黃甲軟肝顆粒對小鼠急性肝損傷和肝纖維化的保護作用研究

高曉新 李雪梅 王佳帥 朱春玥 曹春然

北京市藥品檢驗研究院藥理毒理室，國家藥品監督管理局創新藥物安全研究與評價重點實驗室，中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京，102206，中國

肝臟是人體重要的器官，具有消化、吸收、代謝、解毒和造血等多種功能，是人體解毒、物質貯藏和代謝的重要場所。多種因素可致急性肝損傷，應及時去除病因并加以治療，長期的肝損傷會導致肝組織的纖維化，還可能進一步引起肝硬化、肝癌的發生。因此防治急性肝損傷和肝纖維化具有重要的臨床意義。

組方黃甲軟肝顆粒，主要成分是黃芪、葛根、靈芝、鱉甲、三七等，基于中醫中藥理論具有理氣疏肝，活血軟堅的功效。有研究發現，黃芪粗提物、黃芪總皂苷、黃芪甲苷對大鼠急性肝損傷和肝纖維化均具有緩解作用［1-5］，同時葛根素也具有一定的治療急性肝損傷和抗肝纖維化作用［6-9］。本文通過建立小鼠急性肝損傷和肝纖維化模型來考察黃甲軟肝顆粒對肝的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級ICR 小鼠、BALB/c 小鼠，體質量均為（18～22）g，生產許可證號：SCXK（京）2016-0011，使用許可證號：SCXK（京）2015-0033，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 藥物與試劑

黃甲軟肝顆粒，由A 公司提供，批號：HJ 170206；復方鱉甲軟肝片，由A 公司提供，批號：20170604。

D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-Gal N），批號20170102，Sigma 公司；刀豆素蛋白A（concanavalin A，Con A），批號066K7031，Sigma 公司。

1.1.3 儀器

AU400 型 生化 儀，OLYMPUS；XH6080 γ計數 器，西核儀廠；Typ3151 準自動化化學發光儀，德國Lumino。

1.2 實驗方法

1.2.1 D-Gal N 致小鼠急性肝損傷的作用

選用健康ICR 小鼠，體質量（18～20）g，84 只，雌雄各半，按體質量隨機分成6 個組，分別為陰性對照組、模型組、陽性藥組（復方鱉甲軟肝片，2.0 g·kg-1），黃甲軟肝顆粒高、中、低劑量組（生藥20.6、10.3、5.2 g·kg-1）。按20 mL·kg-1每天小鼠灌胃給藥一次，陰性對照組和模型組灌胃同體積的去離子水，連續給藥14 d。給藥后d 13，除陰性對照組以外，其余各組小鼠均腹腔注射D-Gal N 0.8 g·kg-1，禁食禁水16 h 后，于末次給藥后60 min，小鼠眼底靜脈叢取血，測定血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）的值［10］。摘取肝臟、脾臟稱重，計算肝指數、脾指數（g·10 g-1）

組織病理學檢查：選取相同部位肝臟制作HE 切片。每張切片隨機選3 個視野，分別按照下面的標準根據病變程度進行病理分級，并取其平均值作為該動物肝臟的病理分級。各組與模型對照組比較，進行統計學分析。

病變程度分級標準：0 級：肝臟組織結構正常，未見異常病變；1 級：肝細胞輕度濁腫；2 級：肝細胞濁腫/水樣變/脂肪變性，肝灶狀壞死，壞死面積較小，壞死灶內可見均質圓球狀嗜酸性小體；3 級：肝細胞濁腫/水樣變/脂肪變性、肝灶狀壞死，壞死灶面積較大，嚴重時發生融合。壞死灶內可見均質圓球狀嗜酸性小體，數量較多。

