還原響應性肝靶向聚合物膠束的制備及其載藥性能

馮薈如， 劉艷勤， 董 營， 于香香， 鞏 凱

（江南大學生命科學與健康工程學院, 江蘇 無錫 214122）

原發性肝癌，是全球癌癥相關死亡的第二大原因，肝細胞癌是其主要類型[1]。由于肝癌的潛伏期較長，并且大多數患者被發現時已經處于晚期或者中晚期，這給肝癌的治療帶來了極大挑戰。通常情況下，化療成為了必然選項[2]。然而，化療藥物常常在殺死腫瘤細胞的同時損害健康細胞，產生很大的毒副作用[3,4]。因此，肝癌靶向與個性化治療極具研究意義。肝癌組織細胞中含有豐富的去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR），而它在正常組織中表達較少，根據這一特性，可目標導向地設計肝靶向藥物遞送系統[5,6]。其中，半乳糖是良好的肝靶向分子，可作為靶向頭功能化修飾藥物遞送系統，有效地與肝癌細胞上的受體進行特異性結合，進而實現對肝癌的靶向治療。

近年來，納米藥物遞送系統成為研究熱點，尤其是在癌癥診斷和治療領域展現出巨大的應用潛力和前景[7]。納米藥物遞送系統有納米脂質體、納米聚合膠束、納米微球等，有效地改善了難溶性藥物的溶解性、穩定性和生物利用度等性能[8,9]。然而，對于腫瘤的治療，納米藥物遞送系統仍有巨大的改進空間。腫瘤組織通常表現出弱酸性、強還原性、酶過度表達等特征[10,11]，基于這一特性，可設計微環境響應性的智能納米藥物遞送系統，以期實現藥物可控釋放的目的，進一步提升抗腫瘤藥物的治療效果和降低化療副作用[12,13]。聚合物膠束粒徑小且分布窄，不易被網狀內皮系統吞噬，且能夠透過血管選擇性蓄積在腫瘤組織部位，起到被動靶向的作用[14]。因此，聚合物膠束作為藥物傳遞載體，在腫瘤的治療方面前景廣闊[15]。

本文旨在構建一種還原敏感型肝靶向聚合物膠束。首先以半乳糖為靶向分子，制備了主體分子半乳糖-β-環糊精（Gal7-CD）；然后以胱胺二鹽酸鹽、十八烷酸、金剛烷甲酸、雙端氨基聚乙二醇等為原料，設計合成了客體分子金剛烷基聚乙二醇胺十八酰胺（Ad-PEG1000-SS-C18）；最后Gal7-CD與Ad-PEG1000-SS-C18經主客體自組裝形成了兩親性聚合物，進而制備了具有還原敏感性的肝靶向聚合物膠束半乳糖-胱胺-十八酰胺（Gal7-SSC18）。在此基礎上，以阿霉素（DOX）為模型藥物，系統研究了載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX的載藥性能與體外釋放行為；同時以肝癌細胞（HepG2）和正常組織細胞（HEK-293）為細胞模型，深入探討了聚合物膠束的細胞毒性、載藥聚合物膠束對HepG2的抑制性能和細胞攝取機制。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

雙端氨基聚乙二醇（NH2-PEG-NH2，Mn=1 000）、十八烷酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；七（6-疊氮-6-脫氧）-β-環糊精、3-炔基丁基-β-D-半乳糖苷、金剛烷甲酸活性酯、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、N, N-二異丙基乙胺（DIEA）、胱胺二鹽酸鹽、二硫蘇糖醇（DTT）、N, N-二甲基甲酰胺（DMF）：分析純，上海畢得醫藥科技股份有限公司；DMEM培養基與RPMI-1640培養基（其中含體積分數10%的胎牛血清（FBS）、100 IU/mL的青霉素及100 μg/mL的鏈霉素）：大連美侖生物技術有限公司；MTT、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胰酶：美國Sigma公司；FBS：上海雙洳生物科技有限公司；HepG2、HEK-293：中國科學院典型生物保藏中心細胞庫。

