基于網絡藥理學探討中藥鴉膽子治療非小細胞肺癌的作用機制

桑舒柳，丁蓉珍，姜靖潔，龔亞斌*

1 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院腫瘤科，上海，200437。

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，占所有癌癥死亡的18.4%[1]。肺癌分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)，其中約85%為非小細胞肺癌[2]。隨著醫學的發展，中醫藥可以改善腫瘤分子靶向藥物耐藥、改善多藥耐藥、逆轉化療耐藥、協同增效及放療增敏，同時減輕放、化療副作用[3]。中醫藥在治療惡性腫瘤的應用范圍越來越廣，通過增效減毒提高患者的生存期和生活質量。

中藥鴉膽子（Brucea javanica）為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實，具有清熱解毒、截瘧、止痢的功效；外用可治療腐蝕贅疣[4]。鴉膽子的臨床應用大多是煉成鴉膽子油后被制備成乳劑或者軟膠囊，輔助治療各種癌癥[5]，聯合放、化療提高其抗癌療效和安全性，緩解腫瘤惡病質[6-10]。大量研究表明鴉膽子能通過觸發活性氧(ROS)的生成、細胞色素C 的釋放、線粒體凋亡通路的激活以及一系列與癌癥相關的信號通路和蛋白的調控來抑制腫瘤細胞增殖凋亡[11,12]，但其治療非小細胞肺癌的具體活性成分和機制尚不明確。

網絡藥理學能通過可視化數據采集分析預測藥物治療疾病的靶點和機制。因此，本文通過網絡藥理學對鴉膽子治療非小細胞肺癌的主要活性成分和作用相關通路和靶點進行探討，以期為臨床治療疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 化合物有效成分及潛在靶點的收集

以“鴉膽子”為檢索詞，在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（http: //tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索其包含的化學成分，滿足生物利用度（OB）≥ 30%，類藥性（DL）≥0.18 的化合物被選擇。查閱文獻補充 TCMSP 中未預測到的有效化合物成分，在化源網搜CAS 號隨后在Pubchem 提取化學成分相對應的SMILE 號，在Swiss Target Prediction 數據庫中找出SMILE 號對應的靶點。

1.2 治療靶點的篩選

設置關鍵詞為“non-small cell lung cancer”，檢索Genecard （www.genecards.org） 和DisGeNET（www.disgenet.org）數據庫，選擇“Homo sapiens”，檢索出NSCLC 靶點。取鴉膽子活性成分靶點與疾病靶點的并集作為“鴉膽子”治療NSCLC 的潛在靶點，繪制韋恩圖。

1.3 構建鴉膽子活性成分-作用靶點網絡圖

將上面篩選出的靶點導入Cytoscape Version 3.7.2 軟件，構建鴉膽子活性成分-非小細胞肺癌靶點網絡，并進行網絡拓撲學分析，根據節點的度值篩選出其治療NSCLC 的核心化合物。

1.4 構建蛋白相互作用（PPI）網絡

將 1.2 篩選出的靶點輸入STRING（https://string-db.org） 平臺，選擇“Homo sapiens”，置信度設為 0.7，獲得蛋白互作關系。然后導入Cytoscape-3.7.2 中,生成PPI 網絡圖，以節點度值超過其中位數值、BetweennessCentrality 大于中位數值為標準篩選出重要靶點。

1.5 GO 與 KEGG 富集分析

將上述1.4 的重要靶點導入Metascape（http://metascape.org/）平臺分析，選擇“Homo sapiens”，進行GO 和 KEGG 通路富集分析。

1.6 篩選鴉膽子作用于NSCLC 的核心靶點

將1.4 篩選出的重要靶點導入GEPIA,http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)數據庫，選擇“總體生存”和“中位數”作為篩選條件。P＜ 0.05 和P(HR) ＜ 0.05 作為LUAD 數據集的顯著性閾值來篩選鴉膽子作用于NSCLC 的核心靶點。

1.7 化合物-靶點-通路圖

通過R 語言畫出鴉膽子化合物-靶點-通路關系圖。

2 結果

2.1 鴉膽子活性成分篩選和疾病靶點篩選

通過已有文獻報道及TCMSP 以“OB≥30%、DL≥0.18”篩選出鴉膽子活性化合物共16 種。刪除化合物對應的靶點重復值后進行合并，共獲得靶點230個。通過GenCards 等數據庫收集到NSCLC 相關靶點共3813個，將鴉膽子和疾病靶點進行映射取交集共得到152個交叉靶點，即鴉膽子治療NSCLC 靶點，見圖1。

圖1 鴉膽子和肺癌交集靶點的韋恩圖

2.2 構建與分析鴉膽子活性成分-靶點網絡

如圖2，成功構建了鴉膽子活性成分-靶點網絡。其中，自由度排名前十的鴉膽子活性成分見表1。

表1 鴉膽子主要活性成分

圖2 鴉膽子活性成分-疾病靶點網絡圖

2.3 PPI 網絡構建與分析

將鴉膽子治療NSCLC 的152個潛在靶點導入STRING 平臺,根據置信度＞0.7 進行篩選，隨后導入Cytoscape-3.7.2 將結果可視化。以BetweennessCentrality ＞中位數值（0.00264092），degree ＞中位數值（5）為參數篩選出重要靶點共50個，具體見圖3。

