1H MRS評價長期胰島素治療1型糖尿病大鼠海馬代謝物的變化

徐 慧，吳伊婷，王旭霞，康 彥, 雷 皓，高麗鳳*

1.波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢磁共振中心（中國科學院 精密測量科學與技術創新研究院 武漢物理與數學研究所），湖北 武漢 430071；2.中國科學院大學，北京 100049；3.江漢大學醫學院 醫學影像系，湖北 武漢 430056

引 言

1 型糖尿?。═1DM）又稱自身免疫性糖尿病，是一種以胰腺β細胞的丟失或破壞導致絕對胰島素缺乏為特征的慢性疾病，可導致高血糖[1]．盡管癥狀出現的年齡多為童年或青春期，但也可出現在中年．T1DM 占所有類型糖尿病的5%～10%，而且發病率和患病率正在逐年增加[2]．T1DM 對大腦結構與功能產生負面影響，可導致糖尿病腦病[3]，出現諸如灰質萎縮[4,5]、白質改變[6-8]、認知功能[9,10]、腦代謝異常[11]等多種糖尿病腦損傷表現.

活體質子定域磁共振波譜（1H MRS）是一種利用磁共振現象和物質化學位移作用相結合來研究化合物濃度、結構等信息的分析技術，因具備安全無創的優點而廣泛用于研究生物體不同區域的神經化學水平和能量代謝水平的變化[12]．檢測代謝物濃度和代謝物比率的變化可以提供有關神經損傷、膜代謝功能障礙和神經系統疾病中發生的傳播缺陷的信息．1H MRS 已多次被用來檢測臨床和臨床前糖尿病及其相關動物模型的代謝改變，如大腦、肝臟、骨髓等器官的激素調節，葡萄糖（Glc）利用、氧化應激、滲透梯度調節，以及酮體水平等方面的改變[13-15]．不同階段的糖尿病和不同的糖尿病并發癥可能呈現不一樣的代謝水平．此前，本課題組應用1H MRS 發現鏈脲佐菌素（STZ）誘導T1DM 大鼠4 周后，海馬的膠質細胞代謝、神經元代謝等出現紊亂，而單次胰島素治療未對膠質細胞代謝損傷產生顯著的改變[16]．目前，糖尿病腦代謝研究尚缺乏應用1H MRS 探討長期T1DM 動物模型與持續胰島素治療T1DM 動物模型間的腦代謝水平比較的數據．本研究的目的即是評價STZ誘導的T1DM 大鼠及長期胰島素治療的T1DM 大鼠的海馬的波譜學特征．

1 實驗部分

1.1 實驗動物

8 周齡成年雄性SD 大鼠購于武漢大學實驗動物中心（動物許可證編號：SCXK（鄂）2019-0004）.正式實驗前，進行一周的適應性飼養.所有動物隨機分組，2～3 只/籠飼養于無特定病原體（SPF）級動物房，溫度為24±1℃，相對濕度為50%±5%，12 h/12 h 晝夜循環（光照時間：8:00～20:00），飲食和水供應充足.所有實驗流程及操作均符合國家實驗動物倫理和使用委員會規定.

1.2 實驗模型建立

T1DM 模型組大鼠腹腔注射一針劑量為62 mg/kg 的STZ（Sigma，St.Louis，MO），STZ 使用0.01 mol/L 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5）配置，并保存于0℃冰浴中；對照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液.為了避免STZ 注射后動物出現低血糖，在STZ 注射后的24 h 內給予大鼠5%糖水.注射STZ 后第3 天（Day 3）從尾靜脈采集大鼠血液樣本，通過血糖儀測定血糖.STZ 誘導大鼠空腹血糖≥7.1 mmol/L 被認為造模成功；空腹血糖<7.1 mmol/L 的STZ 誘導大鼠排除在實驗范圍之外.胰島素治療組大鼠首先按照T1DM 模型組給藥范式成功建造T1DM 模型；之后每日一次在腹部皮下注射長效甘精胰島素（Lantus SoloStar，100 U/mL），初始胰島素注射劑量為4～6 U/只/天，注射STZ 后第28 天起，為防止動物因為胰島素治療產生低血糖，胰島素注射劑量下調至3～4 U/只/天.最終成功建立了用于1H MRS 的對照組大鼠8 只，T1DM 模型組大鼠9 只，胰島素治療組大鼠8 只.分別于注射STZ 前一天（Day 0）和注射STZ 后（Day 3、Day 7、Day 14、Day 28、Day 42、Day 56 和Day 84）監測各組大鼠體重與空腹血糖水平，在注射STZ 后第84 天進行1H MRS 數據采集.