1.2 測試與表征

采用核磁共振氫譜（1H-NMR，美國Bruker公司Avance Ⅲ 400 MHz型）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR，德國布魯克公司TENSOR Ⅱ型）表征化合物的化學結構；用納米粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司Zetasizer Nano ZS型）檢測聚合物膠束的粒徑和粒徑多分散指數（PDI）；使用熒光分光光度計（日本島津有限公司RF-6000）測定臨界膠束濃度；激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM，德國Leica公司TCSSP8型）用于細胞成像。

1.3 聚合物Ad-PEG1000-SS-C18的合成

1.3.1 化合物金剛烷基聚乙二醇胺丁二酸（Ad-PEG1000-COOH）的合成 將金剛烷甲酸活性酯（14 mg）溶于二氯甲烷（3 mL），將其緩慢滴加到裝有NH2-PEG-NH2（150 mg）的二氯甲烷（5 mL）溶液的圓底燒瓶中，室溫下反應12 h。反應結束后，經柱層析純化得到化合物金剛烷基聚乙二醇胺（Ad-PEG1000-NH2）。在干燥的圓底燒瓶中加入化合物Ad-PEG1000-NH2（150 mg）和四氫呋喃（3 mL），向其中分別滴加丁二酸酐（15 mg）的四氫呋喃（3 mL）溶液、三乙胺（0.26 mL），于室溫下反應4 h。反應結束后，用鹽酸溶液（1 mol/L）調節pH至4～5，用去離子水（10 mL）洗滌，二氯甲烷（10 mL）萃取水相，合并有機相，真空濃縮得到粗產物；再經柱層析得到Ad-PEG1000-COOH，產率為70%。

1.3.2 聚合物Ad-PEG1000-SS-C18的合成 首先，根據文獻[16]以胱胺二鹽酸鹽、十八烷酸為原料，經氨基保護、?；磻?、脫保護等步驟，得到胱胺基十八酰胺（NH2-SS-SA）；然后，向干燥的圓底燒瓶中加入Ad-PEG1000-COOH（300 mg）、HBTU（114.72 mg）、DIEA（134.43 mg）和DMF（3 mL），于室溫下攪拌反應30 min；然后，滴加NH2-SS-SA（156 mg）的DMF（2 mL）溶液，于室溫下反應24 h；反應結束后，加入去離子水（50 mL），用二氯甲烷（50 mL）萃取2次；合并有機相，用無水硫酸鈉干燥過夜；經過濾、真空濃縮得到粗產物；經柱層析純化得到Ad-PEG1000-SS-C18，產率67%。圖1所示為Ad-PEG1000-SS-C18的合成路線。

圖 1 Ad-PEG1000-SS-C18的合成路線Fig. 1 Synthetic routes of Ad-PEG1000-SS-C18

1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 3.75～3.56 (m, 72 H, OCH2CH2O), 3.54 (dd,J=10.1, 5.5 Hz, 4 H, OCH2CH2NH),3.48 (t,J=6.9 Hz, 4 H, NHCH2CH2SS), 3.36 (dd,J=10.5, 5.5 Hz, 4 H, NHCH2,CH2O), 2.83 (t,J=6.0 Hz, 4 H,CH2SSCH2), 2.49 (s, 4 H, CO(CH2)2CO), 2.20 (t,J=7.5 Hz, 2 H, COCH2(CH2)16), 2.03 (s, 4 H, CCH2CH), 1.87 (d,J=2.7 Hz, 5 H, CCH2CH, CH2CHCH2), 1.77 (q,J=12.4 Hz, 6 H, CHCH2CH), 1.61 (s, 2 H，CH2CH2(CH2)14), 1.29 (s,28 H, (CH2)14), 0.91 (t,J=6.9 Hz, CH3)。

