冰凍PRP和凍干PRP的抗菌作用研究*

毛平平 王淑君 羅開云 齊清 趙廣超 欒建鳳

富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）因含有大量生長因子被廣泛應用于美容、植發、整形、臨床創面及軟組織的修復[1]。隨著PRP在急性和慢性感染創面的應用，其抑菌作用也受到了研究者的關注。文獻證實，PRP無論在體內還是體外，都具有抗菌性和抗炎性，且抗菌機制特殊不易產生抗菌耐藥性[2]。在急性和慢性感染創面的細菌篩查顯示，無論是單一還是多種細菌聯合感染，最為顯著的感染菌是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌。此外，白色念珠菌不僅是臨床感染常見菌也是手術器材污染常見菌[3]。因此本文選取了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌四種臨床感染常見微生物進行體外抑菌實驗研究。

考慮到新鮮PRP使用前需要一定的制備時間，既不方便緊急狀況及邊遠地區使用，且一次制備后不能多次使用。近年來，針對PRP保存方式的研究也越來越多，常見的有冷凍和凍干兩種方式[4]。結合既往文獻對新鮮PRP抑菌作用的研究，本研究選用冰凍PRP和凍干PRP，探討保存方式是否影響PRP的抑菌作用。

資料與方法

1 主要儀器和材料

1.1 儀器：血細胞分離機 (Fresenius Kabi，型號COM.TEC) 、全自動血細胞分析儀（Sysmex，型號XE2100）、電熱恒溫培養箱（太倉市華利達實驗設備有限公司，型號DHO-9082）、麥氏細菌比濁儀（杭州市齊威儀器有限公司，型號WGZ-XT）、冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司，型號FDU-1200）、漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司，型號QT-2）、電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司，型號DK-8D）、無菌接駁機（bms，型號STW6810）-40℃低溫冰箱（SanYo，型號MDF-5411）、光學顯微鏡（Olympus Corporation，型號CX23T）。

1.2 材料：營養肉湯（北京陸橋技術股份有限公司，批號200511）營養瓊脂平板（青島高科技工業園海博生物技術有限公司，批號20220124）、一次性接種環（比克曼生物，批號202108A）、滅菌注射用水（石家莊四藥有限公司，批號2110163203）、快速法革蘭氏染色液（珠海貝索生物技術有限公司，批號C210801）、生理鹽水（濟民健康管理股份有限公司，批號R211118A41）。

1.3 實驗菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCC14053）、銅綠假單胞菌（ATCC27853），來自東部戰區總醫院中心實驗室。

2 方法

2.1 標本來源：本研究經醫院倫理委員會討論通過（No.2022（KY）-007）。經篩查均符合《獻血者健康要求》（GB18467-2011）的12位健康無償獻血者，分別取其機采血小板20 mL。無菌條件下分成2份，每份10 mL，置于-40℃低溫冰箱冷凍保存。

2.2 冰凍PRP、凍干PRP的制備：-40℃低溫冰箱的冰凍單采血小板即為冰凍PRP，使用前置于37℃水浴復融。將-40℃低溫冰箱的一份冰凍單采血小板[5]，放入預降溫至-46℃的凍干機進行真空干燥，保持真空度為＜15 Pa，干燥12 h后取出，即為凍干PRP，室溫密封干燥保存4周后，使用前加入該樣本凍干前等體積滅菌注射用水充分混勻復水。

2.3 菌株的活化以及增菌：將凍存的4種標準菌株各取1接種環，采用分區劃線法接種至普通營養瓊脂平板，經37℃恒溫培養箱培養24 h，可見單個菌落形成，取2～3個單獨菌落加入2 mL無菌生理鹽水管中碾磨并使用漩渦混合器混勻，用麥氏細菌比濁儀調成0.5麥氏單位細菌懸液，分別取0.2 mL金黃色葡萄球菌懸液、大腸桿菌懸液、白色念珠菌懸液、銅綠假單胞菌懸液加入2 mL肉湯培養基，每一種細菌制備9支肉湯管備用。

