紅海欖幼苗根系呼吸代謝對水淹脅迫的響應

程皓, 王友紹, 馬曉宇

1. 熱帶海洋環境國家重點實驗室(中國科學院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國科學院大亞灣海洋生物綜合試驗站, 廣東 深圳 518121;

3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州), 廣東 廣州 511458

紅樹林主要分布于熱帶和亞熱帶的河口、海灣和 潟湖中, 蘊藏著豐富的生物資源。紅樹林在潮間帶有較為明顯的成帶現象, 隨著高程的增加, 紅樹林群落從白骨壤等先鋒物種, 逐漸過渡到以紅樹科植物為主的秋茄、木欖和紅海欖等群落, 再到相對陸生的半紅樹植物群落(林鵬, 2001; 王友紹, 2021)。被譽為“海岸衛士”的紅樹林具有重要的生態價值,如生物固碳、水質凈化以及防風固堤等(王友紹,2019; Mai et al, 2022)。作為海陸交錯帶的一類特殊生態系統, 紅樹林易受到全球氣候變化和人類活動的雙重威脅, 全球范圍內紅樹林退化和消失的報道屢見不鮮(傅海峰 等, 2014; Lovelock et al, 2015)。為了扭轉這一趨勢, 我國自20 世紀90 年代以來, 相繼在華南沿海開展了多項紅樹林恢復與重建計劃, 并取得了巨大成效 (范航清 等, 2017)。

水分條件是影響紅樹林分布與生長的重要限制因子之一, 因為水淹會直接阻礙土壤和大氣之間的氣體交換, 導致植物根系缺氧和呼吸代謝的紊亂(Cheng et al, 2015)。三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環有氧呼吸(簡稱TCA 呼吸)和無氧呼吸是植物呼吸代謝的兩種常見的呼吸代謝途徑(Armstrong et al,2019; Pan et al, 2021)。已有的研究結果表明, 缺氧條件會抑制黃瓜、桃樹和大麥等植物根系細胞的TCA 循環效率, 導致三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)生物合成受阻, 從而影響植物正常的生長, 甚至有可能引起植株死亡(He et al, 2015;Luan et al, 2018; Gu et al, 2021)。另外, 水淹厭氧脅迫下, 植物有可能啟動無氧呼吸(如乙醇發酵和乳酸發酵), Zhang 等(2017)和Yin 等(2019)就曾報道水淹缺氧會誘導櫻桃樹和矮牽?；o氧呼吸的上調。無氧呼吸可暫時減緩水淹脅迫所造成的ATP 匱乏,但無氧發酵代謝產物在根系細胞內聚集也可能對根系細胞產生毒害作用(Loreti et al, 2016; Pan et al,2019)。了解紅樹植物呼吸代謝對水淹脅迫的響應特征對于紅樹林的保護與造林有重要意義, 但目前有關水淹脅迫對植物呼吸代謝影響的相關研究主要集中在經濟作物上(Loreti et al, 2016; 劉逸泠 等,2017), 僅有少數幾篇文獻探究了紅樹植物呼吸代謝對水淹脅迫的響應, 如Pezeshki 等(1997)和 Chen等(2005)曾報道水淹脅迫會誘導亮葉白骨壤、大紅樹和秋茄乙醇發酵的增強; 陳思婷(2021)則報道了圍填海過程中高嶺土淤積會導致白骨壤指狀根氣孔被堵塞, 從而使白骨壤遭受低氧脅迫, 誘導指狀呼吸根乙醇發酵的增強以及細胞色素C 氧化酶活性上升。

紅海欖廣泛分布于華南沿海地區, 是我國紅樹林修復主要常見造林樹種之一。為此, 本研究擬通過人工潮汐系統研究紅海欖幼苗根系呼吸代謝對水淹脅迫的響應, 以期為紅樹林的保護與恢復提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和水淹處理

實驗所用的紅海欖胚軸采摘于廣東省湛江市高橋鎮紅樹林保護區, 胚軸經高錳酸鉀溶液消毒、清水沖洗后種植在干凈河砂中, 以1/2 濃度的霍格蘭營養液澆灌。待幼苗長出第三對葉后, 選擇長勢一致、無病蟲害幼苗進行后續實驗。