1.3 磁共振實驗

所有磁共振實驗均在Bruker 7.0 T/20 cm 成像儀上進行，使用直徑為72 mm 的體線圈進行射頻脈沖的發射，使用直徑為40 mm 的四通道正交表面線圈進行信號的接收.在實驗過程中，使用與純O2混合后濃度為1.5%～2.5%的異氟烷麻醉大鼠，并用熱水循環系統使動物體溫維持在37±1℃.實時監控動物的呼吸速率以保證動物不會被麻醉過深或過淺.

首先使用快速采集弛豫增強（RARE）序列采集定位像，參數設置如下：視野大?。‵OV）為3.0 cm×3.0 cm，矩陣大小為256×256，片厚為0.6 mm，片數為20，重復時間（TR）為5 250 ms，有效回波時間（TEeff）為36 ms，回波鏈長（RARE factor）為4，重復次數為4．

1H MRS數據采集使用PRESS序列，具體參數為TR=4 000 ms，單側海馬FOV=1 cm×4 cm× 4 cm，回波時間TE=14 ms，譜寬為4 000 Hz，采樣點數為2 048.所有體素先采集一個重復次數為1 的未壓水的譜，然后采集一個重復次數為256 的壓水后的譜，水信號的抑制采用弛豫優化的變間隔射頻脈沖技術．

1.4 數據處理與分析

1H MRS 數據用LCModel6.3-1A 軟件處理.原始自由感應衰減（FID）數據在LCModel 處理之前，沒有經過任何預處理．經相位、頻率、基線及渦流矯正后，運用約束正則化算法和分峰擬合對各代謝物進行定量分析．以未被壓制的水信號作為內標．1H MRS 檢測到多種神經化學物質，包括丙氨酸（Ala）、天冬氨酸（Asp）、肌酸（Cr）、磷酸肌酸（PCr）、γ-氨基丁酸（GABA）、Glc、谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸（Glu）、甘油磷酸膽堿（GPC）、磷酸膽堿（PCh）、谷胱甘肽（GSH）、肌醇（Ins）、乳酸（Lac）、氮乙酰天冬氨酸（NAA）、氮乙酰天冬氨酸谷氨酸（NAAG）、?；撬幔═au）、Cr+PCr（tCr）、GPC+PCh（tPC）、NAA+NAAG（tNAA）、Glu+Gln（Glx），以及部分脂質（Lip）與大分子（MM）．代謝物的擬合不確定性（CRLB）采用LCModel 中代謝產物濃度的誤差估計：當CRLB低于15%時，所得到的數據才被認為可靠，并被用于最后的分析．代謝物濃度、體重與血糖均以平均值±標準偏差形式表示．采用SPSS 18.0 軟件，體重與血糖使用雙因素重復測量方差分析，代謝物濃度使用單因素方差分析．組間多重比較采用Bonferroni 校正，校正后p<0.05 被認為存在統計學差異．

2 結果與討論

2.1 體重與空腹血糖比較

圖1顯示STZ 注射前后各組大鼠的體重與血糖雙因素重復測量方差分析比較結果．三組大鼠體重間的給藥主效應結果顯示存在顯著性差異[F(2,14)=26.983，p=0.000]，時間的主效應[F(1.174,8.217)=190.378，p=0.000]以及時間×給藥的交互效應[F(3.024,21.168)=44.177，p=0.000]同樣具有顯著性差異．三組大鼠血糖間的給藥主效應結果顯示存在顯著性差異[F(2,14)=374.028，p=0.000]，時間的主效應[F(7,49)=37.544，p=0.000]以及時間×給藥的交互效應[F(14,98)=25.964，p=0.000]同樣具有顯著性差異.在各時間點，組間兩兩比較的結果顯示，造模成功后（Day 3～Day 84），T1DM 模型組較對照組體重顯著降低，血糖顯著升高.胰島素給藥后，胰島素治療組與對照組相比，血糖無顯著性差異；體重除在Day 14 顯著降低外，其他時間點無顯著性差異．胰島素治療組較T1DM 模型組血糖顯著降低，體重自Day 28 起顯著升高．