2.4 實驗分組及設計

2.4.1 實驗分組：分別為生理鹽水對照組，冰凍PRP組和凍干PRP組。取金黃色葡萄球菌肉湯培養基3管，對照組加入2 mL生理鹽水，冰凍PRP組加入復融后2 mL冰凍PRP，凍干組PRP加入同一獻血者2 mL復水的凍干PRP。各試驗組設3個樣本，9管試管同時置入37℃電熱恒溫培養箱中孵育。用相同方法處理大腸桿菌肉湯培養基、白色念珠菌肉湯培養基、銅綠假單胞菌肉湯培養基。

2.4.2 觀察指標：（1）血細胞分析儀檢測每份PRP的血小板、白細胞及紅細胞含量。（2）菌落計數：根據各菌種的生長周期設定取樣時間，金黃色葡萄球菌為3、6、9、12、24 h取樣，大腸桿菌為2、4、6、8、10 h取樣，白色念珠菌為6、18、24、30、36 h取樣，銅綠假單胞菌為3、6、9、12、18 h取樣。每個時間點分別取兩次0.1 mL樣本，一份樣本直接涂于玻片，革蘭染色后于光學顯微鏡下觀察細菌形態；另一份用樣本加入0.9 mL生理鹽水后，做10～107梯度稀釋，取0.1 mL稀釋后樣本涂布接種于普通營養瓊脂平板，每次取樣使用漩渦混合器混勻30 s，置37.0 ℃電熱恒溫培養箱培養24 h，記錄下各平板上的菌落數，算出同一種菌落稀釋后平板上生長的平均菌落數，計量數據以（）×106CFU/mL表示。

3 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，由于菌落計數不成正態分布， 因此取常用對數轉化使之基本符合正態分布。重復測量數據使用廣義估計方程處理，同時考慮實驗分組（組間）和重復取樣的時間點（組內）兩個因素，若差異具有顯著性，任一時間點組間兩兩比較或同一組內不同時間點兩兩比較當滿足球形檢驗時用SNK法作單因素方差分析，不滿足球形檢驗時作多因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。采用GraphPad Prism9統計軟件作圖，實驗數據以log均數表示。

結 果

1 PRP中白細胞及血小板含量 機采PRP的血小板濃度為（1 083±91.667）×109/L，白細胞計數為（0.032±0.027）×109/L，未檢出紅細胞。

2 金黃色葡萄球菌組各時間點冰凍PRP組與凍干PRP組的抑菌活性比較 由模型中自變量的檢驗結果可知，取樣時間、實驗分組、取樣時間*實驗分組的交互項均具有統計學意義（P＜0.05）。在觀察的24 h內，冰凍PRP組和凍干PRP組相較于對照組均對金黃色葡萄球菌生長有抑制作用，且差異有統計學意義（P＜0.05）。其中，3 h、6 h凍干PRP組細菌計數低于冰凍PRP組，差異有統計學意義（P＜0.05）；9 h凍干PRP組細菌計數低于冰凍PRP組，差異無統計學意義（P＞0.05）；12 h、24 h凍干PRP組細菌計數高于冰凍PRP組，差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖a）。

3 大腸桿菌菌組各時間點冰凍PRP與凍干PRP的抑菌活性比較 由模型中自變量的檢驗結果可知，取樣時間、實驗分組、取樣時間*實驗分組的交互項均具有統計學意義（P＜0.05）。冰凍PRP組與凍干PRP組對大腸桿菌的抑制作用，在2 h、4 h、6 h、8 h與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），10 h與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。其中，2 h凍干PRP組細菌計數低于冰凍PRP組，差異有統計學意義（P＜0.05）；4 h凍干PRP組細菌計數低于冰凍PRP組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；6 h、8 h、凍干PRP組細菌計數高于冰凍PRP組，差異有統計學意義（P＜0.05），10 h凍干PRP組細菌計數高于冰凍PRP組，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖b）。

