gill of zebrafish under stream water stress after different time

CAT可促使SOD歧化產生的H2O2進一步分解為O2和H2O，阻止·OH的生成，是使生物體內細胞免受H2O2毒害的一類抗氧化酶[18]。本研究中，處理組斑馬魚肝臟、鰓組織CAT活性呈現先顯著性升高后降低的趨勢，符合Stebbing[19]提出的“毒物興奮效應”，即短暫的溪流水體脅迫后，刺激了機體的抗氧化系統，使其發揮功能從而清除體內的H2O2，但隨著脅迫時間的延長，生物體內蓄積污染物增多，抗氧化系統受到損傷，CAT活性的促進效應有所降低[20-21]。

POD通常以同功酶的形式參與機體的抗氧化防御作用，其能催化H2O2與氫供給體之間的氧化反應，從而分解有毒物質H2O2，具有比CAT更高的H2O2親和力，是提高機體免疫解毒能力的重要因子[22]。本研究結果顯示，肝臟、鰓組織中POD活性整體呈現先升高后降低的變化趨勢，與王慶偉[23]研究重金屬及三苯基錫（TPT）、五氯酚（PCP）對斑馬魚POD活性影響趨勢一致。有研究表明，在生物體受到輕度污染脅迫時，會誘導POD活性升高來抵御外界刺激，但在污染脅迫超過生物體抵御能力，POD活性會受到抑制[24]。本研究中，斑馬魚體內污染物的蓄積量隨著在磷化工區溪流水中暴露時間的延長而增加。因此，隨著斑馬魚體內污染物含量的增加，POD活性表現為先升高后降低的趨勢。

MDA是脂質過氧化作用最終代謝產物之一，可導致細胞凋亡甚至損害器官功能。生物體內MDA含量可反映機體內脂質過氧化的程度，是細胞膜系統受損傷的指標之一[25]。本研究結果顯示，在磷化工區溪流水體暴露早期，與對照組相比，斑馬魚鰓中MDA含量顯著升高，而肝臟MDA含量顯著降低，其可能是由于肝臟作為解毒器官，響應更加迅速，在暴露早期，抗氧化系統其他組分增強對ROS的清除能力，未明顯造成肝臟組織脂質過氧化程度加深[26-27]。

GSH是生物體內廣泛存在的一種過氧化物分解酶，是重要的ROS清除劑，其含量變化與酶類抗氧化劑的活性緊密相關。在生物體受到污染物脅迫時，GSH活性與抗氧化酶一樣，可呈現出誘導或抑制現象[28]。本研究中，肝臟、鰓組織中GSH變化趨勢與MDA類似，這可能除與肝臟的解毒作用有關外，另一方面可能因為GSH可同時與谷胱甘肽轉移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等其他抗氧化酶相互協調共同調控機體氧化應激狀態[29-30]，當鰓組織中利用GSH作為還原性底物來清除H2O2的抗氧化活性被顯著抑制時，GSH消耗量減少。這與余曉玲[31]的研究結果一致。

外源污染物脅迫對各種酶活性抑制或誘導效應表現不一，且不同酶對污染物刺激的敏感程度存在差異，時間響應不同步。若僅考慮單一酶活性，尚不能很好地定量評價其毒性效應。IBR模型可將不同生物指標的聯合生物效應進行量化，通過將各種酶以及其他生物標志物結合分析，能較準確客觀地評估水環境的毒性作用[17]，從而彌補單一酶活性不能定量直觀評價等缺點[5,15]，已被廣泛應用于定量評價污染脅迫對生物的綜合影響研究中[7, 32]。本研究采用IBR模型評價方法對斑馬魚肝臟和鰓組織中SOD、CAT、POD、MDA和GSH 5個指標進行整合分析，發現在磷化工區溪流水體脅迫下，斑馬魚肝臟、鰓組織產生了明顯的應激響應，且斑馬魚不同組織在不同暴露時間對該水體的毒性響應存在差異。就整體的時間效應來看，肝臟組織、鰓組織IBR指數峰值均出現在第7天，說明抗氧化系統相關酶類和小分子是較為敏感的生物標志物，后期大部分生物標志物活性逐漸恢復或接近對照水平，IBR指數出現一定幅度的下降。這一趨勢與蔣玫等[4]利用IBR模型評價0號柴油對黑鯛的毒性效應中IBR值變化規律一致。就不同組織來看，總體上IBR值表現為肝臟大于鰓，說明磷化工區溪流水體對肝臟的影響更大，這可能是由于與鰓組織相比，肝臟組織是生物體受到污染時的主要解毒和代謝器官，也是有毒有害物質的首要靶器官[33]。綜上可見，斑馬魚體內SOD、CAT、POD、MDA和GSH等氧化應激生物標志物在磷化工區溪流水體脅迫下出現應答，表明磷化工區溪流水體具有一定生物毒性，磷化工污染的水生生態風險應受到關注。