重金屬脅迫下四種紅樹植物幼苗生理響應特征

謝勇 , 王友紹

1. 熱帶海洋環境國家重點實驗室(中國科學院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國科學院大亞灣海洋生物綜合實驗站, 廣東 深圳 518121;

3. 中國科學院南海生態與環境工程創新院, 廣東 廣州 510301;

4. 中國科學院大學, 北京 100049;

5. 南方海洋科學與工程廣東實驗室(廣州), 廣東 廣州 511458

隨著工農業的發展，經濟效益提升的同時帶來了較大的污染問題，其中重金屬污染是一種常見的污染。由于重金屬污染物不能被生物降解，存在時間長，可通過食物鏈富集，危害人類健康，因而受到廣泛的關注(王宏鑌 等, 2005，Sodango et al, 2018)。特別是沿海濕地的重金屬污染問題較為突出，與其他濕地生態系統一樣，紅樹林生態系統也經歷了陸源污染物輸入，而城市化的快速發展也加劇了紅樹林區污染，使其成為重金屬污染物的重要儲存庫 (Usman et al, 2013; Bourgeois et al, 2019)。鄧利 等(2014)發現深圳福田紅樹林自然保護區沉積物中重金屬 Cu、Pb、Zn 等全部超過《海洋沉積物質量》(GB 18668-2002)中I 類標準。這些研究表明紅樹植物正遭受著不同程度的重金屬污染脅迫，高濃度的重金屬脅迫能夠干擾植物一些保護酶的活性，導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量累積，ROS 可以攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，造成氧化損傷(Hegedüs et al, 2004)，進而對植物的光合作用和呼吸作用產生影響，限制植物生長發育，嚴重時導致植物死亡。在重金屬污染脅迫下紅樹植物的生長與生理生化響應已經有較多研究(Zhang et al, 2007; 王友紹, 2019, 2021; 王芳洲 等, 2020; Wang et al,2021)，但是關于不同紅樹植物抗重金屬脅迫能力研究相對較少(王友紹 等, 2019)。

本實驗選取 4 種常見的紅樹科植物, 紅海欖(Rhizophora stylosa)、秋茄(Kandelia obovate)、木欖(Bruguiera gymnorhiza)和角果木(Ceriops tagal)為研究對象，分析在不同濃度重金屬水溶液脅迫下四種紅樹植物幼苗葉片的生理生化變化，以篩選出抗重金屬能力更強的紅樹物種，為受損濕地人工種植選種提供參考，對紅樹林的生態恢復、保護與持續發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗采用的紅海欖、秋茄、木欖、角果木幼苗均采自廣東省湛江市紅樹林育苗基地。所有紅樹幼苗均挑選六葉期的幼苗進行培養，用自來水沖洗干凈之后分別栽培于裝有沙子的塑料盆中，每三天用1/2 Hoagland’s 營養液澆灌一次，以補充水分和營養物質。Hoagland’s 營養液是植物培養中的常用營養液,主要成分包括鐵鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鎂和微量元素等。幼苗培養兩周后, 挑選無機械損傷、無蟲害的長勢良好的幼苗移至人工氣候培養箱進行培養，培養條件設置如下：溫度26℃、相對濕度75%、光照強度20000lux，光照周期12h·d–1，在人工氣候箱中進行培養馴化。

1.2 實驗方法

將培養馴化好的紅樹幼苗各自分為5 組，用1/2 Hoagland’s 營養液配置成4 個濃度梯度的復合重金屬水溶液分別進行脅迫處理，每3 天澆灌一次，每次澆灌600mL 復合重金屬水溶液。依據預實驗結果設置了如下復合重金屬水溶液濃度，具體含量見表1。復合重金屬水溶液脅迫處理28d 后剪取四種植物的葉片進行各生理生化指標的測定(Zhang et al,2007)。

表1 不同處理重金屬濃度Tab. 1 Concentrations of heavy metals in the different treatments

1.3 植物葉片可溶性蛋白的測定

可溶性蛋白的測定參照考馬斯亮藍測蛋白法(Bradford, 1976)，標準曲線的繪制及注意事項參考考馬斯亮藍法測定蛋白質含量中細節問題的描述(蔣大程 等, 2018)。

1.4 植物葉片SOD、POD、MDA 的測定

氯化硝基四氮唑藍(NBT)光還原法測植物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、愈創木酚氧化法測植物過氧化物酶(peroxidase, POD)活性、 硫代巴比妥酸比色法測植物丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，所用試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 數據處理