圖1 各組大鼠的體重與血糖比較．數據以平均值±標準差的形式呈現．* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001，與對照組比較；# p<0.05，## p<0.01，### p<0.001，與胰島素治療組比較．Con：對照組；Dia：T1DM 模型組；STZ-Insulin：胰島素治療組Fig.1 Comparison of body weight and blood glucose levels among groups.Data is presented as mean ± standard deviation.* p<0.05,** p<0.01, *** p<0.001, compared to the control group; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001, compared to the insulin-treated group.Con: control group; Dia: type 1 diabetes mellitus group; STZ-Insulin: insulin-treated type 1 diabetes mellitus group

2.2 活體1H MRS 實驗結果

圖2顯示活體定域波譜興趣區右側海馬腦區的定位．圖3分別顯示了對照組大鼠、T1DM 模型組大鼠，以及胰島素治療組大鼠海馬腦區活體波譜、LCModel 的擬合結果、擬合與原始數據的殘差．

圖2 T2加權像上右側海馬感興趣區的位置．Axi：橫斷面；Sag：矢狀面；Cor：冠狀面Fig.2 The locations of the right hippocampus voxels on T2-weighted templates.Axi: axial image; Sag: sagittal image; Cor: coronal image

圖3 各組具有代表性的海馬1H MRS．譜中黑色線為原始譜，紅色線為LCModel 對原始譜的擬合，譜上方為擬合與原始譜的殘差．Con：對照組；Dia：T1DM 模型組；STZ-Insulin：胰島素治療組Fig.3 The representative 1H MRS of the hippocampus in each group.The corresponding LCModel fits (red lines in the spectra) to the raw spectra (black lines in the spectra) and fitting residuals (above the spectra) were shown.Con: control group; Dia: type 1 diabetes mellitus group; STZ-Insulin: insulin-treated type 1 diabetes mellitus group

表1顯示了符合標準（每個譜中量化的CRLB 均小于15%）的9 個代謝物的擬合準確度（平均CRLB±標準偏差），圖4顯示了海馬代謝物的定量分析結果.

表1 海馬代謝物擬合準確度Table 1 The fitting accuracy of hippocampal metabolites

圖4 各組海馬代謝物的定量分析結果．Con：對照組；Dia：T1DM 模型組；STZ-Insulin：胰島素治療組；* p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001Fig.4 Quantitative analysis results of the hippocampal metabolites in each group.Con: control group; Dia: type 1 diabetes mellitus group; STZ-Insulin: insulin-treated type 1 diabetes mellitus group; * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001

由STZ 誘導的T1DM 模型組的Ins 和Tau 的濃度與對照組相比顯著上升（p=0.000、p=0.003）；胰島素治療組較T1DM 模型組Ins 和Tau 的濃度顯著下降（p=0.000、p=0.010），與對照組無顯著性差別．T1DM 模型組、胰島素治療組較對照組Glu 濃度均顯著上升（p=0.014、p=0.007），胰島素治療組較對照組Glx 濃度顯著上升（p=0.042）．其余觀測值（GSH、NAA、tPC、tNAA、tCr）在三組間均無統計學差異（p>0.05）．

2.3 討論

本研究發現長期胰島素治療T1DM大鼠血糖與體重控制良好，較T1DM模型大鼠血糖顯著降低、體重顯著升高．1H MRS 檢測的代謝物的濃度變化表明了長期胰島素治療改變了STZ 誘導的T1DM大鼠的海馬代謝，可能影響滲透調節、神經傳導等方面．

