冬小包腳菇可培養內生真菌及菌基土壤真菌物種多樣性分析

李 鵬，熊 雪，向 準，和耀威，劉忠玄，王 晶

（貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009）

0 引言

【研究意義】冬小包腳菇（Volvariella brumalisHe sp.nav.）是一種獨具特色的低溫型可食用大型真菌。最早由貴州生物研究所何紹昌研究員發現并于1987年正式予以命名，歸屬于擔子菌門（Basidiomycota）， 蘑 菇 綱（Agaricomycetes），蘑菇目（Agaricales），光柄菇科（Pluteaceae），包腳菇屬（Volvariella）[1]。該菇口感滑嫩，富含多種氨基酸及無機元素[2]，在口感及外觀上同包腳菇屬著名栽培品種草菇（Volariella volvacea）較為相似。但該菌子實體形成溫度在4～14 ℃，主要生長在冬季水稻收割后換茬種植小麥、油菜、蠶豆的農田里，明顯區別于喜高溫高濕環境的草菇[3-6]，有“低溫草菇”之稱，具有重要的市場價值和研究價值?！厩叭搜芯窟M展】近年來，由于農藥化肥的過度使用和冬季農田的閑置致使其小生境變化劇烈，其野外發生地激劇縮小，出菇頻率也大不如從前。冬小包腳菇自被發現以來，研究學者對其營養成分[3]、野外生境[7-8]、形態特征[9]等方面進行了探討。同時，冬小包腳菇子實體分離難度大，培養過程中獲得雜菌概率高，馴化后產量不穩定；真菌是引起食用菌病害的最主要的病原，而聚焦冬小包腳菇內生真菌和菌基土壤真菌的研究目前較少?！颈狙芯壳腥朦c】冬小包腳菇是貴州特有的珍稀食用菌，本課題組自2019年初開始在貴州省范圍內采集、分離、純化，直至2020年底才成功獲得純菌種10余株，其可培養內生真菌及菌基土壤真菌的關鍵微生物類群組成亟待深入探討?！緮M解決的關鍵問題】采用傳統組織分離法對冬小包腳菇子實體進行分離培養及鑒定，得到了冬小包腳菇純菌株及其可培養內生真菌菌株，并結合高通量測序法對冬小包腳菇菌基土壤真菌進行測序研究，旨在了解冬小包腳菇菌基土壤真菌和子實體可培養真菌組成情況，以突破冬小包腳菇分離難關，為冬小包腳菇馴化栽培及推廣奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

子實體采集與分離：在貴州省遵義市匯川區、黔南州龍里縣和六盤水市鐘山區等地，共采集野生冬小包腳菇標本約200份；選擇完整、無病蟲害的120個子實體分別標號，裝入采集袋，帶回實驗室，12 h內完成真菌分離。

菌基土壤采集：2020年12月于貴州省遵義市匯川區板橋鎮（27°98′63.22′ N，106°90′94.65′ E，海拔879～1 000 m，溫度6.5 ℃）采集野生冬小包腳菇主要分布地區的菌基土壤；該區域地貌類型為河谷盆地，土壤類型為砂質壤土，生境為水稻收割翻耕后輪作種植油菜的農田。方法：根據野生冬小包腳菇的分布情況設置3個10 m×10 m的平行樣方，戴無菌手套和口罩，挖取長勢良好的冬小包腳菇子實體，用無菌鑷子小心刮取其菌托表面的土壤，每個樣方按照對角線型路線采集3個菌基土壤為1個混合樣，共采集土壤樣品9個，得到土壤混合樣3個，分別編號為S1、S2、S3。置于滅菌的離心管中，放入車載冰箱-20 ℃保存備用。

1.2 菌基土壤真菌高通量測序

將采集到的冬小包腳菇菌基土壤送美吉生物有限公司進行高通量測序，得到的原始數據利用FLASH和fastp軟件，根據PE reads之間的overlap關系，對各樣本數據進行優化和質控過濾，得到有效數據。按照97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析，將OTU與NCBI數據庫比對并對OTU進行物種注釋。利用交互式微生物多樣性云分析平臺（www.majorbio.com，上海美吉生物醫藥科技有限公司）進行Alpha多樣性Shannon指數（H）、Simpson指數（D）、ACE指數和Chaol指數分析，采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析。

1.3 冬小包腳菇菌株及其內生真菌的分離與鑒定

1.3.1 分離與鑒定 培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，稻草40 g（剪成2-3 cm段，沸水30 min），葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素 B110 mg，瓊脂粉 20 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

