慢性丙型肝炎患者抗核抗體譜表達與HCV-RNA載量及HCV基因型的關聯分析*

楊艷艷 白順

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，它是由血液傳播的丙肝病毒引起的肝臟感染[1-2]。據世界衛生組織（WHO）[3]統計，2015年全球新發175萬丙肝病毒感染病例，約有1億人有HCV暴露的血清學依據，大約有7 100萬慢性丙型肝炎患者[4]。據估計，60%～80%的急性HCV感染患者會發展為慢性感染。在20～30年內，大約5%～20%的慢性感染者會發展為肝硬化，1%～5%死于慢性感染（肝硬化和肝細胞癌）[5]。

HCV是一種不穩定的RNA病毒，具有高致突變性，會導致頻繁的基因組突變，使其能逃避免疫系統，因此具有很高的慢性進展率[6]。此外，由于HCV的高度異質性，很難開發出有效的疫苗。自身免疫和病毒感染密切相關，丙型肝炎病毒（HCV）被認為是最常與自身免疫特征相關的病毒之一。因此，HCV不僅與慢性肝臟炎癥有關，而且與一系列肝外并發癥有關。一項薈萃分析報告[7]稱，與未感染HCV的人相比，感染HCV的個體發生與免疫失調（混合性冷球蛋白血癥、淋巴瘤等）和代謝功能障礙（心血管疾病、2型糖尿病等）相關的肝外表現的風險更高。同時，慢性丙型肝炎患者血清中甲狀腺相關抗體[8]、抗核抗體（ANA）、抗平滑肌抗體（SMA）、抗肝腎微粒體抗體（LKM）和抗線粒體抗體（AMA）和類風濕因子（RF）等的表達水平顯著升高[9]。

目前有關丙型肝炎病毒RNA與自身抗體的研究主要集中在與甲狀腺抗體、AMA、抗可提取核抗原抗體（ENA）、RF、抗肝溶質抗原Ⅰ型抗體（LC-1）和LKM等抗體的關系[10-11]，或者是慢性丙型肝炎HCV基因型與甲狀腺功能的關系[12]。而未見慢性丙型肝炎患者抗核抗體譜（LIA-ANAs）的表達與HCV-RNA載量以及HCV基因分型比較分析的相關報道。本研究通過對慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs的表達情況，及其與HCV-RNA載量和HCV基因型的相互關系進行分析，旨在探討慢性丙型肝炎患者產生自身抗體的特征，為臨床診治丙肝患者提供參考。

資料與方法

1 一般資料 選取2019年4月～2022年4月在中國科學技術大學附屬第一醫院就診的149例慢性丙型肝炎患者作為研究對象，同時選取93例體檢者作為健康對照組，兩組的年齡和性別間差異無統計學意義（P＞0.05），比較兩組患者的LIA-ANAs結果并進行統計學分析。149例慢性丙型肝炎患者均檢測其HCV-RNA載量，同時，對56例HCV-RNA陽性患者進行HCV基因分型并進行分析。本研究經醫院論理委員會討論通過（No.2022-RE-225）。

2 病例納入標準 所有病例的診斷均符合中華醫學會感染病學分會和中華醫學會肝病學分會修訂的《丙型肝炎防治指南（2019版）》標準[13]，即超過六個月的HCV感染，或者有六個月以上的流行病學史，或感染日期不明，根據癥狀、體征、實驗室、影像學檢查結果綜合性分析診斷，并排除其他病毒性肝炎及自身免疫性疾病等。