Ins 主要存在于神經膠質細胞中，因此常被作為神經膠質細胞的標志物．Ins 濃度異常升高可以反映膠質增生的水平[17].同時Ins 作為生物膜脂質成分的組成部分，也是磷脂酰肌醇第二信使系統的重要組成部分，可通過不同機制參與胰島素代謝信號的細胞內傳遞[18].Tau 是一種含硫的β-氨基酸，以游離形式存在于神經元及膠質細胞內，在大腦發育過程中具有神經營養作用，作為神經遞質、抗氧化劑和滲透調節劑參與神經調節等多種大腦功能[19].在嚙齒類動物中，Ins 與Tau 同是大腦內主要的滲透物，對維持細胞形態、參與大腦的滲透/容積調節有重要作用[20].本研究發現高血糖時大鼠海馬Ins 和Tau 濃度上升，與前人的結果[16,21]一致.一方面，當糖尿病及其并發癥發生時，Glc 代謝受到影響，高血糖導致胰島素抵抗，炎癥反應增加，誘導膠質細胞的膠質化過程，高血糖下Tau 和Ins 水平的平行上升伴隨著星形膠質細胞的主要成分膠質纖維酸性蛋白表達的增加[22]；另一方面，高血糖導致細胞膜內外的滲透壓梯度增大，使水從胞內轉移到胞外，引起細胞體積收縮.膠質細胞內滲透調節物質Ins 和Tau 水平升高對維持神經元和神經膠質細胞體積起促進作用.STZ 誘導的糖尿病大鼠造模成功4 周后單次注射胰島素，海馬Ins 水平與Tau 水平較生理鹽水對照組顯著升高[16]，本實驗中注射STZ 后第84 天，胰島素治療組大鼠海馬的Ins 濃度和Tau 濃度與正常對照無差異，較T1DM 模型組顯著降低.我們的結果表明可能不同于長期未受控制的高血糖導致的海馬膠質細胞增生與滲透調節受損，在胰島素長期干預下血糖受控的糖尿病動物海馬膠質細胞未明顯增生，滲透平衡未失調.

NAA 主要存在于神經元，尤其是線粒體中，因此NAA 被認為是神經元的標記物，NAA 的變化可以反映神經元丟失的信息[23].T1DM 患者海馬區NAA 水平顯著性下降[24]和沒有顯著性差異的發現均有報道[25]，在動物模型中的報道也不一致．例如：STZ 誘導后4 天和4 周時，大鼠海馬NAA水平出現顯著下降[16]；STZ 誘導大鼠后1～29 天，包含海馬和皮層區域的NAA 濃度無變化，45～87天NAA 濃度下降[21]；STZ 誘導后30 天，高血糖大鼠海馬NAA 濃度上升，在注射胰島素血糖恢復正常后，NAA 濃度也恢復到了對照組的水平[22]．本實驗中注射STZ 后第84 天，T1DM 模型組和胰島素治療組與對照組相比，均未出現NAA 濃度的顯著差異．近來也有其他模型發現大腦NAA 的含量是可以恢復的[26]，這可能是大腦神經元對長期疾病刺激所做的可塑性調節．

Glu 是大腦主要的興奮性神經遞質，對腦區之間的信號傳遞有至關重要的作用[23]．Gln 在T1DM中是條件性必需氨基酸，可能有助于中和低血糖[27]．Glu 在神經膠質細胞中的谷氨酰胺合成酶作用下合成Gln，Gln 經神經元中的谷氨酰胺酶轉化為Glu，形成Glu-Gln 循環[28]．Glu 與Gln 都參與了許多重要的代謝途徑，如能量供應、蛋白質合成等．本實驗中，相較于對照組，T1DM 模型組與胰島素治療組大鼠海馬的Glu濃度均顯著升高，與血糖控制下的T1DM患者的腦Glu 水平升高結果一致[10]；T1DM 患者前額葉、T1DM 大鼠頂葉均被觀察到Glu 水平升高[29,30]．有研究表明，T1DM 患者急性低血糖時，腦Glu 水平會下降，這是由于Glu 作為替代的能量物質，用以補充Glc 的消耗[31]．高Glu 水平可能是大腦保護機制對反復低血糖損傷的反應．因此長期胰島素治療造成的Glu 增加可能由于腦代謝活動增加[23]．此外，Glu 具有神經毒性，導致神經元細胞死亡，Glu 水平的升高可能反映了興奮性毒性增加，而糖尿病患者相關的認知功能下降及糖尿病并發癥等障礙與增加的Glu 興奮性毒性相關[30]．

3 結論

本文利用活體1H MRS 研究了由STZ 誘導的T1DM 大鼠模型及長期胰島素治療T1DM 大鼠單側海馬區代謝物的變化，發現Ins 濃度與Tau 濃度對胰島素治療敏感，提示相比高血糖未受控制的T1DM 大鼠，血糖控制良好的T1DM 大鼠海馬的神經膠質細胞增生得到改善．

致謝

感謝江漢大學校級科研項目資助計劃（2022SXZX26）和國家自然科學基金（81601204）對本研究的支持.

利益沖突

無