本實驗所有指標的測定均作三次生物學重復，最后的結果用平均值±標準差表示，用 Graphpad prism 7 進行作圖分析。使用SPSS(Version 21)進行單因素方差分析、Pearson 相關性分析和主成分分析(principal component analysis, PCA)，直觀地反映各生理生化指標之間的關系，標注*的數據代表與對照組具有顯著性差異(P＜0.05)。

2 實驗結果

2.1 復合重金屬水溶液脅迫對四種紅樹植物葉片可溶性蛋白含量的影響

由圖1 可知，重金屬脅迫下紅海欖葉片可溶性蛋白的含量除T2 組略高于對照組外，其余各組均低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。秋茄葉片的可溶性蛋白含量在各處理組均略低于對照組，差異不顯著(P>0.05)，木欖葉片可溶性蛋白含量除T2 組顯著低于對照組外，其余各組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。角果木葉片可溶性蛋白含量除T1 組外均顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖1 重金屬脅迫對四種紅樹植物可溶性蛋白含量的影響Fig. 1 The effect of heavy metal stress on the soluble protein content of four mangrove plants

2.2 復合重金屬水溶液脅迫對四種紅樹植物葉片SOD 活性的影響

由圖2 可知，復合重金屬水溶液脅迫可以增加四種植物幼苗葉片的SOD 活性，隨重金屬水溶液處理濃度的提高，四種紅樹植物葉片中SOD 活性均表現出先升高再降低的趨勢，紅海欖葉片SOD 活性在各處理組均顯著高于對照組(P＜0.05)，在T2 處理組達最大值，其中T2 組與T3 組SOD 活性很接近，分別為對照組的1.55 倍、1.52 倍，且均顯著高于對照組。秋茄和木欖葉片SOD 活性均在T2 處理組達到最大值，分別為對照組的1.39 倍和1.56 倍。角果木葉片在T1 處理組達到最大值，為對照組的1.36倍，當重金屬水溶液濃度超過T1 組濃度后，隨重金屬濃度的進一步提高SOD 活性開始下降，在T4 組時甚至低于對照組的活性。

圖2 重金屬脅迫對四種紅樹植物SOD 活性的影響Fig. 2 The effect of heavy metal stress on SOD activity of four mangrove plants

2.3 復合重金屬水溶液脅迫對四種紅樹植物葉片POD 活性的影響

由圖3 可知重金屬水溶液脅迫處理后四種紅樹植物葉片內POD 活性除木欖的T4 處理組、角果木的T3、T4 處理組外，葉片內POD 活性均顯著高于對照組(P＜0.05)，四種紅樹植物葉片中POD 活性均表現出隨重金屬水溶液處理濃度的增加先升高再下降的趨勢，紅海欖葉片POD 活性在T3 處理組達最大值，為對照組的1.77 倍; 秋茄、木欖葉片中POD活性在T2 處理組達最大值，分別為對照組的1.58倍、1.67 倍，角果木在T1 處理組達最大值，是對照組的1.59 倍，當重金屬水溶液濃度超過T1 后，表現出下降的趨勢。

圖3 重金屬脅迫對四種紅樹植物POD 活性的影響Fig. 3 The effect of heavy metal stress on POD activity of four mangrove plants

2.4 復合重金屬水溶液脅迫對四種紅樹植物葉片MDA 含量的影響

如圖4 所示，復合重金屬水溶液處理下四種紅樹植物幼苗中的MDA 含量基本呈現逐步升高的趨勢，其中紅海欖在較低濃度處理組T1、T2 組的MDA含量高于對照組，但并不顯著(P>0.05)，秋茄在T1處理組略低于對照組，木欖、角果木在T1 處理組高于對照組但并不顯著(P>0.05)，其他各組 MDA含量均顯著高于對照組(P＜0.05)。在T4 處理組時，四種紅樹植物葉片內MDA 含量達最大值，紅海欖葉片內MDA 含量最高為對照組的1.82 倍，秋茄是對照組的2.23 倍，木欖是對照組的2.25 倍，角果木是對照組的2.73 倍。

圖4 重金屬脅迫對四種紅樹植物MDA 含量的影響Fig. 4 The effect of heavy metal stress on MDA content of four mangrove plants

2.5 各指標間的相關性分析

Pearson 相關性分析結果表明(表2)，紅樹植物葉片內可溶性蛋白含量與POD、MDA 呈極顯著負相關關系(P＜0.01)，MDA 含量與POD 活性成極顯著正相關關系(P＜0.01)，SOD 活性與其他幾項指標相關性不顯著(P>0.05)。