采用傳統組織分離法對冬小包腳菇子實體進行分離，并置于18 ℃培養箱中培養，將培養得到的菌絲體進一步純化后進行分子鑒定。用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化真菌基因組DNA，提取之后的DNA選用真菌通用引物（ITS1：TCCG TAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTG ATATGC）進行PCR擴增，得到的PCR產物經1.0%瓊脂糖電泳檢測擴增后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.2 數據處理 利用Shannon-Wiener多樣性指數（H）、Simpson指數（D）、均勻度指數Pielou（J）、Margalef豐富度指數（R）評價冬小包腳菇內生真菌多樣性。并利用BioEdit軟件對分離得到的冬小包腳菇菌株及其內生真菌菌株，下載相應序列進行排列匹配，用MEGA6分別構建冬小包腳菇系統發育樹及冬小包腳菇∑內生真菌系統發育樹。

H=-（PilnPi）（Pi為第i種菌株數占全部菌株數的百分比∑）

D=1-（Pi）2（Pi為第i種菌株數占全部菌株數的百分比）

J=H/lnS（H為Shannon-Wiener指數，S為物種總數目）

R=（S-1）/lnN（S為物種總數目，N為樣本數）

相對豐度/%=（分離得到的內生真菌某屬的菌株數/分離得到的內生真菌總菌株數） ×100

2 結果與分析

2.1 冬小包腳菇子實體分子鑒定

對采集到的冬小包腳菇子實體進行分離、純化，得到冬小包腳菇菌株。經PCR擴增和序列測定，結果顯示供試冬小包腳菇菌株rDNA ITS區段長度為640 bp，上傳GenBank得到登錄號為OM108495，且經Blast搜索，結果均為Volvopluteus gloiocephalus和Volvariella gloiocephala，下載相似序列20條，并結合Volvopluteus、Volvariella及Pluteus三大屬常見種序列，共同構建冬小包腳菇系統發育樹。由圖1可知，該系統發育關系可分為三大類群，即Volvopluteus、Volvariella和Pluteus各為一個類群，而冬小包腳菇屬于Volvopluteus類群；若分為兩大類群，則Volvopluteus、Volvariella在同一類群，為傳統定義的Volvariella類群，Pluteus單獨為一個類群，即冬小包腳菇屬于傳統定義的Volvariella類群下。

圖1 基于ITS序列構建的冬小包腳菇系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of V.brumalis constructed based on ITS sequence

2.2 冬小包腳菇可培養內生真菌菌群組成及其系統發育關系

通過對采集到的冬小包腳菇120個子實體內生真菌進行分離鑒定，共分離出50個雜菌菌株分屬為3門，13科，16屬，20種，另有未定義科2個菌株，分別屬于2個屬（表1）。在門水平上，冬小包腳菇子實體內生真菌主要有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidomycota）和接合菌門（Zygomycota），其中子囊菌門為優勢菌門，共分離到菌株29個，相對豐度達58.00%；其次為擔子菌門，共分離到菌株13個，相對豐度為26.00%；接合菌門共分離到菌株8個，相對豐度為16.00%。在科水平上，叢赤殼科（Nectriaceae）和毛霉菌科（Mucoraceae）為優勢科，相對豐度分別為24.00%和16.00%；此外，球蓋菇科（Strophariaceae）、曲霉科（Aspergillaceae）相對豐度均為8.00%；原毛平革菌科（Phanerochaetaceae）、裂褶菌科（Schizophyllaceae）、生赤殼科（Bionectriaceae）、山野殼菌科（Montagnulaceae）和梨孢假殼科（Apiosporaceae）相對豐度為6.00%；多孔菌科（Polyporales）相對豐度為4.00%；皺孔菌科（Meruliaceae）、瘤座孢科（Tubeculariaceae）和革菌科（Coriolaceae）相對豐度為2.00%；未定義科的相對豐度為4.00%。從屬水平上，鐮刀菌屬（Fusarium）和毛霉屬（Mucor）為優勢屬，相對豐度分別為24.00%和16.00%；球蓋菇屬（Stropharia）相對豐度為8.00%；煙管菌屬（Bjerkandera）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、粘帚霉菌屬（Clonostachys）、節菱孢屬（Arthrinium）、曲霉屬（Aspergillus）和小球殼孢屬（Microsphaeropsis）相對豐度為6.00%；多孔菌屬（Polyporus）相對豐度為4.00%；射脈菌屬（Phlebia）、漆斑菌屬（Myrothecium）、蠟孔菌屬（Ceriporia）、 青 霉 屬（Penicillium）、Leiothecium和Parengyodontium相對豐度僅為2.00%。