利用人工配置10‰的氯化鈉溶液和人工潮汐系統裝置, 模擬不同潮汐水淹環境。本實驗共設4 個處理組(每天水淹0、6、12 和18h), 每個處理組有3盆, 每盆4 株植物, 其中同一盆中的4 株植物各生長或生理指標的平均值視為一個重復。實驗持續時間為兩個月, 溫室玻璃房的溫度為28±5℃, 光照條件約為300μmol·m–2·s–1。實驗結束后, 收獲植物并測定以下指標。

1.2 測定方法

1.2.1 植物生長指標測定

水淹處理兩個月后, 收獲植物, 放置于烘箱烘干, 分別測定地下根系生物量以及地上莖葉的生物量, 并計算地下部分/地上部分的生物量比值。

1.2.2 ATP 含量測定

ATP 含量測定參考前人的方法(Mohanty et al,1993)。己糖激酶催化葡萄糖和ATP 合成6-磷酸葡萄糖, 6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步催化6-磷酸葡萄糖生成還原態的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸, 該物質在340nm 有特征吸收峰, 由此測定ATP 含量。利用試劑盒(BC0300, 索萊寶, 北京, 中國)測定紅海欖幼苗根系中ATP 含量。

1.2.3 TCA 呼吸速率測定

TCA 呼吸速率的測定采用丙二酸抑制法(Bouma et al, 2001), 取0.05g 植物根系(直徑1.5mm,長度2～3cm), 均勻切成2mm 根段后, 轉移至離心管內后加入1.5mL 磷酸鹽緩沖液(20mmol·L–1PBS, pH 6.8), 測量液體內單位時間氧濃度的變化, 作為總呼吸速率。配置0. 5mol·L–1的丙二酸-磷酸緩沖液溶液用來抑制TCA 循環, 將切好的根段轉移至丙二酸-磷酸緩沖液溶液中, 測量溶液中氧濃度的變化, 作為剩余呼吸速率。TCA 呼吸速率計算公式如下:

其中R是TCA 呼吸速率(μmol·min–1·g–1),1CΔ 和ΔC2是未加入和加入TCA 抑制劑時緩沖液中O2濃度的變化值,t是測試時間,W為根系的重量。

1.2.4 TCA 呼吸以及無氧呼吸關鍵酶活性測定

琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenas, SDH)和蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, MDH)是TCA循環的兩個關鍵限速酶, 分別催化琥珀酸和蘋果酸生成富馬酸和草酰乙酸; 乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH) 和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)所誘導的乙醇發酵和乳酸發酵則是植物無氧呼吸的主要方式, 為此, 本實驗選擇了上述4 個呼吸代謝關鍵酶, 利用分光光度計法,測定植物根系ADH、LDH、SDH 和MDH 的活性, 所用試劑盒均由索萊寶提供(BC1080、BC0680、BC0950、和BC1040, 索萊寶, 北京, 中國)(Li et al,2020; Luo et al, 2020, 2021)。

1.2.5 乙醇和乳酸含量測定

乙醇和乳酸的提取與測定參考前人的方法(Good et al, 1993), 稱取0.5g 植株根系, 放入預冷的研缽中, 用預冷的1.6mL 0.6mol·L–1HClO4溶液提取,冰浴下研磨后靜置30min, 在4 ℃ 10000×g下離心10min, 移液槍取出上清液, 用3mol·L–1KOH 調pH至4.5, 放置15min, 在4 ℃ 10000×g下離心10min,上清液即為提取待測液。乙醇測定反應混合液含有1mL 的 0.3mol·L–1K4P2O7(pH 9.0) 、 0.1mL 49mmol·L–1的 煙 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸、0.02mL 75KU·L–1的乙醛脫氫酶、1.4mL 蒸餾水、0.1mL 酶液, 混合均勻, 測定340nm 波長的吸光值(A1), 用0.02mL 9000KU·L–1ADH 啟動反應, 8min 后測定340nm 波長吸光值(A2), 以兩次吸光值的差值(ΔA)計算乙醇含量。乳酸測定反應混合液含有0.67mL的 0.77mol·L–1谷 氨 酸 緩 沖 液(pH 8.9)、0.1mL 24mmol·L–1的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.05mL 780 KU·L–1的谷丙轉氨酶、1.96mL 蒸餾水、0.2mL 酶液,混合均勻, 25℃下水浴保溫10min, 測定340nm 波長的吸光值(A1), 用0.02mL 550KU·L–1LDH 啟動反應,20min 后測定340nm 波長吸光值(A2), 以兩次吸光值的差值(ΔA)帶入公式計算乳酸含量。