表2 重金屬脅迫下各生理生化指標間的相關性Tab. 2 Correlation between various physiological and biochemical indexes under heavy metal stress

利用SPSS 做主成分分析，對生理生化指標進行降維處理，可以直觀體現重金屬水溶液脅迫下生理生化指標間的變化關系。結果如圖5 所示，生理生化指標分為2 個主成分，PC1 描述了總方差的73.030%，PC2 描述了總方差的25.926%，二個主成分合計描述了總方差的98.956%。其中MDA 和POD距離較近，說明二者關系密切。

圖5 重金屬脅迫下各生理生化指標的PCA 分析Fig. 5 PCA analysis of various physiological and biochemical indexes under heavy metal stress

3 討論

植物體內的可溶性蛋白多是參與各種代謝活動的酶類，其含量越多代表代謝活動越強，因此可溶性蛋白含量的多少可以反映植物體代謝活動的強弱(孫天國 等, 2010)。另外由于重金屬離子的存在，外界滲透勢會降低，細胞內的水會向低滲透勢的外界流失，導致植物缺水，對植物造成損傷?？扇苄缘鞍缀吭黾涌梢越档图毎麅鹊臐B透勢，提高植物的保水能力, 從而避免缺水導致的損傷?？扇苄缘鞍缀康亩嗌倏梢源碇参镎{節滲透壓能力的強弱，因此可作為關鍵的生理生化指標，指示植物的抗逆性強弱和代謝情況(趙胡 等, 2016)。本實驗中，紅海欖、秋茄葉片內可溶性蛋白含量略小于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，木欖葉片除T2 組可溶性蛋白含量顯著低于對照組外，其余各組與對照組相差不大，表明紅海欖、秋茄、木欖對重金屬脅迫有比較好的抗性，可溶性蛋白的含量能保持在一個較為正常的水平，維持滲透平衡，保證細胞代謝活動的正常進行，而角果木葉片可溶性蛋白含量除T1 組外均顯著低于對照組(P＜0.05)，說明角果木在遭受超過1 倍重金屬水溶液濃度脅迫時，葉片代謝活動減弱，調節滲透壓的能力減弱，重金屬脅迫對角果木葉片的蛋白質合成造成了影響。

氧化損傷是植物受重金屬脅迫傷害的主要機理之一，重金屬脅迫會導致ROS 的過度產生和積累(Sch ü tzendü bel et al, 2002)，高水平的 ROS 通常會破壞細胞成分，如細胞膜、核酸和葉綠素等(Tewari et al, 2002)，造成氧化損傷，影響植物發生長發育。低濃度的重金屬脅迫會激活植物的抗氧化系統，誘導SOD、POD 等抗氧化酶活性增加，清除植物體內活性氧 (Srivastava et al, 2004)，抗氧化酶的誘導是減少氧化損傷的重要保護機制，其中SOD 在誘導下活性增加，催化超氧陰離子轉化為過氧化氫和氧氣，過氧化氫也是一種自由基，也能對細胞膜造成氧化損傷，POD 則可以催化過氧化氫生成無毒害的水和氧氣，使植物體內的自由基保持在較低水平，從而避免自由基對植物造成氧化傷害，是逆境下植物體內重要的保護酶(Blokhina et al, 2003)。本研究中，隨著重金屬水溶液處理濃度的增加，四種紅樹植物幼苗葉片內的SOD、POD 活性均呈現出先升高再降低的變化趨勢，這與Cu2+處理下秋茄幼苗葉片的抗氧化酶變化情況一致(趙胡 等, 2016)，低濃度的重金屬脅迫誘導了抗氧化酶活性的提高，當重金屬濃度超過承受閾值后，植物體內的活性氧含量超過了正常的歧化能力，而對組織和細胞多種功能膜及酶系統造成破壞，反過來抑制了植物葉片內SOD、POD等抗氧化酶的活性。紅海欖葉片中POD 活性在T3處理組達到最大值; SOD 活性在T2 處理組時達到最大值，其中T3 組與T2 組SOD 活性非常接近，無明顯差距且均顯著高于對照組，分別是對照組活性的1.52 倍和1.55 倍。秋茄、木欖葉片中POD、SOD活性均在 T2 處理組達最大值，而角果木葉片中POD、SOD 活性均在T1 處理組達到最大值，隨后再增加重金屬水溶液處理濃度，SOD、POD 活性開始受到抑制，活性下降。說明紅海欖在T3 處理組，秋茄、木欖在T2 處理組，角果木在T1 處理組的重金屬脅迫時具有最積極的抗氧化酶活性，此時清除細胞內的ROS 能力最強，當重金屬處理濃度持續增加，超過了植物承受閾值時，抗氧化酶活性受到抑制，清除ROS 能力減弱，導致植物過氧化水平加劇，進而破壞膜結構，影響蛋白質合成等各種代謝活動，對植物產生損害。當逆境發生時，植物會采取各種措施提高自身的抵抗力以適應逆境壓力，但當逆境壓力超過植物的耐受極限時，其自身防御系統也會遭到破壞(王友紹，2019)。

