單細胞組學在早期妊娠母胎界面異質性中的研究進展*

金貝貝，楊曉清

(1.南通大學醫學院，南通 226006；2.南通大學附屬醫院婦產科，南通 226001)

妊娠早期是胚胎著床和胎盤形成的關鍵時期，其中早期妊娠丟失約占總妊娠丟失的80%，部分妊娠晚期的嚴重并發癥在妊娠早期就能被預測到[1]。胚胎一直以來被認為是母體的“同種異體移植物”，帶有父系基因的胚胎如何在母體內穩定存在一直是科研人員研究的熱點話題。母胎界面作為母體與胎兒直接交流對話的“接觸面”，除了有胎兒來源的絨毛外滋養層細胞(extravillous trophoblast,EVT)外，還包括母體來源的蛻膜基質細胞(decidual stromal cell,DSC)和蛻膜免疫細胞(decidual immune cell,DIC)。母胎界面細胞因子平衡的失調將會導致流產、子癇等不良妊娠結局事件的發生[2-3]，因此維持母胎界面各細胞群間以及細胞內部的動態平衡是妊娠成功的關鍵因素[4]。

細胞具有異質性，相同種類的細胞其基因型和表型可能不同，相同表型的細胞其遺傳信息也可能存在顯著差異。母胎界面組織的異質性問題是制約早期自然流產甚至復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)等妊娠相關疾病有效治療的關鍵因素。單細胞組學研究技術可從單個細胞水平分析母胎界面組織中各種細胞類型、細胞亞群及基因表達的差異性等因素，有助于揭示細胞間和細胞內交互對話的機制，從而更好地理解細胞異質性。本綜述通過分析近年來單細胞組學技術在早期妊娠母胎界面異質性中的相關研究，旨在深入探究母胎界面組織的異質性以及進一步了解母胎免疫耐受的潛在機制，為臨床疾病的治療與研究提供指導方向。

1 單細胞組學

單細胞組學技術是基于單個細胞分離技術的水平，探究細胞群體間及細胞內部動態分化的新興技術，主要包括單細胞基因組學、單細胞轉錄組學、單細胞蛋白組學、單細胞代謝組學以及單細胞表觀基因組學。不同于以往高通量測序技術，單細胞組學技術不僅能深入分析所測單個細胞亞群以及基因表達水平的差異性，也有助于進一步探究細胞譜系、細胞分化軌跡的關系，構建各細胞亞群間的互作網絡。目前單細胞組學的相關研究已在多個學科領域獲得突破進展，包括腫瘤學、生殖、干細胞領域等[5-7]。近年來，單細胞組學技術不斷發展，其中單細胞測序技術在妊娠早期的研究應用尤為廣泛，這不僅促進了母胎界面細胞分化發育及細胞命運的研究，也推動了母胎醫學的研究進展。

2 單細胞組學技術在蛻膜基質細胞中的研究

DSC是蛻膜組織的主要組成部分，可分泌多種因子共同調節早期妊娠母胎界面微環境，包括IGFBP1、PRL、白介素等[8]。作為DSC所分泌因子的主要組成部分及蛻膜化的重要指標，IGFBP1和PRL在母胎界面也表現出差異表達的特征。Vento-tormo等[9]通過單細胞轉錄組學技術全面解析妊娠早期的DSC并將其分為3種細胞亞群，DS1細胞亞群缺乏蛻膜經典分子標志物IGFBP1和PRL的表達，DS2和DS3細胞亞群表達IGFBP1，DS3細胞亞群表達PRL，且三類DSC亞群分布位置不同，進而說明DSC在母胎界面組織具有差異表達的異質性特征。DSC這一異質性不僅表現在妊娠早期，在妊娠晚期也有蛻膜異質性的表現。Huang等[10]通過單細胞RNA測序研究分娩前后的蛻膜組織細胞也得出相近的結論，揭示了有關分娩期蛻膜組織的異質性，該研究不僅為妊娠早期母胎界面蛻膜組織的差異表達提供了基于單細胞組學技術研究的證據，也為將來圍產醫學DSC的研究提供了指導。

3 單細胞組學技術在蛻膜免疫細胞中的研究

在正常妊娠中，胚胎作為“外來物質”能夠免受母體免疫系統的排斥并且能在母體內穩定存在，這與母胎界面免疫微環境穩態以及特殊的免疫耐受機制密切相關。在早期妊娠中，蛻膜免疫細胞包含多種免疫細胞類型，其中蛻膜NK細胞(decidual natural killer cell,dNK)占比最多[11]，其次是蛻膜巨噬細胞(decidual macrophage,DM)、T細胞、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)等[12]，各種免疫細胞類型及其分泌的細胞因子等協同作用以維持母胎界面免疫耐受平衡。

