一種花生高效復合微生物菌劑及其應用

張俊杰王 楠李 碩彭姍姍尚益民柴帥杰陳錦永陳文峰

(1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,河南 鄭州 450001;2.中國農業科學院鄭州果樹研究所,河南 鄭州 450000;3.中國農業大學根瘤菌研究中心,北京 100193)

花生(ArachishypogaeaL.)屬豆科植物,是我國重要的經濟作物之一,也是河南省第一大油料作物,果實中不僅含有較豐富的蛋白質和油脂,還具有藥用保健價值[1]。河南是我國農業大省,花生種植面積和總產量常年居全國首位。長期以來,高產優質一直是花生生產追求的目標。但在傳統耕作時期,由于無機化肥具有價格低、施用方便和高效等特點,農民種植花生時過度依賴化肥,且施肥方法不科學,使得產區花生的產量、品質大大下降,同時土壤板結、酸化等問題逐漸顯露出來,嚴重制約了我國生態環境的改善[2]。農業可持續發展在我國仍面臨著重大挑戰,減肥增效已成為我國走綠色農業和農業可持續發展道路的必然選擇。

近年來,微生物菌劑在提高農作物產量、抗病蟲害等方面已成為研究熱點。微生物菌劑是通過大量有益微生物的生命活動和新陳代謝產物來改善土壤微生態環境,最終可以達到促進作物生長、減輕作物病害、改善作物產量和品質等目的[3]。在農業可持續發展的背景下,微生物菌劑以低成本來提高作物產量,有助于緩解無機化肥給環境帶來的破壞。大量研究表明,微生物菌劑已在大豆[4]、紫云英[5]、馬鈴薯[6]、玉米[7]等農作物的種植過程中得到應用,能顯著提高農作物的產量及其他生長指標。近年來,人們將根瘤菌和芽孢桿菌作為制作微生物菌劑的常用菌種?；ㄉ鼍赏ㄟ^與花生根系部位共生結瘤,提高植株生物量,從而達到增產目的[8]。芽孢桿菌可以釋放土壤中的鉀素,改善土壤肥力,并通過分泌激素、氨基酸等物質來促進農作物的生長[9]。目前,根瘤菌劑已向多功能的復合菌劑方向發展,將根瘤菌與有益菌株復合接種,更加利于豆科植物進行共生結瘤和生長。劉曄等[10]在華北地區土中篩選出一株產IAA的芽孢桿菌,分泌IAA量高達49.06 mg/m L,能夠顯著促進花生的生長?？诐萚11]研究發現將膠質芽孢桿菌和根瘤菌復合接種紫花苜蓿,顯著提高了紫花苜蓿的產量指標,具有明顯協同作用。馬鳴超等[12]認為復合接種膠質類芽孢桿菌和慢生大豆根瘤菌后,改善了大豆品質和土壤微生物環境,并實現大豆增產9.3%。酵母菌在改善作物產量方面也有一定研究,李想等[13]研究發現在種植花生過程中施用粘紅酵母菌劑對花生生長和產量存在促進作用,同時也提高了土壤中細菌群落的豐富度和均勻度。由此可知,選用合適的復合菌劑對花生共生固氮和生長是有必要的。目前關于芽孢桿菌、花生慢生根瘤菌單接種的微生物菌劑應用較廣泛,但兩者復合接種、結合酵母菌在花生上的抗病性、促生性方面的研究則較少。

本研究以河南地區主栽花生品種遠雜9102為試驗材料,以花生慢生根瘤菌ZB15、芽孢桿菌1C-6和酵母菌1-103為研究對象,在實驗室條件下,通過盆栽試驗探究不同菌株單接種、復合接種對花生生長指標和光合作用的影響,以期獲得最優菌劑組合,為開發花生復合菌劑提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生品種為遠雜9102,由河南省農業科學院棉花油料作物研究所提供?；ㄉ鼍鶽B15(產IAA值為82.585 mg/L)、芽孢桿菌1C-6(產IAA值為37.15 mg/L)和廣譜生防酵母菌1-103(抗花生尖孢鐮刀菌)均為鄭州輕工業大學微生物資源挖掘與應用研究室篩選獲得的優良菌株。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 供試菌株的培養

參考黃曉娜等[14]的方法,將保存在鄭州輕工業大學微生物資源挖掘與應用研究室的優勢菌株的花生慢生根瘤菌ZB15、芽孢桿菌1C-6、廣譜生防酵母菌1-103分別接種于YMA 固體培養基、LB固體培養基和YEPD 固體培養基上,28℃恒溫培養7、2、3 d,并挑取單菌落到YMA 液體培養基、LB液體培養基和YEPD 液體培養基中[15],于28℃、180 r/min 搖床中培養至對數生長期,OD600值統一調為0.8。