表1 冬小包腳菇可培養內生真菌菌群組成Table 1 Composition of culturable endophytes in V.brumalis

從多樣性指數上看，冬小包腳菇子實體內生真菌Shannon-Wiener多樣性指數（H）為2.45，Simpson指數（D）為0.88，均勻度指數Pielou（J）為0.88，Margalef豐富度指數（R）為3.83。這表明冬小包腳菇子實體可培養內生真菌較為復雜，將增大該菇子實體分離難度。

2.3 冬小包腳菇菌基土壤真菌菌群組成及其系統發育關系

由表2可知，3個土壤樣品的文庫覆蓋率均大于99%，表明注釋結果能夠反映樣品中菌基土壤真菌群落的真實情況。通過比較3個土壤中的Shannon指數、Simpson指數、Chao指數以及Ace指數可知，冬小包腳菇不同菌基土壤真菌多樣性有一定差異，但普遍較為復雜，且平均Ace指數達298.7，Shannon指數達3.53，Simpson指數為0.08，Chao指數為304.23。

表2 Alpha多樣性指數分析Table 2 Alpha diversity index analysis

由冬小包腳菇3個菌基土壤樣品共檢測出276種土壤真菌，歸屬于10門131科213屬。如圖2所示，在屬水平上，冬小包腳菇3個菌基土壤真菌中被鑒定出來相對豐度大于1%的屬有被孢霉屬（Mortierella）、枝頂孢屬（Acremonium）、尾孢菌屬（Cercophora）、鬼傘屬（coprinellus）、翅孢殼屬（Emericellopsis）、鐮刀菌屬（Fusarium）、膝梗孢屬（Gonytrichum）、燒瓶狀霉屬（Lecythophora）、瓶毛殼屬（Lophotrichus）、綠僵菌屬（Metarhizium）、油 壺 菌 屬（Olpidium）、 小 盤 菌 屬（Pezizella）、癬囊腔菌屬（Plestosphaerella）、假散囊菌屬（Pseudeurotium）、木霉屬（Trichoderma）、綠核菌屬（Ustilaginoidea）、托光柄菇屬（Volvopluteus）、韋斯特殼屬（Westerdykella）、Eleutherascus、Pseudaleuria、Ticharina、Apiotrichum、Cistella及僅知道較大分類單元的未定義屬11個，包括Unclassified_o_Sodariales、Unclassified_c_Sodariomycetes、Unclassified_p_Mortierellomycota、Unclassified_o_Hypocreales、Unclassified_o_Glomerellales、Unclassified_o_Rozellomycota、Unclassified_f_Pyronemataceae、Unclassified_f_Lasiosphaeriaceae、Unclassified_f_Nectriaceae、Unclassified_p_Chytridiomycota、Unclassified_f_Chaetomiaceae。所有屬在3個土樣中均有發現，但相對豐度差距很大。以相對豐度大于3%的屬為優勢屬，土樣S1的優勢屬有Mortierella（20.59%）、Unclassified_o_Sodariales（17.13%）、Westerdykella（6.67%）、Metarhizium（6.17%）、Unclassified_c_Sodariomycetes（3.69%）、Pseudaleuria（3.48%）、Lophotrichus（3.45%） 、Unclassfied_f_Pyronemataceae（3.42%）；土樣S2的優勢屬有Pseudaleuria（28.28%）、Lophotrichus（16.72%）、Mortierella（14.81%）、Eleutherascus（6.50%）、Coprinellus（4.15%）、Unclassified_o_Hypocreales（3.05%）；土樣S3的優勢屬有Unclassified_c_Sodariomycetes（16.00%）、Mortierella（12.88%） 、Cercophora（6.06%）、Unclassified_o_Sodariales（5.52%）、Pseudeurotium（5.38%）、Volvopluteus（4.62%）、Tricharina（3.76%）、Lecythophora（3.67%）、Unclassified_p_Mortierellomycota（3.66%）； 其 中 僅Mortierella為3個土樣共有優勢屬。而綜合3個土樣真菌組成，冬小包腳菇菌基土壤優勢屬有Mortierella（16.10%）、Pseudaleuria（10.64%）、unclassified_o_Sordariales（7.74%）、Lophotrichus（6.91%）、unclassified_c_Sordariomycetes（6.86%）、Pseudeurotium（3.47%）。除Mortierella屬于被孢霉門（Mortierellomycota）外，其余屬均屬于子囊菌門（Ascomycota）。