植物在遭受重金屬脅迫時，體內會積累大量ROS，這些活性氧會攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸，發生脂質過氧化反應，產生MDA，MDA 的產生能加劇膜的損傷，因此可以通過MDA 含量間接反映膜的受損程度(Knight et al, 1990)。本研究中，重金屬水溶液脅迫增加了四種紅樹植物葉片中的MDA含量，當重金屬水溶液濃度增大時，葉片中的MDA含量持續增加，膜系統損傷加劇，植物受損程度加大。其中，紅海欖在T1、T2 濃度時MDA 含量雖然增加，但與對照相比，MDA 增加并不顯著(P>0.05)，表明T2 濃度的重金屬水溶液處理對紅海纜的損傷并不嚴重，同樣的，T1 濃度的重金屬污染對秋茄、木欖、角果木的損傷也不嚴重。紅海欖、秋茄、木欖、角果木四種植物在最高濃度處理組時， MDA含量分別為對照組的1.82、2.23、2.25、2.73 倍，表明在高濃度重金屬水溶液脅迫下，紅海欖受氧化損傷程度較低，秋茄、木欖受損程度相當，角果木受損程度最重。

Pearson 相關性分析結果顯示紅樹植物葉片內可溶性蛋白含量與POD、MDA 呈極顯著負相關關系(P＜0.01)，MDA 含量與POD 活性成極顯著正相關關系(P＜0.01)，SOD 活性與其他幾項指標相關性不顯著(P>0.05)。MDA 含量的增加表明植物遭受重金屬脅迫后發生氧化損傷，植物體內的氧自由基、過氧化物增多，刺激植物合成SOD、POD 等抗氧化酶，以清除體內的過氧化物，減少氧化損傷，所以MDA與POD 呈正相關關系。而重金屬離子進入細胞后會與細胞內的化合物結合，影響植物代謝活動，特別是影響蛋白質的合成，所以MDA 含量與可溶性蛋白含量呈現極顯著負相關關系。從PCA 分析圖中可知，將四個生理生化指標分解到2 個主成分中，可以解釋總方差的98.956%，其中POD 和MDA 距離最近，表明二者相關性很強，當重金屬脅迫產生氧化損傷時，MDA 含量增加，POD 活性也會提高，以清除氧自由基，減少氧化損傷。

4 結論

本實驗結果顯示，四種紅樹植物幼苗在遭受重金屬水溶液脅迫時，均表現出一定的抵抗重金屬脅迫能力，SOD、POD 兩種抗氧化酶能在一定程度上能夠清除重金屬脅迫產生的氧自由基，保護膜結構，避免氧化損傷。但是這種抵抗重金屬脅迫的能力有一定的限度，當重金屬濃度超過承受極限時，抗氧化酶的活性將會被抑制，活性氧大量積累，氧化損傷加劇。其中，紅海欖在10 倍重金屬水溶液處理時仍具有較為積極的抗氧化酶活性, 秋茄、木欖在5 倍重金屬水溶液處理時具有較為積極的抗氧化酶活性, 角果木在1 倍重金屬水溶液處理時抗氧化酶活性最強，表明紅海欖抗氧化酶系統承受重金屬污染能力強于秋茄、木欖，角果木抗氧化酶系統承受重金屬污染能力最弱。高濃度重金屬水溶液處理下角果木受氧化損傷程度最高，木欖與秋茄相當，紅海欖受氧化損傷程度最低。紅海欖的抗重金屬脅迫能力較強，秋茄與木欖的抗重金屬脅迫能力相當，角果木抗重金屬脅迫能力最弱。四種紅樹科植物中，紅海欖的重金屬抗性最強，角果木的重金屬抗性最弱，在受重金屬污染嚴重的海岸帶更適合種植紅海欖進行植物修復，恢復生態。本實驗篩選出了抗重金屬能力較強的紅樹種類紅海欖，其相關抗性基因有待進一步研究。