1.2.2 盆栽實驗

挑選顆粒飽滿、大小適當且表面完整的花生種子,在無菌環境下對種子進行消毒,消毒處理為:95%乙醇浸泡30 s,加入0.2%升汞溶液浸泡5 min,無菌水清洗種子7次[16]。消毒后的種子擺在0.8%水瓊脂培養基上,置于28℃恒溫培養箱中暗培養3 d,待花生種子根長長至2 cm 左右即可栽種。無菌條件下,將已滅菌的蛭石裝進上層缽體(已滅菌)中,以距離上層缽體口1～2 cm為宜,挑選芽長2 cm 左右的花生栽種在上層缽體中的蛭石中,根部朝下,待上層缽體中種子種植后即可在下層缽體(已消毒)補充適量水分[17]。

試驗共設7個處理,具體處理如表1所示。單接種T1、T2、T3時分別吸取菌液1 mL加至花生根部,復合接種T4、T5、T6時分別吸取0.5 mL菌液至花生根部,封口膜封住上層缽口,每處理6次重復。將各處理組置于人工氣候培養箱(25℃光照16 h,濕度60%;20℃黑暗8 h,濕度40%)中,期間適當向下層缽體中補充水分,45 d(初花期)后收獲并測定生長指標[17]。

表1 試驗設計Table 1 Experiment design

1.3 測定項目與方法

1.3.1 葉綠素的測定

按照參考文獻[18]的方法測定花生葉片的葉綠素相對含量,采用SPAD-502 Plus便攜式葉綠素測定儀,選取花生主枝頂端下左側第2片葉片進行測定,求其平均值。

1.3.2 根瘤的測定與觀察

對花生植株的根瘤進行計數,觀察根瘤的形狀與根瘤橫切面的顏色[16]。

1.3.3 生長指標的測定

測量花生的莖基部到頂端的長度為株高,而根長則是從莖基部到主根根尖[19]。將植株的地上部與地下部從莖基部剪開,將同一處理植株的地上部、地下部分別置于70℃烘箱中烘至恒質量,稱量地上部與地下部的干質量。每組處理選5株花生植株,求出平均值,并計算花生植株的根冠比,計算公式如下[20]:

1.3.4 促生性綜合評價

接種菌劑對花生促生能力的評價是參考文獻[21-22]中的方法,應用模糊數學中的隸屬函數值法,對測定的各指標進行綜合評價,隸屬函數值計算公式如下:

式中:X為測量不同處理組花生植株各指標的平均值,Xmin和Xmax分別為測量花生植株各指標的最小值和最大值。隸屬函數值公式(2)適用于測量花生指標與促生能力呈正相關,否則適用公式(3)。將每個處理的7個指標隸屬函數值相加,求平均值,隸屬函數值的平均值越大,表明該處理對花生的促生能力越強[22]。

1.4 數據處理

利用Excel 2010 和SPSS 19 對所測試驗數據進行單因素方差分析及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 接種不同菌株對花生葉片葉綠素含量的影響

葉綠素含量與豆科植物光合作用和吸收養分緊密聯系[23]。由圖1可以看出,接菌處理的花生植株葉片的葉綠素含量均高于不接菌的葉綠素含量,且構成顯著差異(P＜0.05)。接菌處理的花生植株葉片SPAD 值在37.16～50.13 之間,以復合接種T6 處理的花生植株葉片SPAD 值最高,達50.13,是不接菌處理的1.77 倍,其次為T5、T4處理,分別是不接菌處理葉片SPAD 值的1.68、1.58倍。

圖1 接種不同菌株對花生葉片葉綠素含量的影響Fig.1 Inoculation of different strains on chlorophyll content of peanut leaves

2.2 接種不同菌株對花生植株生長特性的影響

2.2.1 對株高的影響

植株株高反映出在不同菌株處理條件下對花生植株生長的影響。由圖2可以看出,接菌處理對花生植株的株高有不同程度的促進作用。與不接菌處理相比,所有接菌的花生株高增幅范圍在5.03～11.60 cm 之間,差異顯著(P＜0.05)。其中,復合接種T6處理對花生植株株高生長的促進效果最佳,高達38.53 cm,較不接菌處理增加了43.06%。單接種T3 處理和復合接種T5 處理的植株株高次之,分別高于不接菌植株株高41.10%、39.85%,但三者差異不顯著。

圖2 接種不同菌株對花生植株株高的影響Fig.2 Inoculation of different strains on the height of peanut plant

2.2.2 對根長的影響

從圖3看出,接種不同菌株處理對花生植株根長生長的影響差異顯著(P＜0.05)。所有接種菌株處理的花生植株根長都高于不接菌處理,增幅范圍在15.10%～62.28%之間。其中,復合接種T6處理的花生植株根長最長,比不接菌處理的長62.28%,復合接種T5、T4處理次之。單接種T1處理對花生植株根長的生長促進效果不明顯,僅比不接菌根長長1.6 cm,與單接種T2處理的根長無顯著差異。