1.4 Gal7-CD的合成

向圓底燒瓶中分別加入七（6-疊氮-6-脫氧）-β-環糊精（500 mg）、3-炔基丁基-β-D-半乳糖苷（665 mg）、DMF（2.5 mL）。再稱取硫酸銅（95.5 mg）、抗壞血酸鈉（155.1 mg）溶于去離子水（2.5 mL）中，滴加至前述溶液中，于60 ℃下反應72 h。反應結束后，過濾除去不溶性固體，濾液經真空濃縮，殘留物加去離子水復溶，用甲醇沉降后得到粗產物，經氧化鋁層析柱純化，得到Gal7-CD，收率為71%。圖2為Gal7-CD的合成路線。

圖 2 Gal7-CD的合成路線Fig. 2 Synthetic route of Gal7-CD

圖 3 Gal7-SS-C18-DOX的制備與藥物釋放示意圖Fig. 3 Schematic representation of formation and drug release of Gal7-SS-C18-DOX

1H-NMR (400 MHz, D2O)δ: 8.03 (s, 7 H, i), 5.19 (s, 7 H, 1), 4.66～4.55 (m, 7 H, f), 4.31 (s, 14 H, g), 4.20 (s,14 H, 6), 3.99 (s, 7 H, e), 3.94～3.51 (m, 56 H, a, b, c, d, 2, 3, 5), 3.44 (s, 7 H, 4), 2.92 (s, 14 H, h)。

1.5 聚合物膠束Gal7-SS-C18和載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX的制備與表征

采用透析法制備聚合物膠束：將Ad-PEG1000-SS-C18（19 mg）和Gal7-CD（33 mg）分別溶解于DMF（2 mL）中，在室溫下攪拌4 h，然后緩慢加入去離子水（8 mL），繼續攪拌24 h；然后，將反應液裝入透析袋（截留分子量3 500）中，透析3 d，經0.45 μm水系膜過濾，即可得到Gal7-SS-C18溶液；透析液經冷凍干燥，得到Gal7-SS-C18粉末。

臨界膠束濃度（CMC）：首先，稱取Gal7-SS-C18，用去離子水配制質量濃度為1×10-4～2 mg/mL的膠束溶液；然后，避光條件下，精密稱取一定量芘，加入一定量的丙酮配制濃度為6×10-5mol/L的母液；最后，取30 μL母液至棕色試劑瓶中，N2吹干丙酮，向試劑瓶中分別加入3 mL不同濃度的膠束溶液，室溫條件下，避光保存過夜。分別測定載有熒光探針芘的膠束溶液的激發光譜。通過測定373 nm和384 nm處的熒光強度比值（I384/I373）確定載體的CMC。

聚合物膠束的還原響應性考察：將制備好的1 mg/mL的聚合物膠束水溶液取2 mL在PBS的還原環境下（10 mmol/L DTT）和不含DTT的環境下37 ℃溫育12 h，取出混合液經振蕩均勻后分別加入樣品比色皿中，用納米粒度儀測試納米膠束的粒徑。

Gal7-SS-C18-DOX制備示意圖如圖3所示。首先，向干燥的圓底燒瓶中加入Ad-PEG1000-SS-C18（30 mg）、Gal7-CD（52.05 mg）、DMF（6 mL），緩慢滴加脫鹽DOX的DMF溶液（1 mg/mL，8 mL），室溫攪拌4 h；然后，緩慢滴加去離子水（12 mL），繼續攪拌24 h；然后，將反應液裝入透析袋（截留分子量3 500），透析3 d得到載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX溶液；透析液經冷凍干燥，獲得Gal7-SS-C18-DOX粉末。

圖 4 Ad-PEG1000-SS-C18和Gal7-SS-C18的1H-NMR圖譜Fig. 4 1H-NMR spectra of Ad-PEG1000-SS-C18 and Gal7-SS-C18