圖3 鴉膽子PPI 網絡圖

2.4 GO 與KEGG 信號通路分析

對鴉膽子的50個重要靶點進行GO 和 KEGG 富集分析，其中生物過程主要包括蛋白質磷酸化、調控細胞周期等，細胞成分主要包括周期蛋白依賴的蛋白激酶、轉移酶復合體等，分子功能主要包括蛋白絲氨酸激酶活性等。KEGG 分析顯示鴉膽子治療NSCLC 涉及多種信號通路，主要包括：VEGF 和PI3KAkt 信號通路等，見圖4。

圖4 鴉膽子富集分析網絡圖

2.5 鴉膽子成分-NSCLC 治療靶點-通路網絡圖的構建

利用Cytoscape 建立鴉膽子治療NSCLC 的活性成分-靶點-通路網絡。此網絡由73個節點和364條邊組成(圖5)。

圖5 鴉膽子治療NSCLC 成分-靶點-通路圖

2.6 鴉膽子核心靶點分析

在GEPIA 數據庫中搜索39個重要靶點,通過總體生存率篩選出了14個核心靶點(表2)。然后，我們繪制了鴉膽子治療非小細胞肺癌化合物-靶標-通路的關系圖（圖6）。

表2 鴉膽子核心靶點分析

接上 表2 鴉膽子核心靶點分析

接上 表2 鴉膽子核心靶點分析

圖6 鴉膽子治療NSCLC 成分-核心靶點-通路分析圖

2.7 鴉膽子治療NSCLC 成分-核心靶點-通路分析

我們繪制出鴉膽子治療NSCLC 成分-核心靶點-通路圖，即鴉膽子8 種化合物通過11個核心靶點作用于前20個通路上（通路上沒有富集的靶點被剔除）。

3 討論

本研究通過網絡藥理學的方法分析了鴉膽子治療NSCLC 的作用機制。通過活性成分-疾病靶點的網絡分析顯示鴉膽子共有16 種化合物。根據鴉膽子治療NSCLC 成分-靶點-通路圖，鴉膽子同一化合物能調控不同靶點，而同一靶點又能調控不同通路，其中木犀草素、鴉膽亭和鴉膽醇共同靶向CDK1 和PTGS2，主要作用于VEGF 信號通路，從而抑制肺癌血管生成。

木犀草素是一種多酚類植物黃酮類化合物，研究表明木犀草素具有良好的抗腫瘤活性[13,14]，通過多種機制抑制癌細胞的生長，如刺激腫瘤細胞凋亡、抑制細胞復制、腫瘤生長、提高耐藥性、防止癌細胞侵入和轉移[15]。研究表明木犀草素能顯著抑制kras 突變型肺癌的增殖，并下調IFN-γ誘導的PD-L1 表達，從而提高kras 突變肺癌的抗腫瘤免疫能力[16]。Zhang M 等[17]通過體內外實驗發現木犀草素能通過下調LIMK1 抑制肺癌細胞增殖。Wu B 等[18]發現木犀草素單獨或聯合腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）均可降低A549 細胞和H1975 細胞的活力，增加細胞凋亡。鴉膽亭 (bruceantin,BCT)是鴉膽子中的主要有效成分，1973年首次被發現可以從鴉膽子中分離,并具有抗白血病[19]和抗腫瘤作用[20]。研究發現[21]鴉膽亭能上調miR-29a-3p 抑制NSCLC H1299 細胞的增殖、遷移與侵襲。查閱文獻發現有關鴉膽亭治療NSCLC 的研究比較鮮見，其作用于NSCLC 的機制值得進一步深入探討。有研究表明鴉膽醇是一種新型的STAT3 抑制劑，在結腸癌體外和體內實驗中能抗腫瘤[22]。

細胞周期依賴性激酶1（Cyclin-dependent kinases 1,CDK1）參與細胞周期、有絲分裂等過程[23]。研究發現CDK1 是肺腺癌潛在預后分子標志物[24]，而miR-496 能降低CDK1 的表達使肺癌A549 細胞凋亡[25]，同時Chk1 抑制劑在體內外實驗中對小細胞肺癌具有抗腫瘤作用，并能延緩其耐藥[26]。環氧合酶-2（COX-2）是一種誘導型酶，由PTGS2 基因編碼，被認為是“快速反應基因”[27]。研究發現COX-2 在肺腺癌中高表達[28]，而COX-2 抑制劑能抑制肺癌細胞增殖，促肺癌細胞凋亡[29]。

GO 富集分析顯示，鴉膽子的作用靶點與蛋白質磷酸化、調控細胞周期等生物過程，蛋白絲氨酸激酶活性等分子功能及周期蛋白依賴的蛋白激酶、轉移酶復合體等細胞成分有關。KEGG 結果顯示，鴉膽子治療 NSCLC 涉及多種信號通路。其中，在癌癥發生發展進程中，VEGF 在腫瘤血管生成和血管生成依賴性轉移中起著關鍵作用[30]。研究發現癌細胞分泌VEGF 的方式為自分泌和旁分泌，激活癌細胞中的VEGF/VEGFR 信號通路達到促進腫瘤生長的目的[31]。此外，VEGF 在肺腺癌患者中高表達，表明其預后較差[32]，在臨床上，抗血管生成藥物能抑制NSCLC，聯合化療、靶向或免疫治療等可發揮協同作用[33]。

本研究通過網絡藥理學，篩選出鴉膽子中的主要活性成分，構建了活性成分-疾病靶點之間的網絡圖，并得出了鴉膽子治療 NSCLC 潛在的作用靶點及相關通路，為進一步的試驗驗證和臨床治療方面提供了理論基礎。然而本研究的數據主要從各個平臺數據庫中獲取，具有一定的片面性和局限性，故具體結果仍需進一步實驗驗證。