Gli1陽性間充質干細胞在牙及牙周組織中的分布及作用

李佩桐 時彬冕 許春梅 謝旭東 王駿

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院牙周病科 成都 610041

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的異質性多能干細胞群。MSCs不僅是支持組織生長發育的重要干細胞群，也在組織損傷修復和再生中發揮重要作用。特定的表面標記物是MSCs的重要特征，也是其分離、鑒定的主要依據。根據國際細胞治療學會（The International Society for Cellular Therapy，ISCT）的定義，MSCs的表面標記物特征為CD105、CD73和CD90的表達呈陽性，CD45、CD34、CD14（CD11b）、CD79α（CD19）和人類白細胞抗原-DR （human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）的表達呈陰性[1]。目前關于MSCs的研究大多圍繞MSCs體外分離、鑒定、培養和體內細胞移植進行，然而由于體內外環境的巨大差異，體外研究的表面標記物表達與體內效應之間并非完全對應[2-3]。研究MSCs特殊的體內標記物對于闡明其在體內的分布及作用至關重要。近年來，研究者們通過細胞譜系示蹤技術發現Gli1是多種組織器官中間充質干細胞可靠的體內標記物，在牙[4]、 牙 周組 織[5]、 骨[6]、腎[7]、 肝[8]、 肺[9]、心 臟[10]和肌肉[11]等組織器官中均有報道。本文對Gli1陽性（Gli1+）MSCs在牙及牙周組織中的分布與作用的研究進展作一綜述。

1 Gli1和Hedgehog（Hh）信號通路

Nüsslein-Volhard等[12]在果蠅的遺傳學研究中發現了Hedgehog（Hh）信號通路。Hh信號通路是一條高度保守的信號通路，在胚胎發育中參與細胞分化、細胞間相互作用和組織形成。經典Hh信號通路是由七跨膜轉導蛋白Smoothened（Smo）介導的一類細胞內級聯反應，在組織生長發育和損傷修復中發揮重要作用[4,13-14]；非經典Hh信號通路是不依賴于Hh配體或Smo蛋白的一種潛在信號通路，在腫瘤相關研究[15]中發現，非經典Hh信號通路中Gli轉錄因子的異常激活與惡性腫瘤的形成相關。

Patched1（Ptch1）是細胞膜上含有12個跨膜區段的受體蛋白，是經典Hh-Gli1信號通路的主要受體[16]。在非激活狀態下，Ptch1通過抑制Smo的信號傳導阻斷經典Hh信號通路[17]。當Hh蛋白與Ptch1結合時，Ptch1對Smo蛋白的抑制作用被解除并傳遞Hh信號到細胞質，激活Ci轉錄因子家族（Cubitus interruptus，在脊椎動物中多為Gli）并移位到細胞核，影響下游靶基因轉錄[18-20]。Ci/Gli家族中，Gli1是Hh信號通路中一個重要的轉錄因子。研究[4,21]表明：Gli1+細胞參與調控牙及牙周組織的發育、再生和穩態維持。

2 Gli1+MSCs在切牙中的分布及作用

2.1 Gli1+MSCs的鑒定與在切牙中的分布

嚙齒動物的切牙在一生中持續生長[22]，其下頜切牙的上皮與間充質區域每個月都能完全更新[23]，是研究干細胞的經典模型。早期研究表明，Gli1[24]與NG2[25]分別是牙齒上皮干細胞與MSCs的標記物。為探究Gli1能否作為牙齒MSCs的標記物，Zhao等[26]構建了Gli1-LacZ小鼠，并檢測Gli1在切牙間充質的表達，結果顯示：Gli1的表達模式與MSCs具有相似性。對Gli1+細胞與NG2+細胞進行體外培養發現：近95%具有CD146、CD105、Sca1等MSCs經典標記物的細胞來自Gli1+細胞，而NG2+細胞占比小于10%，這說明Gli1更適合作為牙齒MSCs的標記物[26]。

Zhao等[26]研究顯示：Gli1+MSCs在切牙中主要分布于頸環，增殖于短暫擴充細胞（transit amplifying cells，TACs） 區域，對Gli1+MSCs與TACs的雙重標記也證實了它們具有相同的時空分布規律。同時，譜系示蹤表明切牙頸環中央的神經血管束（neurovascular bundle，NVB） 是Gli1+MSCs 的干細胞龕，為其增殖分化提供營養支持與信號調控。在4周的時間里，起始于頸環的Gli1+細胞即可到達切牙頂端，替代全部間充質細胞。這些細胞沿牙本質內表面排列，呈現出向頂端分化程度逐漸增高的趨勢[26]。