圖3 接種不同菌株對花生植株根長的影響Fig.3 Inoculation of different strains on the root length of peanut plant

2.2.3 對生物量的影響

表2可知,接種菌株處理對花生植株生物量有較明顯的促進作用,各處理花生地上部生物量、地下部生物量和根冠比之間差異顯著(P＜0.05)。與不接菌處理相比,所有接菌處理的花生植株地上部生物量明顯增加,增幅為27.67%～92.99%。其中,復合接種T6處理植株地上部生物量最大,復合接種T5處理次之。所有接菌處理的花生植株地下部生物量比不接菌處理提高了57.54%～152.83%,其中地下部生物量增幅高于100%的處理組有復合接種T6、復合接種T4、單接種T3,以復合接種T6處理地下部生物量增幅最大。接種菌株處理的植株根冠比與不接菌處理相比提高了6.34%～49.20%,其中以單接種T1處理根冠比為最大,其次為單接種T3、復合接種T4 和單接種T2處理。

表2 接種不同菌株對花生植株生物量及根冠比的影響Table 2 Effect of inoculation with different strains on the biomass and root-shoot ratio of peanut plant

2.2.4 對結瘤的影響

評價植株結瘤效率的重要指標之一是單株結瘤數,結瘤數越多,花生固氮能力越強。圖4可見,不接菌處理、單接種T1和單接種T2處理不能與花生形成結瘤,表明單接種芽孢桿菌和酵母菌不能與花生結瘤。單接種T3處理和復合接種T4、T5、T6處理均能與花生形成根瘤,且為粉紅色、圓形的有效根瘤?；ㄉ鷨沃杲Y瘤數以T6處理最多,高達82個,這表明復合接種ZB15+1C-6+1-103能促進花生根部根瘤的形成,且效果優于其他處理。

圖4 接種不同菌株對花生植株結瘤數的影響Fig.4 Inoculation of different strains on the root nodule number of peanut plant

2.3 不同菌株處理對花生綜合指數效應的隸屬函數分析

隸屬函數分析是將所測植株葉綠素含量和一些生長指標作為綜合指標,以此來分析不同菌株處理對花生植株的促生能力影響的大小。綜合評價值越大,其促生能力就越強。表3可知,復合接種T6處理的綜合評價值最高,為0.561,其次為復合接種T4處理,單接種T3處理再次之。這表明了復合接種ZB15+1C-6+1-103處理對花生植株的生長具有良好的促生作用。

表3 花生植株的生長指標及葉綠素含量的平均隸屬函數值Table 3 Average membership function value of growth indicators and chlorophyll content of peanut plant

3 討論

微生物菌劑替代無機化肥,是順應我國綠色農業發展的潮流,已成為我國農業可持續發展的迫切要求。施加微生物菌劑能促進花生生長,有助于花生根部根瘤的形成和共生固氮[3]。諸多研究表明,豆科植物的葉綠素含量與氮素、光合作用三者之間緊密相連,葉綠素含量的大小影響植株光合產物的形成與積累,從而影響作物產量[24]。施用復合菌劑能夠顯著增加大豆的葉綠素含量,Chl a/b比值低于單接種菌劑,意味著兩種菌劑能夠互利共生,改善土壤根際環境,提高土壤有機質含量,促進了根對氮素的吸收[25]。本研究表明,接種不同菌劑后提高了花生葉片的葉綠素含量,其中以根瘤菌ZB15、芽孢桿菌1C-6和酵母菌1-103三者復合接種處理花生的葉綠素含量最高,這與趙丹丹[26]研究發現在番茄生長過程中接種微生物菌劑后葉綠素含量升高,提升了光合作用的結果相似。本研究發現,與對照相比,復合接種T6處理的花生地上部生物量、地下部生物量、株高和根長分別提高了92.99%、150.83%、28.44%、62.28%,這與Atieno[27]和李想[13]分別在大豆、花生上的研究結果一致。接種單一菌株對豆科植物的作用效果明顯弱于復合菌株組合接種,但目前復合菌劑對植物的作用機理還有待深入研究。

本研究表明,復合接種芽孢桿菌、根瘤菌、酵母菌對花生生長有一定的促進作用,各處理的促進效果排序為T6＞T4＞T5＞T3＞T1＞T2,其中以復合接種ZB15+1C-6+1-103對花生植株生長的促進作用最優,該處理下花生結瘤數、根長、株高、生物量和葉綠素含量均為最高,表明復合菌種可以顯著促進花生的生長。因此,篩選合適的復合微生物菌劑的菌種組合對綠色農業的發展十分重要,同時也為復合菌劑對河南主產區花生產量和品質的提升給予了一定的數據參考。