作為對照，采用同樣的方法制備去除靶向分子半乳糖的對照組載藥聚合物膠束CD-SS-C18-DOX。

載藥聚合物膠束的載藥量測定：采用紫外-可見分光光度計法，測量480 nm處的總DOX和游離DOX的吸光度值，計算載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX的載藥量和包封率。

1.6 載藥聚合物膠束的體外藥物釋放行為

分別精確量取2 mL負載DOX的聚合物膠束溶液（1 mg/mL）加入2個密封的透析袋（截留分子量3 500）中，分別放置于DTT濃度為0、10 mmol/L的PBS（20 mL，pH=7.4）中，每組設置3個平行實驗；在37 ℃，100 r/min的搖床中振蕩，分別在預定時間每次取出2 mL溫育的溶液，然后添加2 mL含有相應DTT濃度的新鮮PBS溶液。利用紫外-可見分光光度計測定取樣樣品的紫外吸光度，計算累積釋放率。

1.7 體外細胞實驗

1.7.1 細胞毒性實驗 以HepG2和HEK-293為模型，研究了膠束的細胞毒性。首先將HepG2以每孔2.0×104個的細胞密度鋪于96孔板中， HEK-293以每孔1.5×104個的細胞密度鋪于96孔板中，在37 ℃、體積分數5%的CO2下培養12 h使其貼壁生長；然后加入100 μL聚合物膠束（1.25～20 μg/mL）、載藥聚合物膠束（0.156～10 μg/mL）及游離DOX（0.156～10 μg/mL）來替代原培養液，同時設置陰性對照，繼續孵育24 h；接下來除去培養液并加入等體積的MTT溶液，繼續孵育4 h后吸出MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜（100 μL），用酶標儀于570 nm處測定吸光度，并計算細胞存活率和半抑制濃度（IC50）。

1.7.2 細胞攝取實驗 將HepG2和HEK-293以每孔8×105個的細胞密度接種于6孔板中，培養24 h；然后加入2 mL含游離DOX和載藥聚合物膠束溶液（DOX的質量濃度為5 μg/mL）的培養基中繼續孵育1 h或4 h后，移除培養基后用PBS洗3遍；然后用胰蛋白酶消化所有細胞，離心收集細胞；最后用PBS吹散細胞，利用流式細胞儀檢測細胞攝取情況。

取對數生長期的HepG2和HEK-293接種于激光共聚焦皿（（每個皿含有8×104個細胞））培養24 h；除去培養液，每孔加入2 mL游離DOX和載藥膠束溶液（DOX的質量濃度為5 μg/mL）培養1、4 h后除去培養液，PBS洗滌細胞3次后加入400 μL DAPI染色30 min，PBS洗滌3次，加入400 μL多聚甲醛（4 g/mL）固定細胞20 min，用PBS洗掉表面的多聚甲醛，最后加入500 μL PBS，用CLSM進行觀察。

2 結果與討論

2.1 聚合物Ad-PEG1000-SS-C18和Gal7-SS-C18的合成與表征

圖4為Ad-PEG1000-SS-C18和Gal7-SS-C18的1H-NMR譜圖。由圖可知，Ad-PEG1000-SS-C18的1H-NMR圖譜中，化學位移0.88～0.93處的峰為十八烷基的甲基特征峰，1.77～2.03的峰為金剛烷基的氫特征峰，2.83處的峰為二硫鍵鄰位亞甲基的特征峰；與Ad-PEG1000-SSC18相比，Gal7-SS-C18的1H-NMR圖譜中不僅包含了Ad-PEG1000-SS-C18的特征峰，還出現一些新的特征峰，7.18～8.06處的峰為Gal7-CD中的三唑基團的氫特征峰，5.9處的峰為半乳糖的C2氫特征峰，4.0～6.1處的峰為環糊精和半乳糖的氫基團的氫特征峰。由此可見，Gal7-SS-C18是由Gal7-CD和Ad-PEG1000-SS-C18兩部分組成。