其中C為乙醇或乳酸的含量(μmol·g–1),AΔ 是吸光值的變化,Va為反應液的體積,Ve是總提取待測液的體積,ε是摩爾消光系數,d是比色杯量程,Vm是實驗所用的提取液體積,W為根系的重量。

1.3 統計分析

使用 SPSS(statistical product and service solutions, SPSS)軟件對實驗數據進行統計分析, 實驗結果表示為平均值±標準差, 通過單因素方差分析和最小顯著性差異檢驗法比較樣本的組間差異(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 紅海欖對水淹脅迫的生長響應

紅海欖對水淹脅迫的生長響應如表1 所示。與對照組相比, 適度的水淹(如每天水淹6h)不僅不會抑制紅海欖幼苗的生長, 甚至還一定程度上促進了紅海欖幼苗的生長。但是隨著水淹時間的延長, 尤其是在每天水淹18h 處理組中, 紅海欖生物量顯著降低(P＜0.05)。另外, 隨著水淹時間的延長, 紅海欖幼苗地下根系生物量的分配比例也顯著下降。

表1 水淹脅迫下紅海欖幼苗的生長以及生物量Tab. 1 Growth and biomass yield of R. stylosa subjected to waterlogging, different letters indicated significant variations between groups at P＜0.05

2.2 水淹脅迫對紅海欖根系ATP 含量的影響

紅海欖根系ATP 含量對隨水淹時間變化情況如圖1 所示。隨著水淹時間的延長, 紅海欖根系ATP含量出現明顯的下降趨勢(P＜0.05), 并在水淹18h 處理組中達到最低值。

圖1 水淹脅迫對紅海欖根系ATP 含量的影響不同字母代表組間存在顯著性差異P＜0.05Fig. 1 Effect of waterlogging on ATP content in the roots of R.stylosa, different letters indicated significant variations between groups at P＜0.05

2.3 水淹脅迫對紅海欖根系TCA 呼吸速率的影響

紅海欖幼苗根系TCA 呼吸速率對水淹脅迫的響應如圖2 所示。隨水淹時間的延長, 紅海欖幼苗根系TCA 呼吸速率呈明顯的下降趨勢, 且TCA 呼吸速率的最小值出現在每天水淹18h 處理組中。

圖2 水淹脅迫對紅海欖根系TCA 呼吸速率的影響*代表與對照組有顯著性差異(P＜0.05)Fig. 2 Effect of waterlogging on TCA respiration rate in the roots of R. stylosa. * indicated significant differences with control at P＜0.05

2.4 水淹脅迫對紅海欖根系乙醇和乳酸含量的影響

水淹脅迫對紅海欖根系乙醇和乳酸含量的影響如圖3a、b 所示。每天水淹6h 脅迫下紅海欖根系乙醇和乳酸含量與對照組無顯著性差異, 但隨著水淹時間的延長, 紅海欖根系乙醇和乳酸含量均顯著增加(P＜0.05)。

圖3 水淹脅迫對紅海欖根系無氧呼吸代謝產物的影響不同字母代表組間存在顯著性差異(P＜0.05)Fig. 3 Effect of waterlogging on anaerobic respiratory metabolites in the roots of R. stylosa, different letters indicated significant differences between groups at P＜0.05

2.5 水淹脅迫對紅海欖根系呼吸代謝關鍵酶活性的影響

紅海欖根系TCA 呼吸關鍵限速酶隨水淹時間變化情況如圖4a、b 所示。結果表明, 水淹脅迫顯著降低了MDH 酶活性, 即便低強度的水淹(每天水淹6h)也會顯著降低紅海欖幼苗根系中MDH 酶活性。低強度的水淹(每天水淹6h)對SDH 活性無顯著影響, 但隨著水淹時間的延長, 紅海欖幼苗根系中SDH 活性顯著降低。