4 白色念珠菌組各時間點冰凍PRP與凍干PRP的抑菌活性比較 由模型中自變量的檢驗結果可知，取樣時間、實驗分組、取樣時間*實驗分組的交互項均具有統計學意義（P＜0.05）。冰凍PRP組與凍干PRP組對白色念珠菌的抑制作用時間出現在24 h，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），凍干PRP組細菌計數低于冰凍PRP組（P＜0.05）。6、18、30、36 h時間點冰凍PRP組、凍干PRP組與對照組相比，細菌計數皆高于對照組對白色念珠菌無抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.05）；6、18、30、36四個時間點，冰凍PRP組和凍干PRP白色念珠菌計數相比，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖c）。

5 銅綠假單胞菌組各時間點冰凍PRP與凍干PRP的抑菌活性比較 由模型中自變量的檢驗結果可知，取樣時間、實驗分組、取樣時間*實驗分組的交互項均具有統計學意義（P＜0.05）。冰凍PRP組與凍干PRP組對銅綠假單胞菌未顯示出抑菌作用。18 h內冰凍PRP組、凍干PRP組細菌計數皆高于對照組（P＜0.05），且凍干PRP組與冰凍PRP組比較差異無統計學意義（P＞0.05）（圖d）。

圖1 不同處理的各菌種隨時間增長曲線圖

6 冰凍PRP組、凍干PRP組在6～18 h白色念珠菌的數量和質量都高于對照組 在革蘭染色涂片中，可以觀察到冰凍PRP組、凍干PRP組白色念珠體積大于對照組，數量高于對照組，且出芽生成假菌絲，提示PRP在該時間段內促進白色念珠菌生長（圖2）。

圖2 三組6 h與18 h白色念珠菌革蘭染色涂片（40倍鏡)

討 論

PRP是通過梯度密度離心法從全血中分離獲得的血小板濃縮物，其制備方法主要包括試管手工法、單采血小板法、PRP專用套裝法和標準血袋制備法等多種方法。因無統一標準，導致不同制備方法其成品中所含血小板質量及數量差異較大，白細胞混入量、紅細胞混入量也有差異[6]。近年來越來越多的文獻顯示血小板直接和間接地參與抗菌效應，其一，血小板最早參與微生物抗原識別，激活其他免疫細胞參與防御；其二，血小板可通過裂解釋放多種抗菌肽，可直接抑制細菌生長；其三，血小板還能介導炎性細胞的趨化及調節免疫細胞。因此血小板的數量及質量將直接影響患者的治療效果和實驗結果[7-8]。單采PRP作為研究對象，不僅血小板平均濃度穩定、含量高達1 080×109/L，而且殘留白細胞數（0.032±0.027）×109/L，冰凍之后白細胞失去抗菌特性可最大限度排除白細胞干擾，便于觀察血小板自身的抑菌效果，實驗質量更高、重復性更好。與新鮮PRP相比，本文選用單采血小板法制備的冰凍PRP和凍干PRP作為研究對象，可排除白細胞干擾。經過冰凍和凍干過程血小板被激活，活化后的血小板會分泌更多的趨化因子源性肽，如CXCL4（PF-4）、CXCL7（PBP）、CCL5[9]等；此外，活化血小板更易裂解，產生更多抗菌肽，如HBD-1、HBD-2、HBD-3、HNP-1等[10]；上述趨化因子和抗菌肽可以直接殺死細菌，因此抗菌效果更好[11]。