圖2 基于屬水平的冬小包腳菇菌基土壤真菌物種組成Fig.2 Composition of V.brumalis rhizosphere soil fungi at genus level

3 討論

潘高潮等提出冬小包腳菇子實體生長發育所需的溫度約在6～12 ℃，生長基物水分含量33%～60%，相對濕度一般達60%以上[8]，子實體多發生于雨后，這表明冬小包腳菇是一種喜低溫高濕出菇的食用菌，子實體含水量高、菌絲體較弱和生長速度慢的特性制約了該菇的分離和培養。本研究采用傳統組織分離法對冬小包腳菇子實體進行分離培養及鑒定，得到了冬小包腳菇純菌株及其可培養內生真菌菌株50個。初步研究了冬小包腳菇系統發育關系，發現冬小包腳菇屬于Volvopluteus類群，也可屬于傳統定義的Volvariella類群。因為Volvopluteus是2011年由Justo等從傳統Volvariella類群中分出來的新類群，中文名為托光柄菇屬，而冬小包腳菇早在1987年就已被命名[2,10-12]。在系統發育關系中，冬小包腳菇同粘蓋包腳菇（Volvopluteus gloiocephalus）親緣性較近，但二者在子實體菌蓋顏色和發生季節等方面都存在明顯差異[13]。在3個冬小包腳菇菌基土壤中也發現了一定量的Volvopluteus類群序列，這說明冬小包腳菇菌基土壤中含有大量自身菌絲或孢子，這也是冬小包腳菇出菇的前提。而除Volvopluteus屬外，經高通量測序鑒定出來的土壤真菌相對豐度超過1%的屬超過30屬，其中相對豐度最大的優勢屬是被孢霉屬，在本研究所用的分類系統上歸屬于被孢霉門被孢霉科，但很多時候也被分類學家歸屬于接合菌門被孢霉科[14-16]，該屬真菌主要腐生于土壤，屬下有些物種可能與植物形成共生關系[17-18]，這對改善土壤的結構性質、促進植物的生長起一定的作用。但被孢霉屬有些物種也能引起動植物甚至其他微生物發生病變，例如貝勒被孢霉（Mortiereiia bainieri）能在雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）上寄生引起菌柄粗糙病，沃爾夫被抱霉（Mortiereiia wolfii）可以引起人和動物病害，比如牛霉菌性流產、全身性真菌病肺炎[19-21]。而被孢霉屬下真菌大多數是嗜冷真菌[22-23]，同冬小包腳菇一樣嗜好低溫，這可能是冬小包腳菇菌基土壤中檢測出大量的被孢霉屬真菌的原因之一。此外，冬小包腳菇常見發生地是水稻和油菜輪作農用地，不可避免的長期施肥也會致使農田土壤中被孢霉數量增加[24-25]。勞承英等通過高通量測序對不同耕作方式下水稻根際土壤真菌群落組成研究中也表明其土壤中被孢霉屬相對豐度較高，為優勢菌屬，且鑒定到的其他優勢類群同本研究中冬小包腳菇菌基土壤真菌相對豐度大于1%的類群相同的還有鐮刀菌屬、枝頂孢屬、韋斯特殼屬、綠僵菌屬等[26]，這表明冬小包腳菇菌基土壤真菌物種組成同水稻根際土壤真菌有一定相似之處。盡管冬小包腳菇菌基土壤中被孢霉屬真菌占比最大，但其可培養內生真菌中尚未分離鑒定出被孢霉屬真菌，但這并不能排除菌基土壤中的被孢霉具備侵染冬小包腳菇能力的可能性。土壤中的被孢霉在冬小包腳菇生長過程中起著什么樣的作用尚無法定論，還需進一步針對性研究，但能明確知道的是被孢霉屬下真菌對冬小包腳菇母種菌株分離造成的負面影響較小。