圖4 水淹脅迫對紅海欖根系TCA 循環和無氧呼吸關鍵酶的影響誤差棒上不同字母代表組間存在顯著性差異(P＜0.05)Fig. 4 Effect of waterlogging on TCA and anaerobic respiration related enzymes in the roots of R. stylosa, different letters indicated significant variations between groups at P＜0.05

紅海欖根系無氧呼吸酶ADH 和LDH 活性對水淹脅迫的響應如圖4c、d 所示。水淹脅迫, 尤其是長時間的水淹脅迫, 顯著增加了紅海欖幼苗根系中ADH 和LDH 活性。另外還發現, ADH 的活性要遠遠高于LDH 的活性。

3 討論

盡管紅樹植物具備一定的耐淹能力, 但本研究的結果表明過度的水淹仍會直接抑制紅海欖幼苗的生長。本研究中紅海欖幼苗生物量最大值出現在每天水淹6h 處理組中, 其結果表明適宜的潮汐生境對紅海欖幼苗的生長至關重要, 至于紅海欖最優水淹時間則還需更進一步的研究。隨著水淹時間的延長,紅海欖幼苗的生長明顯受到抑制(表1)。已有的研究結果(葉勇 等, 2007; 廖寶文 等, 2010; 代捷 等,2020)表明, 紅樹植物并不能忍受持續長時間的水淹,過度的水淹同樣會直接抑制白骨壤、秋茄和木欖等紅樹植物正常的生長。

氧氣在水中的擴散速率約為在空氣中的萬分之一, 因此潮汐淹水會阻礙土壤和大氣之間的氣體交換, 導致紅樹林底泥的缺氧(Bailey-Serres et al, 2012;Cheng et al, 2020a, b)。關于植物對水淹脅迫的適應機制, 目前有生活史策略與能量分配、結構適應以及代謝適應三種主流的觀點。在長期的進化過程中,一些植物可以通過調節生命周期的長短來避免水淹傷害, 這類植物的特點是生命周期短, 在夏季洪水來臨之前就完成了生殖生長, 以種子的形式埋藏在土壤中以躲避水淹(Warwick et al, 2003)。減少地下根系生物量分配比例也是植物對水淹脅迫的一種適應策略(劉逸泠 等, 2017; Fujita et al, 2021), 本研究也發現水淹脅迫會降低紅海欖幼苗地下根系生物量/地上莖葉生物量的比值(表1)。地下根系生物量分配比例的降低將有助于減少根部的需氧和呼吸消耗,而地上部分分配比例的增加將擴大與大氣的接觸面積, 所有這些都能一定程度上幫助植物適應水淹缺氧生境(Cheng et al, 2015)。結構適應則主要強調通氣組織的作用, 通氣組織是指皮層細胞凋亡后所形成的空腔, 普遍存在于濕地植物根系中, 其形成有助于氧氣向根系的傳輸, 緩解水淹厭氧傷害(Armstrong et al, 2019; Cheng et al, 2020b; Pedersen et al, 2021)。

本研究則首次研究了紅海欖幼苗根系呼吸代謝對水淹脅迫的響應。我們發現紅海欖根系TCA 呼吸速率以及ATP 產能效率對水淹缺氧十分敏感, 即便是每天水淹6h 也會顯著降低紅海欖根系TCA 呼吸速率和ATP 產能效率(圖1、2)。有趣的是, 每天水淹6h 處理對紅海欖幼苗的生長基本無負面影響, 其原因可能是因為, 非水淹周期內紅海欖幼苗的生理代謝可能會部分恢復, 以維持植物正常的生長(Shingaki-Wells et al, 2014; Borella et al, 2019)。但隨著水淹時間的延長, 紅海欖TCA 呼吸和ATP 生成進一步受阻, 這將會抑制根系正常的生理活動以及對養分和水分吸收, 導致植物的生長和生物量的顯著降低(Wang et al, 2019; Cheng et al, 2020a; Fujita et al,2021)。另外, 我們還發現紅海欖幼苗根系SDH 和MDH 活性在水淹脅迫下呈明顯的下降趨勢(圖4)。TCA 循環是碳水化合物、脂肪和蛋白質分解代謝的共同通路, 是ATP 合成的主要途徑, 其中SDH 和MDH 是TCA 循環過程中兩個關鍵限速酶(Miro and Ismail, 2013; Jiang et al, 2020)。SDH 是TCA 循環過程中唯一的一個位于線粒體內膜上的酶, 是氧化磷酸化和電子傳遞的樞紐之一, 已有的研究結果表明,厭氧環境不利于SDH 催化琥珀酸生成富馬酸, 另外,糖酵解代謝產物丙酮酸的積累還會進一步抑制SDH與琥珀酸的結合, 導致TCA 循環效率的下降(Li et al, 2020)。MDH 則催化了TCA 循環過程中的最后一次脫氫反應, 伴隨著水淹時間的延長以及MDH 活性的下降, 這將會阻礙草酰乙酸的再生, 迫使TCA循環中斷, 抑制線粒體ATP 合成(Bailey-Serres et al,2012; Pan et al, 2021)。