3 方法

3.1 樣本采集：將以上符合標準的人群清晨空腹靜脈血采集3～5 mL，進行離心、分離血清。未能及時檢測的樣本需分離血清，放置-20℃保存，7天內檢測完畢。

3.2 抗核抗體譜LIA-ANAs的檢測采用免疫印跡法：所有符合標準的樣本同時檢測15種自身抗體：抗核小體抗體（AnuA）、抗史密斯抗體（抗Sm抗體）、抗干燥綜合征A型抗原52（SS-A52）、抗組蛋白抗體（AHA）、抗DNA拓撲異構酶I抗體（SCL-70）、抗可溶性核糖核蛋白/史密斯抗體（U1-nRNP/Sm）、抗組氨酰tRNA合成酶抗體 （JO-1）、抗干燥綜合征A型抗原60（SS-A60）、著絲點蛋白B（CENPB）、抗干燥綜合征B型抗原（SS-B）、雙鏈DNA（ds-DNA）、抗細胞漿抗體（ANCA）、抗中性?？贵w（ANGA）、增殖細胞核抗原（PCNA）、核糖體P蛋白（rRNP）。將待測樣本血清按照1∶100倍稀釋后按照試劑說明書進行檢測。靶抗原部位若出現棕色條帶判讀為自身抗體陽性。

3.3 ANA檢測：檢測方法為間接免疫熒光法，試劑產自德國歐蒙公司，待檢樣本按1∶100稀釋后均按照試劑說明書進行檢測。使用EUROSTARII熒光顯微鏡，觀察熒光強度和熒光模式。若ANA≥1∶100則判為陽性。

3.4 HCV-RNA檢測：丙型肝炎病毒核酸測定采用的是PCR-熒光探針法，HCV-RNA熒光定量PCR儀是上?？迫A生物有限公司提供的，HCV-RNA檢測結果＜80 copies/mL為陰性，HCV-RNA檢測結果≥80 copies/mL為陽性。根據試劑盒說明書描述，HCVRNA陽性患者分為高拷貝量（＞1.0×105copies/mL）和低拷貝量（＜1.0×105copies/mL）。所有步驟全部依據廣州達安基因試劑說明書操作。

3.5 HCV基因分型檢測：HCV基因分型采用的是PCR-反向點雜交法，所使用的儀器為美國ABI公司提供的Prism7300熒光定量PCR儀，恒溫震蕩水槽，試劑購自廣州達安基因公司。

4 統計學處理 采用GraphPrism6.0軟件進行分析處理，計量資料以（）表示，兩組間均數比較采用t檢驗；計數資料用百分率表示，其檢驗結果使用χ2檢驗方法進行檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 慢性丙型肝炎患者性別、年齡、HCV-RNA載量比較 在149例慢性丙型肝炎患者中，男性48例（32.2%），女性101例（67.8%）；年齡區間為22～94歲，平均（54.8±14.6）歲。檢測患者血清HCV-RNA，HCV-RNA≥80 copies/mL為陽性，HCV-RNA＜80 copies/mL為陰性；結果顯示HCV-RNA陽性患者56例，陰性患者93例。同時選取93例體檢者作為健康對照組，其中男性40例（43%），女性53例（57%）；年齡26～85歲，平均（52.02±13.59）歲。慢性丙肝組與健康對照組間年齡和性別差異無統計學意義（P＞0.05）。

2 LIA-ANAs在慢性丙型肝炎患者血清中的檢出情況 149例慢性丙型肝炎患者中，共檢出LIA-ANAs陽性者46例，陽性率為30.87%，顯著高于健康對照組6.45%（6/93），且差異有統計學意義（χ2=20.24，P＜0.001）。HCV-RNA陽性組與健康對照組相比，陽性率顯著高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.001)；HCV-RNA陰性組與健康對照組相比，陽性率也高于健康對照組，差異也有統計學意義（P=0.001 8）。而149例慢性丙型肝炎患者LIAANAs陽性和陰性組間年齡（t=0.475，P=0.635）、性別（χ2=2.884，P=0.089 5）差異無統計學意義。HCV患者及健康對照組LIA-ANAs表達情況（見下表1）。

表1 慢性丙肝患者及健康對照組LIA-ANAs表達情況比較

另外，在149例慢性丙型肝炎患者中，有56例HCV-RNA為陽性，其中有25例檢出LIA-ANAs，陽性率為44.6%（25/56），93例HCV-RNA陰性的慢性丙型肝炎患者中，共有21例檢出LIA-ANAs，陽性率為22.6%（21/93），HCV-RNA陽性組患者抗核抗體陽性率44.6%顯著高于HCV-RNA陰性組的22.6%，差異有統計學意義（χ2=7.972,P=0.004 8）。（各抗體具體分析比較見表2）。