2.2 Gli1+MSCs在切牙生長發育中的作用

Gli1+MSCs對切牙牙本質的發育具有重要作用。有學者認為上皮的局部增厚是該處牙胚開始發育的標志[27-28]，而增厚上皮周圍的牙間充質中能檢測到Gli1的表達[4]。Dassule等[29]在上皮發育后敲除Sonic hedgehog（Shh）基因，觀察到間充質中Gli1與Ptch1的表達均降低，MSCs形態與排列不規則，并且切牙牙齒體積明顯小于正常水平。在牙胚發育過程中，Zhao等[26]明確了由NVB感覺神經分泌的Shh蛋白可以激活其動脈周圍的Gli1+細胞，促進間充質的產生，驗證了Shh對切牙的生長發育具有促進作用。Chen等[30]還發現了位于MSCs和TACs之間的Runx2+/Gli1+細胞亞群，這些輔助細胞可以幫助維持NVB的功能，從而調節切牙生長速率。

當Gli1+細胞離開NVB進入TACs區域后，激活的骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號將促進其向成牙本質細胞分化[31]。當切牙發育至鐘狀期，牙周膜通過分泌細胞黏合素（Tenascin-W/TNN），參與調節Gli1+細胞的功能。缺乏細胞黏合素時，切牙間充質中Gli1表達、MSCs增殖以及根尖間充質細胞分化均受到明顯抑制[32]。

2.3 Gli1+MSCs在切牙維持穩態中的作用

Gli1+MSCs已被證實在切牙間充質細胞的快速更新中發揮重要作用[33]。小鼠切牙的持續磨耗使得切端的成牙本質細胞與礦化組織不斷被消耗[34]，而Gli1+細胞可以通過定向遷移[35]與形成修復性牙本質[26]的方式補充切牙頂端。這一過程依賴的BMP信號在成牙本質細胞中高度活躍，向其提供反饋以維持切牙的穩態平衡。反之，Gli1+細胞中BMP信號缺失將導致切牙更新中斷[31]。Shi等[31]還發現：Wnt/FGF信號的激活與Gli1+MSCs在TACs區域的快速增殖高度相關，而BMP信號則可以抑制Wnt/FGF信號，并且促進TACs向成牙本質細胞的分化，表明BMP信號對Gli1+MSCs增殖與分化均發揮重要調控作用。

3 Gli1+MSCs在磨牙中的分布及作用

3.1 Gli1+MSCs在磨牙中的分布

Gli1+細胞在磨牙牙胚發育中廣泛分布，而在發育初期主要分布于牙髓頂端，隨著時間的推移，Gli1信號在牙髓中心表達增強，在新生牙根的根髓中也檢測到大量子代細胞[36-38]。這樣的時空變化與牙齒從牙冠向牙根發育的順序一致。Gli1+細胞在磨牙中擁有與切牙相似的細胞龕，這些細胞主要環繞NVB，并受到感覺神經分泌的Shh信號調控。隨著磨牙發育，Gli1+細胞逐漸分化為成牙本質細胞，而Gli1+細胞比例不斷降低，最終在分化末期的成牙本質細胞中未檢測到Gli1的表達[5]。

3.2 Gli1+MSCs在磨牙生長發育中的作用

Hardcastle等[39]證實：在磨牙牙胚發育初期，Gli1在上皮組織與周圍的間充質中均有表達。Li等[37]觀察到牙本質小管由更多的分支小管組成，被Gli1標記的成牙本質細胞突就分布于這些小管中。Liu等[38]應用Gli1-CreERT2/+;R26RDTA/+轉基因小鼠，在磨牙牙根發育前特異性誘導消融Gli1+MSCs，導致磨牙牙根發育障礙，形成短根。這些結果表明，Gli1+MSCs是磨牙牙根發育的重要干細胞，Gli1+細胞對磨牙牙本質形成、牙根的生長發育起著關鍵作用。

在磨牙的發育過程中，多種信號參與調節Gli1+MSCs的功能。Shh信號的缺失將導致磨牙體積顯著減小與Gli1表達下調，MSCs向成牙本質細胞的分化也受限[29]。Feng等[40]鑒定了磨牙間充質中BMP信號下游的多個轉錄因子（Pax9、Klf4、Satb2、Lhx8等），在BMP信號的作用下，與維持干細胞未分化狀態相關的轉錄因子（如分布于牙根的Pax9）被抑制，而與分化相關的轉錄因子（如分布于牙源性區域的Klf4、Satb2、Lhx8）則被激活。這樣的空間特異性表達有助于Gli1+MSCs的分化，從而促進磨牙發育。

4 Gli1+MSCs在牙周組織中的分布及作用

4.1 Gli1+MSCs在牙周組織中的分布

Gli1-LacZ小鼠被廣泛用于研究體內Gli1基因的表達模式。Men等[5]對Gli1-LacZ小鼠第一磨牙切片進行X-gal染色，在小鼠出生的第1、7和14天（P1、P7和P14），整個牙胚中都發現存在Gli1+細胞。在P21，Gli1+細胞主要分布在根尖牙周膜中，少量分布在牙髓、牙槽骨骨髓間隙和非根尖牙周膜內，而在骨細胞、成牙骨質細胞和成牙本質細胞中基本沒有分布。王韻等[21]同樣發現：3周齡小鼠牙周膜內含有大量的Gli1+細胞（尤其在根尖1/3處）；隨著時間推移，牙周膜內Gli1+細胞的數量不斷減少。

