基于生物信息學分析骨質疏松癥與炎癥性腸病的相關性

常裕紳，張子鳴，李振宇，安 娟，何瀚威，匡建軍

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種系統性代謝性骨病，其特點是骨量低、骨微結構被破壞、同時成骨不全增加，容易發生骨折[1]。隨著我國人口老齡化日益嚴重， OP已成為威脅中老年人群的最大健康問題，并且骨質疏松性骨折相關的醫療活動給社會衛生保健系統帶來巨大的經濟負擔。目前對于OP相關疾病的研究主要集中在內分泌、免疫、消化系統領域，其中炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是不容忽視的重要一環。IBD是一種慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎和Crohn病。有報道，IBD患者同時患有OP的概率為18%～42%，IBD骨質疏松患者骨折風險比正常人高1.4倍[2]。因此二者在臨床上包括發病機制、致病因素、易發人群的內在關聯性受到越來越多的關注。有研究顯示，IBD相關OP的發生發展與眾多因素關系密切，最常見的是胃腸道持續慢性感染、腸道菌群失調、鈣和維生素D吸收障礙等[3-4]，然而，其發病機制至今尚未明確，很少有IBD患者能及早接受適當的抗骨質疏松治療。因此本研究通過生物信息學方法分析并闡述OP與IBD的基因相關性，并為相關治療藥物的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1數據收集 從DisGeNET、TTD、GeneCards及OMIM數據庫分別以“Osteoporosis”和“Inflammatory bowel disease”為關鍵詞查詢疾病相關靶點。其中DisGeNET篩選評分≥0.1，GeneCards篩選相關度≥10。整合各數據庫的基因后進行去重，去重后的基因通過R 4.2.0軟件“RSQLite”“BiocManager”包轉換成entrez ID，獲得疾病兩組基因靶點。

1.2蛋白相互作用(PPI)網絡的構建和關鍵基因的篩選 將兩組靶點導入在線網站Venny 2.1.0取交集繪制韋恩圖，得到OP與IBD間的共病靶點，將共病靶點借助string平臺(https://string-db.org/)制作PPI網絡，以最低交互分數0.7篩選，保存.tsv文件，將表格數據導入Cytoscape 3.8.2軟件實現網絡可視化，應用cytoHubba插件中的最大團體中心(MCC)算法，從而獲得調控OP與IBD的關鍵基因。

1.3GO功能及KEGG通路富集分析 將“1.2”中共病靶點通過R軟件的“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包，篩選條件為P<0.05，Q<0.05，進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。

1.4關鍵基因的miRNA基因網絡構建 將獲得的關鍵基因借助網絡分析工具Networkanalyst預測關聯miRNA，并繪制miRNA基因關系網絡。

2 結果

2.1疾病基因搜集 經DisGeNET、TTD、GeneCards及OMIM疾病數據庫檢索，整合各數據庫的重復靶點，獲得與“OP”和“IBD”相關靶點分別為1779和2779個，可見每種疾病的作用靶點龐大，調控機制復雜。

2.2PPI的構建和關鍵基因篩選 通過韋恩圖獲得共病靶點869個(23.6%)，說明OP與IBD間確實存在相似作用機制。依托string數據庫構建PPI網絡圖，以“high confidence(0.700)”為篩選標準得到的網絡圖中具有756個節點，8353條相互作用連線，說明靶點間協同發生諸多調控作用。通過Cytoscape中cytoHubba插件分析PPI網絡，根據MCC算法，認為前10個基因是關鍵基因，以顏色變化代表基因的關鍵程度，分別為IL6、IL10、IL17A、TNF、CSF2、IL4、IL1B、CXCL8、IFNG、IL13。見圖1。

2.3GO功能及KEGG通路富集分析 將共病靶基因導入R軟件，獲得4278項GO富集結果及173條KEGG信號通路。取各富集結果前10個條目以氣泡圖顯示，見圖2。

圖2 OP與IBD共病靶基因GO功能及KEGG通路富集分析氣泡圖

2.4關鍵基因miRNA網絡的構建 Networkanalyst預測關鍵基因關聯的miRNA，通過Cytoscape 3.8.2軟件構建了由83個節點和104條邊組成的基因-miRNA網絡(圖3)。IL6、IL10、CXCL8能與miR-106a-5p和miR-98-5p相互作用，miR-24-3p能與TNF、IL4、IFNG、IL1B基因相互作用，miR-335-5p能與IL6、CXCL8、IL4、IL17A基因相互作用。

圖3 OP與IBD關鍵基因-miRNA網絡

3 討論

OP是一種全身性骨病，破骨細胞骨吸收超過成骨細胞骨形成導致骨量減少是OP發生的關鍵[5]。目前研究發現一些胃腸道疾病與骨質減少關系密切，包括IBD、乳糜瀉和結直腸癌。IBD是OP一大誘發因素，到目前為止，IBD和OP間的相關機制尚不完全清楚。因此，探索IBD和OP的分子機制用于早期識別與干預具有重要的臨床意義。

本研究采用生物信息學方法闡述IBD與OP間分子機制的相關性。PPI網絡分析得到了IL6、IL10、IL17A、TNF、CSF2、IL4、IL1B、CXCL8、IFNG、IL13這10個核心靶點，IBD與炎性因子的關系已有報道，IL6、IL1B、IL17A和TNF-α都是促炎因子，而IFN-γ、IL10、IL4、IL13為抗炎因子，是由巨噬細胞、T淋巴細胞和單核細胞等免疫細胞合成和分泌，單獨或共同參與自身免疫性和炎癥性疾病。