Ad-PEG1000-SS-C18和聚合物Gal7-SS-C18的FTIR譜圖如圖5所示。由圖可知，在Gal7-CD的FTIR譜圖中，3 391 cm-1和1 045 cm-1處出現了環糊精上的羥基特征峰；Ad-PEG1000-SS-C18的FT-IR譜圖中，3 300、1 632、1 542 cm-1處分別出現了NH-的伸縮振動峰、酰胺的C=O伸縮振動峰、酰胺的C-N伸縮振動峰，2 916、2 850 cm-1處出現了十八烷基的亞甲基的C-H伸縮振動峰；而Gal7-SS-C18含有Gal7-CD和Ad-PEG1000-SS-C18的所有特征峰（部分有重疊），分析表明本文成功合成了Gal7-SS-C18。

圖 5 樣品的FT-IR圖譜Fig. 5 FT-IR spectra of samples

2.2 聚合物膠束和載藥聚合物膠束的制備與表征

聚合物Gal7-SS-C18的CMC值如圖6（a）所示，其CMC值為0.006 mg/mL，表明Gal7-SS-C18在較低的質量濃度下可形成膠束，且可以保持良好的穩定性，具備成為載藥聚合物膠束的潛質。

圖 6 (a) 聚合物膠束lg ρ與I384/I373的關系；(b) 聚合物膠束和載藥聚合物膠束的粒徑分布圖；(c)聚合物膠束的粒徑變化；(d) 載藥聚合物膠束的體外藥物釋放曲線Fig. 6 (a) Relationship between lg ρ and I384/I373 of polymer micelles; (b) Particle size distributions of polymer micelles and drug-loaded polymer micelles; (c) Particle size changes of polymer micelles; (d) in vitro drug release profiles of drug-loaded micelles

聚合物膠束以及載藥聚合物膠束的粒徑如圖6（b）所示。由圖可知，聚合物膠束的平均粒徑為（169.2±1.3）nm，PDI=0.294；載藥聚合物膠束的平均粒徑為（177.9±3.0）nm，PDI=0.123，DOX裝入聚合物膠束的內核，致使其粒徑略有增大。

聚合物膠束Gal7-SS-C18的還原響應性如圖6（c）所示。由圖可知，在DTT存在的情況下，聚合物膠束的粒徑隨時間延長而逐漸變大，12 h后，部分膠束發生分解，這說明了在DTT存在條件下，聚合物中二硫鍵發生斷裂，致使兩親性聚合物結構分解，從而使聚合物膠束分解，證明了聚合物膠束Gal7-SS-C18具有明顯的還原響應特性。

Gal7-SS-C18-DOX的體外釋放性能結果表明，載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX的包封率為（71.1±0.5）%，載藥量為（21.2±0.7）%。由圖6（d）可知，在正常微環境體系中，Gal7-SS-C18-DOX呈緩慢釋放趨勢，48 h累積釋放量僅為33.10%；而在還原性環境下，Gal7-SS-C18-DOX藥物釋放較快，在8 h時，藥物釋放量達到80%以上，進一步證明了載藥聚合物膠束的還原響應特性。在DTT存在條件下，二硫鍵斷裂，致使聚合物膠束分解，從而加快DOX釋放與提高藥物累積釋放量。

2.3 細胞毒性研究

聚合物膠束的細胞毒性實驗結果如圖7（a）所示。當聚合物膠束質量濃度為1.25～20 μg/mL時，HepG2和HEK-293的存活率均在80%以上，這說明聚合物膠束的生物相容性良好。