3.1 單細胞組學技術在蛻膜自然殺傷細胞中的研究 早期妊娠期間，dNK細胞是占比最多的蛻膜免疫細胞群，約占50%～70%。隨著妊娠的進行，子宮內膜迅速蛻膜化，CD56brightCD25+dNK細胞優先被募集到母胎界面[13]，具有耐受表型的CD56brightCD16-dNK細胞數量迅速增加。同時，dNK細胞分泌多種細胞因子、生長因子，在調節滋養細胞侵襲、子宮螺旋動脈重構、胎兒生長發育等多方面發揮重要作用[14-17]，但dNK細胞在早期妊娠母胎界面中的具體作用機制仍不明確。Vento-tormo等[9]基于單細胞轉錄組測序技術和分層聚類等方法對妊娠6～14周的蛻膜和胎盤進行研究，發現dNK細胞3個細胞亞群具有不同的分子特征和免疫調節功能。dNK1細胞亞群高表達CSF1、LILRB1受體和KIR基因，與EVT相互作用，同時表達參與糖酵解的酶以引發代謝；dNK2細胞和dNK3細胞高表達XCL1，防止免疫激活；dNK3細胞高表達CCL5。研究者還通過開發配體-受體庫預測不同細胞類型分子的互作，構建母胎界面單細胞圖譜，揭示早期妊娠母胎界面組織細胞交流互作的通訊機制，為探究母胎界面免疫微環境的研究提供新的思路。Guo等[2]對正常早期妊娠者及RSA患者的dNK細胞進行單細胞RNA測序分析，探討dNK細胞亞群及其在母胎界面的功能，表明dNK1細胞高表達KIR基因家族成員及LILRB1，具有支持胚胎生長活性的功能；dNK2細胞和dNK3細胞高度富集細胞因子介導的信號通路基因，傾向于細胞因子分泌的功能；dNK3細胞高表達IFNG免疫調節基因，推測dNK1細胞數量減少、IFNG基因表達量顯著增加可能導致RSA的發生，從單細胞角度對既往研究進行了補充說明[18-19]，促進了我們對疾病狀態下母胎界面異質性的理解，為RSA臨床免疫治療研究提供新的視角。

3.2 單細胞組學技術在蛻膜巨噬細胞中的研究 DM是早期妊娠母胎界面第二大免疫細胞群體，在重塑子宮螺旋動脈、維持母胎界面免疫耐受等方面發揮重要作用[20-21]。既往研究通常將DM分為促炎性M1型和抗炎性M2型兩種細胞類型[22]，DM在妊娠初期偏向M1型，隨著妊娠的進行，在胎盤形成后主要向M2型轉變[23]。Guo等[2]從單細胞水平檢測母胎界面DM的異質性，將DM分為mac1和mac2兩種細胞亞群，研究其差異基因并結合富集分析表明：在正常早期妊娠者中，mac1細胞與中性粒細胞介導的免疫作用有關，mac2細胞與NK細胞趨化性調節作用有關，mac1細胞和mac2細胞分別表征M1和M2基因特性。在RSA病理妊娠狀態下，DM總量顯著減少且有T細胞趨化性，其中mac1細胞亞群的功能增強和比例增加伴隨著mac2細胞亞群數量顯著減少，這與M1/M2兩種分型作用相似。

然而，有研究者認為部分DM細胞不適合常規M1/M2分型，Houser等[24]根據CD11c表達水平將CD45+CD14+DM分為CD11cHIDM和CD11cLODM兩種類型，且其分別產生促炎性和抗炎性因子，在母胎界面表達獨特的基因特征和功能，以共同維持母胎免疫微環境的平衡。Jiang等[25]在此基礎上首次鑒定出DM三個不同亞群的存在，促進DM在妊娠早期母胎界面異質性中的研究。Chen等[26]通過單細胞RNA測序技術研究表明富含于RSA蛻膜組織的第6巨噬細胞亞群同時高表達M1和M2基因組合特征，不同于傳統M1/M2分型，在疾病狀態下從單細胞和分子方面進一步探討了DM的分型問題，為探究不明原因RSA患者的發病機制及診療方案提供了新思路。