表2 HCV-RNA陽性組及陰性組患者LIA-ANAs表達情況比較

3 HCV-RNA陽性的慢性丙肝患者病毒載量與LIA-ANA表達情況關系分析 56例HCV-RNA≥80 copies/mL（即HCV-RNA陽性組），93例HCVRNA＜80 copies/mL（即HCV-RNA陰性組）；進一步將56例HCV-RNA陽性患者分為高拷貝量（＞1.0×105copies/mL）和低拷貝量（＜1.0×105copies/mL）兩組后，兩組患者的LIA-ANAs檢出陽性率間差異無統計學意義（P=0.5789）（見表3）。

表3 慢性丙肝患者HCV-RNA陽性組LIA-ANA表達情況比較

4 慢性丙型肝炎患者血清ANA的檢出情況 56例HCV-RNA陽性組丙肝患者檢出ANA滴度陽性的有22例，93例HCV-RNA陰性組丙肝患者檢出ANA陽性的有27例，表明活動期的慢性丙型肝炎患者的ANA檢出陽性率較非活動期的HCV患者高，但ANA滴度差異無統計學意義（見表4）。

表4 慢性丙肝患者ANA檢測結果比較

5 HCV-RNA陽性丙肝患者基因分型及對應抗核抗體的表達情況 對56例HCV-RNA陽性的丙型肝炎患者進行基因分型，有45例是1b型，占比80.4%，11例為非1b型，占比19.6%。其中有24例丙肝患者的抗核抗體呈陽性，這24例患者有21例基因分型為1b型，占比87.5%；3例基因分型為非1b型，占比12.5%；3例非1b型分別包括1例2a型、1例2b型、1例6a型?？购丝贵w檢測陽性的患者對應的基因型別最多的是1b型，但差異無統計學意義（見表5）。

表5 56例HCV-RNA陽性丙肝患者基因分型及對應的自身抗體表達情況

討 論

HCV嗜淋巴細胞性代表了病毒相關免疫疾病發病機制中最相關的步驟[14]。HCV通過先天性細胞的功能調節和適應性免疫反應損害免疫系統，導致疾病的慢性狀態，影響這些患者對抗病毒治療的反應。HCV感染誘導機體產生自身免疫反應的異質性表現不同，輕者僅表現為患者血清中出現自身抗體，重者可以出現系統性的自身免疫疾病或者器官特異性。

實驗、病毒學和臨床證據已證明HCV在系統性自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L濕性關節炎、干燥綜合征、溶血性貧血和嚴重血小板減少癥），以及器官特異性自身免疫性疾病，如自身免疫性肝炎[15]、甲狀腺疾病[16]和糖尿病[17-20]中的觸發作用。據報道，HCV感染的患者自身抗體陽性率較高，其中混合冷球蛋白占60%～80%、RF占70%、抗核抗體20%～40%、抗心磷脂抗體（aCL）20%～15%、抗甲狀腺抗體12%和抗平滑肌抗體7%[21-22]。本文通過回顧性分析慢性丙型肝炎患者抗核抗體譜的表達與HCV-RNA載量以及HCV基因分型的關系，探討活動期的慢性丙型肝炎患者產生自身抗體的特征和意義。

本研究發現，149例慢性丙型肝炎患者中共有46例檢出LIA-ANAs，陽性率為30.87%，顯著高于健康對照組，差異有統計學意義。這與魏秋靜等報道的病毒性肝炎組的ANAs表達率顯著性升高的結論是一致的[23]。本研究中149例慢性丙型肝炎患者，有56例HCV-RNA≥80 copies/mL，93例HCV-RNA＜80 copies/mL。LIA-ANAs陽性組的病毒RNA載量高于陰性組，LIA-ANAs陽性組和陰性組間HCV-RNA載量的差異有統計學意義。與賀琤雯等[24]報道的LIA-ANAs陽性組丙肝患者HCV-RNA載量高于陰性組的結論是一致的，提示丙型肝炎病毒感染可伴有明顯的自身免疫現象，而患者自身抗體產生的原因可能是患者感染HCV后導致體內細胞膜抗原成分發生改變或者肝臟細胞膜的通透性增加[25]。然而將56例HCV-RNA陽性患者分為高拷貝量和低拷貝量兩組后，兩組患者的LIAANAs檢出陽性率間差異無統計學意義。本研究中，我們納入的病例數相對較少，慢性丙肝患者自身抗體檢出率與HCV-RNA載量之間是否相關還需進一步擴大研究對象來進行驗證。