而在分離過程中對冬小包腳菇純菌株獲得影響最大的是其內生真菌鐮刀菌屬真菌，其次為毛霉屬。鐮刀菌屬是冬小包腳菇可培養內生真菌最大優勢菌群，且該屬真菌在3個菌基土壤樣品中均有發現，雖不是菌基土壤真菌優勢屬，但在所得屬中相對豐度較高，這表明冬小包腳菇生長過程中容易被鐮刀菌侵染，分離過程中受鐮刀菌影響也較大。在多數植物內生真菌組成中均可發現鐮刀菌，且往往被確定為優勢菌群[27-29]，這同本研究所得結果相似。水稻和油菜作為冬小包腳菇發生地的主要農作物，其根部內生真菌組成中鐮刀菌屬相對豐度也較大，通常也為優勢菌群[30-31]。盡管某些學者提出鐮刀菌在一定程度上能夠降解環境中有毒物質[32]，但目前研究較多的是其致病機理。作為一種土壤中廣泛分布的致病菌，鐮刀菌具有致病范圍廣和致病能力強等特點[33]，其中大多數是導致多種農作物病害的病原真菌，如鐮刀菌可引起馬鈴薯干腐病[34]、西葫蘆根腐病[35-36]、西瓜枯萎病[37]等多種病害。但Le等從栽培水稻中分離到一株內生真菌Fusariumspp.可用于根結線蟲的生物防治[38]，這表明對于宿主來說，鐮刀菌也可為有益菌。而在冬小包腳菇可培養內生真菌中毛霉屬是相對豐度僅次于鐮刀菌屬的優勢屬。且該屬真菌并未在冬小包腳菇菌基土壤真菌中被明確鑒定，這很大可能是土壤中毛霉屬菌絲或孢子相對占比較少，在高通量測序結果中不明顯，也可能是所采土壤有限所致，還有就是該種內生真菌的傳播途徑并非僅來源于土壤，還可能受空氣或枯枝落葉層等的影響[39]。

除此之外，冬小包腳菇可培養內生真菌中還含有相對豐度達26%的擔子菌門類群，具體包括球蓋菇屬、煙管菌屬、裂褶菌屬、多孔菌屬和射脈菌屬，同其他內生真菌不同，這類菌群在適宜條件下均能發育形成子實體，這不僅在大型真菌子實體分離中較為少見，甚至在植物可培養內生真菌分離培養中也是不常見的。這類內生真菌傳播來源是多途徑的，并增大冬小包腳菇菌株的分離難度。

而冬小包腳菇菌基土壤已鑒定出的已知真菌除主要優勢屬被孢霉屬和主要屬鐮刀菌屬外，還有其他致病菌和競爭菌，同時也含有一定量的抗病菌。如尾孢菌屬真菌能侵染寄主，可引致葉斑、疫病、果斑和果腐等[40-41]。黃瓜油壺菌（Olpidium bornovanus）可能是造成甜瓜藤蔓凋萎的病原體之一[42]。而綠僵菌能有效感染馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus）和榕管薊馬（Gynaikothrips uzeli）成蟲，起到生物防治作用[43-44]。這些土壤真菌是否將成為冬小包腳菇栽培過程中的主要致病菌或抑蟲菌仍需進一步研究。木霉屬真菌能夠產生多種次級代謝產物抗植物病原真菌活性、促進植物生長活性、抗酵母活性、抗細菌活性、抗病毒活性等，廣泛應用于植物病害防治，并在生物及其醫藥領域有一定的應用價值[45-47]，但對于草菇來說，木霉屬真菌卻是難以根治的病害，且有研究表明鬼傘屬也是草菇栽培種極為常見且難以控制的競爭性雜菌[48-49]。而素來有著“低溫草菇”稱號的冬小包腳菇，菌絲生長較普通草菇更慢，生長條件更苛刻，很大程度上也會受此類真菌的影響，在今后栽培試驗中應多加防控。

4 結論

本研究對冬小包腳菇系統發育關系、子實體可培養內生真菌和菌基土壤真菌菌群組成進行了研究，表明冬小包腳菇屬于Volvopluteus類群，也可屬于傳統定義的Volvariella類群，冬小包腳菇內生真菌中的鐮刀菌屬和毛霉屬為優勢屬，菌基土壤優勢屬為被孢霉屬、瓶毛殼屬、假散囊菌屬、Pseudaleuria和兩個未定義屬unclassified_o_Sordariales、unclassified_c_Sordariomycetes，不同土壤樣本間共有優勢屬為被孢霉屬；并探討了主要功能真菌的作用，為冬小包腳菇純菌株的獲得、人工馴化栽培及病蟲害防控的研究奠定理論基礎。但有關冬小包腳菇與菌基土壤真菌的相互作用及其調控機制，有待進一步深入研究。