有研究發現，IL6、IL1、IL17、TNF-α和NF-κB在IBD患者腸道黏膜中大量表達，多種促炎因子不斷發生級聯反應，進一步加重腸組織微循環障礙[4]?？筎NF-α制劑現已納入治療IBD的常用藥物。有研究表明，抗TNF-α制劑可以改善IBD患者骨代謝及骨密度[6]。此外，OP患者體內IL1、IL6、TNF-α和IL17水平較正常人群也顯著升高，促炎因子可通過促進NF-κB受體活化因子(RANK)和(或)通過抑制骨保護素(OPG)的表達增強其對NF-κB受體活化因子配體(RANKL)的敏感性[7]，增加破骨細胞活性，促進骨吸收，打破骨代謝平衡來加重OP，而IFN-γ、IL10、IL4等抗炎因子能夠顯著抑制破骨細胞生成，抑制骨吸收[8]。RANK-RANKL-OPG軸是OP的關鍵調節通路，這些細胞因子通過該途徑共同發揮骨吸收和骨形成的作用。ZHANG等[9]研究發現，健脾清腸補腎煎劑可通過抑制結腸黏膜炎癥，促進黏膜愈合，抑制該信號軸的激活達到抗骨質疏松的目的。CSF是集落刺激因子，可促進巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞、腸上皮細胞和樹突細胞的活化[10]，其中粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)可以改善腸黏膜損傷和炎癥反應，調節腸道免疫功能，有研究顯示，缺乏GM-CSF的小鼠更易出現非甾體抗炎藥導致的腸道炎癥反應[11]。同時GM-CSF在破骨細胞生成和發育方面起關鍵作用，可以結合破骨細胞前體上的受體(c-Fms)更有利于破骨細胞的存活與成熟[8]。CXCL8又稱IL8，是一種趨化因子，主要由巨噬細胞、上皮細胞和腫瘤細胞分泌，其可以誘導中性粒細胞隨著腸上皮細胞IL8表達的升高而被吸引到腸黏膜的炎癥部位積聚和活化，加重炎癥反應[12]。IL8在骨代謝方面還具有雙重效應，一方面是通過促進甲狀旁腺激素的生成刺激破骨細胞分化，增加骨吸收，有研究發現絕經后OP患者體內血清IL8水平變化與骨密度呈負相關[13]。另一方面，也有學者認為IL8能夠通過缺氧誘導因子-1α通路促進骨形成從而抑制OP進程[14]。

GO功能和KEGG通路富集分析能夠使共表達基因間的作用關系更加清晰。GO分析主要富集于細胞因子生成的調節、炎性因子的調節和信號傳導受體激活劑活性方面，說明OP與IBD間的關系與免疫和炎癥密切相關，這與大部分研究結果一致。KEGG富集主要與細胞因子-細胞因子受體相互作用、PI3K-Akt、脂質和動脈粥樣硬化、Th17細胞分化等特異性信號通路有關。而這些通路作用途徑不僅參與免疫炎癥過程，而且還與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病有關[15]，這些結果或許能提供一個新觀點:IBD骨質疏松患者也更容易患有心血管疾病。

對核心靶點預測相關miRNA發現，miR-98-5p、miR-335-5p、miR-24-3p和miR-106a-5p可能對于IBD誘發OP的診治具有潛在價值。有研究表明，miR-98-5p通過靶向酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1促進小鼠胚胎成骨細胞前體細胞向成骨細胞分化[16]，同時miR-98-5p的下調能夠增加Trib1蛋白表達改變了巨噬細胞對M2表型的極化，從而緩解了IBD癥狀[17]。而miR-335-5p具有調節小鼠間充質干細胞軟骨分化和促進軟骨生成的能力，同時通過靶向HBP1基因和促進軟骨細胞凋亡來介導骨關節炎的發病[18]。且miR-335-5p調節連接IBD和結腸癌促炎因子的表達，從而作為結腸癌的生物標志物[19]。miR-24-3p可與lncRNA:LEF1-AS1相互作用，通過調節Wnt/β-catenin和TGF-β/BMP途徑來介導成骨[20]。同時miR-24-3p還是2型糖尿病的臨床生物標志物[21]，而諸多研究表明2型糖尿病可能損害骨基質形成和生化能力，從而降低骨骼韌性，引發骨質疏松，增加骨折風險[22-24]。有研究表明，miR-106a-5p通過介導GAS5來控制和維持糖皮質激素敏感性和耐藥性，從而達到抗炎的目的[25]，且miR-106a-5p能夠作為阿爾茲海默癥(AD)與帕金森癥的臨床生物標志物[26]。有學者認為OP與AD作為老年常見疾病有著共通的關系[27]，存在共同致病因素并促進兩病的發展[28-29]。目前研究表明，miR-98-5p、miR-335-5p與OP及IBD有關，證實其能夠影響OP及IBD的發生及發展，或許通過進一步的研究能夠發現這兩種miRNA是改善OP與IBD的藥物或治療手段。而miR-24-3p與miR-106a-5p目前與OP及IBD具有一定的關聯但缺乏強相關性的文獻報道，因此具有潛在的研究價值。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法探討了OP與IBD共病調控的關鍵基因，發現炎癥通路的激活或許是兩病的共同病因，同時篩選了關鍵靶向的4個miRNA可能作為治療IBD和OP的新手段。