Men等[5]進一步通過組織透明化成像技術，從三維立體視角可視化及量化分析Gli1-CreERT2;Ai14小鼠磨牙中Gli1+細胞的空間分布模式，發現60%的Gli1+細胞位于根尖牙周膜間隙，18%位于根中部牙周膜間隙，10%位于根頸部牙周膜間隙，還有10%在牙槽骨骨髓間隙或牙髓中，而在牙骨質和牙槽骨的成骨細胞中沒有Gli1+細胞的分布。

以上研究表明，Gli1+細胞在早期牙周組織中主要分布在根尖牙周膜，并隨著時間的推移，牙周膜內Gli1+細胞的數量不斷減少。

4.2 Gli1+MSCs在牙周組織生長發育中的作用

Men等[5]通過體外實驗證實Gli1+細胞具有成纖維、成骨和成軟骨分化潛能。王韻等[21]應用細胞譜系示蹤技術結合免疫熒光染色發現，自3周齡小鼠誘導標記Gli1+MSCs后21 d，牙周膜內的Gli1+細胞及其子代細胞表現出多向分化的潛能。在牙周膜內，大量Gli1+細胞群分化為成纖維細胞，并表達骨膜蛋白。隨著牙骨質的發育，部分Gli1+譜系細胞分化為牙骨質細胞，同時表達牙骨質基質蛋白1。Xie等[41]研究了Gli1+細胞在牙骨質發育中的調控機制，發現在Gli1+細胞中持續激活Wnt/βcatenin信號通路可導致牙骨質的過度增生；反之，敲除Gli1+細胞的β-catenin基因，下調Wnt信號活性將抑制Gli1+細胞向成牙骨質細胞的分化。在牙槽骨中，Gli1+細胞及其子代細胞逐漸分化為成熟的骨細胞。綜上，Gli1+細胞具有分化成纖維細胞、牙骨質細胞和骨細胞的潛能。Gli1+細胞是牙周組織再生的潛在種子細胞[5]。

4.3 Gli1+MSCs參與牙周組織的損傷修復和穩態維持

Men等[5]通過構建Gli1-CreERT2;Ai14小鼠磨牙根分叉損傷模型，應用細胞譜系示蹤技術發現：在損傷后第7天，Gli1+細胞來源的細胞分化為根分叉區部分的牙周膜成纖維細胞；第30天，損傷根分叉區幾乎全部牙周膜細胞和部分骨細胞都由Gli1+細胞及其子代細胞分化而來，提示Gli1+細胞對于牙周組織損傷后修復有重要作用。

Gli1+MSCs還參與了正畸力誘導下的骨改建。Liu等[42]建立小鼠正畸牙移動（orthodontic tooth movement，OTM）模型，與對照組相比，OTM組牙周膜中的Gli1+細胞數量及比例在張力側增加，在壓力側減少，提示Gli1+細胞可能參與牙移動過程中牙周膜的穩態維持。此外，對小鼠使用小劑量Gli1抑制劑GANT61或敲除Gli1基因，發現小鼠牙周膜壓力側變窄，張力側變寬，表明抑制Gli1活性可導致牙齒移動受限和抑制牙槽骨重建。Yap蛋白（Yes-associated protein）是一種將機械信息轉化為細胞生物信息的機械傳感器。研究[43-44]發現，Gli1+細胞的細胞核內表達活化的Yap蛋白。在機械應力作用下，Yap去磷酸化后被激活，進而轉移到細胞核內激活下游基因轉錄，提示Yap的活化是Gli1+細胞響應機械力刺激的關鍵。綜上，Gli1+細胞在調控牙周組織改建中發揮關鍵作用。

5 總結與展望

Gli1是MSCs重要的體內標記物，Gli1+MSCs參與全身多個器官的生長發育與穩態維持。在口腔中，Gli1+MSCs主要分布于頸環、牙周膜等處的NVB周圍，在一定條件下可被誘導分化為成牙本質細胞、成纖維細胞、成牙骨質細胞和成骨細胞（圖1），從而在牙、牙周組織的發育、損傷修復和改建中發揮重要作用。

圖1 Gli1+MSCs在牙及牙周組織的分布與分化Fig 1 The distribution and differentiation of Gli1+MSCs in teeth and periodontal tissues

近年來，Gli1+MSCs的多向分化潛能在細胞療法與再生醫學方面獲得越來越多的關注，使得Gli1+MSCs具有良好的臨床應用前景。同時，多學科領域交叉也為Gli1+MSCs的研究提供了新的思路與方向：如Gli1+MSCs與外泌體[45]、生物材料[46-47]等領域的結合均取得了不錯的成果。然而，就目前的研究而言，仍缺乏對Gli1+MSCs在體內特性與作用的全面認知，相關體內研究仍有待開展，這在一定程度上限制了其臨床應用。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。