本研究還發現，HCV-RNA陽性組患者抗核抗體陽性率44.6%，顯著高于HCV-RNA陰性組的22.6%，差異有統計學意義。而且，HCV-RNA陽性組細胞漿抗體的例數，高于HCV-RNA陰性組，且差異有統計學意義。其余14項抗核抗體的單項抗體，HCV-RNA陽性組和陰性組間差異無統計學意義。HCV-RNA是反應病毒水平的一項重要指標[26-27]，其病毒載量與丙肝的療效和預后有著密切關系[28]，一些研究表明，這些自身抗體的顯著增加可能與更加嚴重的肝硬化和肝損害有關，并可能是治療預后差的相關因素[29]。

HCV-RNA陽性組丙肝患者檢出ANA滴度陽性例數較HCV-RNA陰性組多，但ANA滴度差異無統計學意義，表明活動期的慢性丙型肝炎患者的ANA檢出陽性率較非活動期的HCV患者高，但差異無統計學意義。正如文獻中報道慢性丙肝患者丙肝病毒復制能力與自身免疫反應有一定的相關性[30]，本研究結果與這一結論也是較為吻合的。

HCV分為6個主要基因型和多種亞型（如1a、1b、2a等）[31]?；蛐?和2主要在西非，而基因型3主要在南亞[32]，基因型4、5和6分別主要在中東和中非、南部非洲和東南亞[32]。不同的HCV基因型和亞型對目前可用的抗病毒藥物的耐藥程度各不相同，從而使治療決策以基因型為導向[31，33]。因此，確定感染基因型是HCV治療的基礎，有助于確定使用哪種抗病毒藥物、劑量以及治療持續時間[34]。我國較常見的是1b, 2a, 3a, 3b, 6a型，主要以1b和2a型為主，其中1b型占較大比例[35-36]，本研究中，56例HCV-RNA陽性丙肝患者中有45例為1b型（80.4%）與文獻報道比較一致。其中抗核抗體結果為陽性的患者對應的基因型別最多的也是1b型，但差異無統計學意義。這與我們的樣本量可能也有一定關系。

在所有LIA-ANAs陽性結果中，檢出率最高的

是SSA52，在HCV-RNA陽性組中，25例LIA-ANAs

陽性患者有11例存在SSA52陽性，比例高達48%（11/25）。在HCV-RNA陰性組中，21例LIA-ANAs陽性患者有8例存在SSA52陽性，比例高達38.1%（8/21）?？筍SA52抗體為抗SSA抗體的一種，在多種自身免疫疾病中被檢出，尤其在干燥綜合征（SS）和系統性紅斑狼瘡（SLE）中尤為常見，但與干燥綜合征關系更加密切，也可見于糖尿病、多種結締組織病、病毒性肝炎等疾病中[37]。 然而單獨 SSA52 抗體陽性僅作為自身免疫性疾病的預警和提示，不具有診斷特異性，需與抗 SSA60抗體、抗SSB抗體及ANA等聯合檢測可提高SS診斷的特異性和靈敏性。

綜上所述，丙型肝炎病毒感染患者血清中抗核抗體陽性率顯著升高，且與HCV-RNA載量相關，不同基因型的HCV對治療藥物的敏感程度不同，確定HCV感染者基因型有助于臨床治療和合理用藥。因此，在臨床上對活動期慢性丙型肝炎患者抗核抗體、HCV-RNA 、基因分型等指標的監測，有利于指導臨床醫生早期干預以防止并發癥的發生。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突