載藥聚合物膠束對HepG2和HEK-293體外的殺傷性能實驗結果如圖7（b，c）所示。由圖可知，對于HEK-293來說，Gal7-SS-C18-DOX膠束、CD-SS-C18-DOX膠束和游離DOX對細胞的存活率表現出一定的濃度依賴性，Gal7-SS-C18-DOX膠束和CD-SS-C18-DOX膠束對其產生的細胞毒性無明顯差異，但相比于游離DOX明顯較低，其可能的原因是聚合物膠束不易穿過細胞膜被細胞攝取，或者即使被細胞攝取了，但其相對穩定，DOX未得到有效釋放而降低了細胞毒性；對于HepG2來說，與游離DOX相比，Gal7-SS-C18-DOX膠束對細胞的毒性略強，IC50=（3.7±0.25）μg/mL，而對照組CD-SS-C18-DOX膠束對細胞的毒性明顯較低。這是由于HepG2細胞表面的ASGPR受體會促進Gal7-SS-C18-DOX膠束的跨膜穿透，有利于細胞攝??；同時由于HepG2內的谷胱甘肽濃度較高，加快了Gal7-SS-C18-DOX膠束的分解，進而使其包載的DOX有效釋放，從而殺死癌細胞。而對照組CD-SS-C18-DOX膠束不含能與ASGPR受體結合的半乳糖分子，細胞對其攝取量較低，所以其對HepG2的細胞毒性較低。

圖 7 (a) 聚合物膠束對HepG2和HEK-293的體外毒性；載藥聚合物膠束對(b) HepG2和(c) HEK-293的體外毒性Fig. 7 (a) in vitro toxicity of polymer micelles to HepG2 cells and HEK-293 cells; in vitro toxicity of drug-loaded polymer micelles to(b) HepG2 cells and (c) HEK-293 cells

2.4 細胞攝取研究

細胞對載藥聚合物膠束和游離DOX的攝取情況如圖8（a，b）所示。由圖可知，兩種細胞對游離DOX和Gal7-SS-C18-DOX膠束的攝取均表現出時間依賴性，在不同孵育時間，HepG2的熒光強度始終比HEK-293的熒光強。對于HepG2來說，在各個時間點，Gal7-SS-C18-DOX膠束與游離DOX相比，顯示出更大的熒光峰移，熒光強度更強；而對于HEK-293來說，Gal7-SS-C18-DOX膠束與游離DOX相比，熒光強度差別不大。

載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX和游離DOX被細胞攝取的情況如圖8（c，d）所示。在1 h時，HepG2中有熒光，表明有DOX進入細胞核；在4 h時，其熒光強度進一步增強，說明Gal7-SS-C18-DOX膠束進一步在細胞核聚集；然而，在HEK-293中，Gal7-SS-C18-DOX膠束沒有拆解入核，僅檢測到微弱的紅色熒光。這是由于HepG2中，載藥膠束通過ASGPR受體進入細胞，入胞更快；而在HEK-293中，紅色熒光雖然有明顯增加，但只有極少量與藍色熒光重疊，這是因為只有微量的Gal7-SS-C18-DOX膠束在正常水平的GSH下拆解，DOX不能被釋放入核，減少了其對正常細胞的毒性。以上結果顯示載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX能較快地進入肝癌細胞的細胞核，并可控釋放DOX，從而有效抑制腫瘤細胞生長。

圖 8 載藥聚合物膠束在(a) HepG2和(b) HEK-293的熒光強度分布圖和平均熒光強度圖；載藥聚合物膠束在 (c) HepG2和(d) HEK-293中的共聚焦掃描顯微鏡圖Fig. 8 Fluorescence intensity distribution and mean fluorescence intensity of drug-loaded polymer micelles in (a) HepG2 cells and (b) HEK-293 cells; CLSM images of drug-loaded polymer micelles in (c) HepG2 cells and (d) HEK-293 cells

3 結 論

（1）載藥聚合物膠束粒徑分布均勻，具有良好的載藥性能和包封率。

（2）聚合物Gal7-SS-C18具有良好的生物相容性；載藥聚合物膠束Gal7-SS-C18-DOX對肝癌細胞表現出良好的殺傷作用，且優于游離DOX對腫瘤的抑制作用，而對正常組織細胞表現出較低的毒性，具有良好的肝靶向性，以及可控釋放性能。