3.3 單細胞組學技術在T細胞中的研究 蛻膜T細胞參與維持母胎界面免疫耐受，主要包括CD4+T細胞、CD8+T細胞和FOXP3+調節性T細胞。Guo等[2]鑒定并分析了上述3種T細胞，研究發現RSA患者T細胞各亞群的細胞因子介導的信號通路及其促炎特性均有增強，表明RSA蛻膜免疫微環境以Th1型為主，推測改變蛻膜免疫細胞亞群的比例可能有助于將RSA病理妊娠轉變為正常妊娠。Wang等[27]對孕6～8周的正常妊娠者和RSA患者的蛻膜組織及外周白細胞進行了綜合分析，同樣表明RSA患者的蛻膜T細胞優先表現為促炎特性，并首次通過單細胞組學技術發現外周血中黏膜相關恒定T細胞(mucosal-associated invariant T cell,MAIT)的激活可能與母體的炎癥狀態有關，進一步推動了早期妊娠失敗的免疫發病機制的研究。然而，RSA疾病狀態下的蛻膜免疫異質性在很大程度上仍然未知。為進一步揭示蛻膜T細胞潛在的功能亞型，Chen等[26]對T細胞亞群的特異性表達基因進行了差異分析，研究表明早期妊娠期間CD4+T細胞的調節作用和CD8+T細胞的細胞毒性作用相互協調，共同維持蛻膜免疫微環境的平衡，但T細胞在母胎界面的異質性表現仍有待進一步探究。

3.4 單細胞組學技術在DC中的研究 DC在蛻膜免疫細胞中占比較少，約1%～2%，是妊娠期關鍵的抗原提呈細胞，在母胎界面發揮重要的免疫調節作用。根據成熟度分類，DC可分為CD83+成熟的樹突狀細胞(mDC)、CD209+(DC-SIGN)未成熟的樹突狀細胞(imDC)和中間態DEC-205+DC，妊娠早期以DC-SIGN+DC為主。近年來，Villani等[28]利用單細胞RNA測序技術探究人血液中DC的新細胞亞型及表達特征，促進人類免疫細胞圖譜的建立。Suryawanshi等[29]對妊娠6～11周的胎盤及蛻膜進行單細胞組學研究，繪制妊娠早期胎盤絨毛和蛻膜細胞轉錄圖譜，表明DC1屬于CLEC9A+亞型，DC2屬于CD1C+亞型，與Villani等[28]研究一致。Chen等[26]通過單細胞RNA測序對正常妊娠者及RSA患者的蛻膜進行研究，結合基因表達譜評估DC亞群的細胞特征，闡明多數DC屬于cDC1譜系，少數DC屬于cDC2譜系，提出部分來源于RSA蛻膜的呈激活態的DC所致的免疫紊亂可能與RSA發病有關。目前基于單細胞組學技術分析DC在早期妊娠母胎界面的相關研究較少，尚不明確DC確切的細胞亞群分型及功能特征。

4 單細胞組學技術在絨毛外滋養層細胞中的研究

EVT的侵襲作用是母胎界面形成的起始及關鍵因素[30]。在妊娠過程中，胚胎來源的EVT侵入蛻膜，與母體免疫細胞互作重塑母體子宮螺旋動脈，使得胎兒獲得充足的營養和能量支持，在胚胎著床、胎盤形成以及維持母胎耐受的過程中發揮重要作用。Suryawanshi等[29]鑒定分析早期妊娠中絨毛和蛻膜組織的主要細胞類型及基因特征，在確定已知EVT標志物的同時也發現了新的EVT標志物，包括HTRA4，這為先前報道的HTRA4與EVT侵襲及分化作用的相關研究提供了基于單細胞組學技術的論據支撐[31]。同時研究表明，妊娠早期EVT表達具有抗炎作用的MMP12，而非妊娠晚期高度表達的MMP11[32]，體現EVT從孕早期抗炎作用到孕晚期高度浸潤作用的動態轉變，有助于了解不同妊娠狀態下細胞功能的動態變化過程。Liu等[33]將妊娠8周的胎盤EVT分為3個細胞亞群，富集分析各細胞亞群的功能并剖析其高表達的特異性基因，表明EVT_8W_1亞群傾向于增殖作用，高表達RRM2；EVT_8W_3亞群傾向于免疫調節作用，高表達TAC3、SERPINE1等基因；EVT_8W_2亞群的基因表達水平居中位。研究還發現EVT表達多種多肽激素基因，雖未能鑒定出已知的部分EVT,如血管內EVT等，但仍能幫助我們更好地理解EVT在母胎界面的異質性表現。

5 總結與展望

近年來，單細胞組學技術促進了我們對妊娠早期母胎界面組織異質性的深入理解，推動了生殖醫學及母胎醫學研究領域的發展進程，極大地加速了“人類細胞圖譜”的構建，為探究細胞命運及異質性的研究提供了有力的技術支撐[34]。目前，單細胞組學技術不斷成熟，但其在早期妊娠母胎界面中的研究仍較少，且主要通過單細胞轉錄組測序技術來完成。未來，我們仍需要在單細胞高分辨率技術的支持下對母胎界面進行多組學的深入探究，以期最終減少妊娠期母胎疾患的發生率，保障母胎健康。