實驗結果顯示金黃色葡萄球菌計數曲線圖（圖a）中冰凍PRP組、凍干PRP組對細菌計數最少值出現在6 h且細菌計數相對3 h時更低，兩組生長曲線與對照組趨勢均不一致，說明冰凍PRP、凍干PRP釋放足量抗菌肽后對金黃色葡萄球菌存在一定的殺菌作用。大腸桿菌、白色念珠菌計數曲線圖（圖b、c）中冰凍PRP組、凍干PRP組生長曲線與對照組趨勢一致，但在某些時間點低于對照組，說明冰凍PRP、凍干PRP對大腸桿菌、白色念珠菌存在抑菌作用。銅綠假單胞菌計數曲線圖（圖d）中冰凍PRP組、凍干PRP組生長曲線與對照組趨勢一致，且全程高于對照組，說明冰凍PRP、凍干PRP對銅綠假單胞菌無抑菌作用?？梢娎鋬霰４婧蛢龈杀４娴腜RP有特定的抗菌譜，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌生長有抑制作用，對銅綠假單胞菌不僅無抑制作用反而促進其生長，與文獻報道新鮮PRP對上述細菌作用趨勢相一致[12-16]。與冰凍PRP的抑菌作用相比，凍干PRP在早期即表現出較強的抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的作用。這可能與血小板在凍干過程中雖然細胞膜結構完整，胞內顆粒結構仍保留[17]，但因受到擠壓使得細胞變形略顯腫脹，導致細胞膜通透性改變，加速血小板釋放抗菌肽，使得凍干PRP在前數小時內具有明顯的抑制細菌生長的作用。隨著時間推移凍干PRP的抗菌肽被過度消耗，在抑菌作用的后期出現冰凍PRP抑菌效果強于凍干PRP的現象。

冰凍PRP和凍干PRP對實驗中四種菌種生長作用曲線一致。對于金黃色葡萄球菌6 h的細菌計數較3 h少，這表明PRP不僅具有抑菌作用也有殺菌作用，FARGHALI等人[18]證實了這一點，其研究顯示持續給予足夠劑量PRP比只給一次更有效。對大腸桿菌的抑菌作用可以持續到8 h，隨后作用減弱，10 h無抑制作用。MARIANI等人研究顯示PRP只在實驗的早期（2 h）對大腸桿菌有抑制作用，而BIELECKI等人則觀察到較長時間（16～18 h）的抑制作用。這兩組實驗選用新鮮PRP作為研究對象，作者不能排除因制備方法上的差異導致白細胞的存在以及不同的大腸桿菌濃度對實驗結果的影響[19-20]。本研究只在24 h觀察到PRP對白色念珠菌生長的抑制作用，而6～18 h冰凍PRP組、凍干PRP組白色念珠菌的數量和質量都高于對照組，這可能與培養基pH值有關，肉湯培養基初始pH值為7.5±0.2，隨著白色念珠菌的有氧代謝，培養基pH值下降血小板抗真菌活性增強。YEAMAN等研究表明在pH值=7.2時血小板對真菌抑制作用不明顯，而在pH值=5.5時血小板能顯著抑制真菌生長[21]。DRAGO等對新鮮PRP的研究指出只有血小板濃度在較高范圍，才能觀察到PRP對真菌的抑制效果[12]。兩組PRP對銅綠假單胞菌未顯示出抑菌作用，且細菌計數高于對照組，說明相對于生理鹽水，PRP對銅綠假單胞菌的生長有促進作用。

近年來，自體PRP已成為預防或治療術后急慢性創面感染或骨髓炎的潛在選擇。PRP治療與傳統方式相比具有5大優勢：（1）PRP治療能提高慢性傷口的愈合速度以及傷口的完全愈合率[22]。（2）部分藥物可增強PRP的抗菌作用，如他汀類藥物可提高血小板活化，增強PRP對金黃色葡萄球菌的抗菌作用[23]。（3）PRP發揮抑菌作用的機制有別于抗生素，對MRSA同樣具有抑菌作用且病原體不易產生耐藥性[24]。（4）在大量微生物定植的慢性傷口，PRP以及激活后的PRP都能穿透抗生素很難穿透的生物膜[25]。（5）PRP可有效預防深度胸骨切口感染。ENGLERT等人指出，與貧血小板血漿相比，在切口閉合前和胸骨連接前使用PRP可有效降低患者感染率[26]。

綜上所述，冰凍PRP和凍干PRP不僅具有抑菌、殺菌作用，而且具有特定的抗菌譜和時效性，與文獻報道新鮮PRP對相同細菌作用相比，其作用效果更佳，可見冷凍及凍干保存PRP的方式有很好的應用前景。此外，凍干PRP比冰凍PRP更早釋放更多的抑菌肽，前者保存條件更方便，有益于戰時或緊急情況以及邊遠地區的使用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。