相反, 紅海欖幼苗根系細胞無氧呼吸關鍵酶(ADH 和LDH)的活性則在水淹脅迫下呈上升的趨勢(圖4)。張艷婷 等(2016)也曾報道水淹脅迫會顯著增加“中山杉118”根系ADH 和LDH 酶的活性。無氧呼吸的增強可能是植物對水淹厭氧脅迫的一種適應策略, 在TCA 循環受阻的情況下維持糖酵解的繼續進行, 為植物提供暫時和短期的ATP 能量供給(Pan et al, 2021)。已有的研究結果表明水稻根系在水淹脅迫下的替代呼吸途徑有丙酮酸-乙醇、丙酮酸-乳酸及丙氨酸發酵途徑, 其中通過糖酵解產生的丙酮酸中約有92%被用于丙酮酸-乙醇途徑, 僅7%與1%的丙酮酸被分別用于丙酮酸-乳酸與丙氨酸發酵途徑(Miro et al, 2013)。本實驗中, 紅海欖幼苗根系內ADH 活性要顯著高于LDH 活性(圖4), 表明紅海欖受到水淹脅迫時同樣主要以丙酮酸—乙醇途徑作為主要的無氧呼吸替代途徑。值得注意的是, 無氧呼吸的ATP 產能效率遠不如TCA 呼吸(Loreti et al,2016; Jiang et al, 2017), 不能完全補償TCA 呼吸受阻所導致的ATP 產能效率的下降。另外, 無氧呼吸的增加會導致無氧發酵產物在植物體的積累。從圖3 可以發現, 過度的水淹會顯著增加紅海欖幼苗根系中乙醇和乳酸的含量。乙醇和乳酸均有一定的毒性, 能損傷線粒體結構、破壞蛋白結構并加劇膜脂傷害等(Tamang et al, 2014; Xu et al, 2016; Wang et al,2019)。但目前尚未開展乙醇和乳酸對紅樹植物毒害作用的相關研究, 另外, 隨著現代分子生物技術的發展, 一些紅樹植物已完成了全基因組測序, 紅樹植物對水淹脅迫的代謝響應及其分子調控機制也值得進一步研究(王友紹, 2019; He et al, 2019)。

4 結論

本實驗通過人工模擬潮水系統, 首次探究了水淹脅迫對紅海欖幼苗根系呼吸代謝的影響。與對照相比, 每天淹水6h 對紅海欖幼苗的生長影響不大,但隨著水淹時間的延長, 紅海欖幼苗的生物量顯著降低。我們還發現水淹脅迫會顯著抑制紅海欖幼苗根系琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶活性, 導致三羧酸循環有氧呼吸速率降低。無氧呼吸關鍵酶(乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶)活性以及無氧發酵代謝產物(乙醇和乳酸)含量在水淹脅迫下則呈上升趨勢, 但是無氧呼吸的增強尚不足以補償三羧酸循環受阻所導致的三磷酸腺苷產能效率下降。研究結果還進一步表明, 水淹缺氧條件下丙酮酸—乙醇途徑是紅海欖主要的無氧呼吸替代途徑。本研究將有助于更好地了解紅樹植物對水淹脅迫的響應和適應特征, 為紅樹林的保護與修復提供基礎數據和理論依據。