1.2.2 Con A 致小鼠肝纖維化小鼠的作用

選用健康BALB/c 小鼠，體質量（18～20）g，96 只，雌雄各半，按體質量隨機分成陰性對照組、模型組、陽性藥組（復方鱉甲軟肝片，2.0 g·kg-1）、黃甲軟肝顆粒高、中、低劑量組（生藥20.6、10.3、5.2 g·kg-1）。除陰性對照組以外的動物按照12.5 mg·kg-1尾靜脈注射Con A（Con A以無菌的PBS 配制成0.625 mg·mL-1的濃度，小鼠按照0.2 mL·10 g-1尾靜脈注射），陰性對照組動物注射同體積的無菌PBS，各組每周注射1 次，共注射7 次［11-12］。于第4 次注射當天，各組開始灌胃給藥，陰性對照組及模型組給予同體積去離子水，1 次·d-1，連續給藥4 周（遇到注射日，則注射與給藥分別進行）。于末次給藥后 24 h，小鼠眼靜脈叢取血，分離血清，測定ALT 和AST，摘取肝、脾稱重，計算肝脾指數（g·10 g-1），各組與模型比較，進行統計學分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0 進行統計處理，病理分級數據采用卡方檢驗，其它數據用組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 D-Gal N 致小鼠急性肝損傷的作用

小鼠血清ALT、AST 的變化如Tab.1 所示。與陰性對照組比較，小鼠腹腔注射D-Gal N 后血清ALT、AST 顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，黃甲軟肝顆粒各劑量組及陽性藥組的ALT、AST 均顯著降低（P＜0.01）。

Tab.1 Effects of Huangjiarangan granules on serum biochemistry of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Tab.1 Effects of Huangjiarangan granules on serum biochemistry of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；**P＜0.01 vs model group.

各組小鼠肝脾指數的變化如Tab.2 所示。與陰性對照組比較，小鼠注射D-Gal N 后肝脾指數均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠的肝指數有降低趨勢，但無統計學差異；各給藥組的脾指數均降低且有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.2 Effect of Huangjiaruangan granule on liver and spleen index of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Tab.2 Effect of Huangjiaruangan granule on liver and spleen index of D-Gal N induced acute liver injury mice（±s，n=14）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

病理學分級結果如Tab.3 所示。小鼠注射D-Gal N 后肝損傷程度明顯比陰性對照組動物嚴重，具有顯著差異，陽性藥組動物及黃甲軟肝顆粒各劑量組動物肝損傷程度與模型對照組比較顯著減輕。

Tab.3 Effects of Huangjiaruangan gruanules on liver histopathology of D-Gal N induced acute liver injury in mice（n=14）

2.2 Con A 致肝纖維化小鼠的影響

小鼠生化指標的變化如Tab.4 所示。與陰性對照組比較，小鼠注射Con A 后血清ALT、AST 顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，黃甲軟肝顆粒高、中劑量組及陽性藥組的ALT 及AST 值均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.4 Effects of Huangjiaruangan granules on serum biochemistry of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Tab.4 Effects of Huangjiaruangan granules on serum biochemistry of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

小鼠肝脾指數的變化如Tab.5 所示。與陰性對照組比較，小鼠注射刀豆素蛋白A 后肝脾指數均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃甲軟肝中劑量組的肝指數明顯減?。≒＜0.05），其它給藥組肝脾指數有降低趨勢但無統計學意義。

Tab.5 Effects of Huangjiaruangan granules on liver and spleen index of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Tab.5 Effects of Huangjiaruangan granules on liver and spleen index of mice with liver fibrosis induced by Con A（±s，n=16）

Note：##P＜0.01 vs negative control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.

3 討論

Gal N 具有很強的毒性，進入肝臟后引起肝細胞變性壞死，使細胞內大量ALT 和AST 大量釋放，引起肝細胞變性，炎性浸潤以及壞死等。D-Gal N 致急性肝損傷是利用D-Gal N 的肝毒性造成急性肝損傷的動物模型，是目前公認的較為經典的研究急性肝損傷的動物模型［10］。ALT 分布在肝細胞漿、AST 分布在肝細胞線粒體中，ALT、AST 升高分別反應了肝細胞膜和肝細胞內細胞器的損傷，是反應肝損傷的敏感指標［11］。臟器系數是毒理學實驗中的常用指標，臟器系數增大或減少在一定程度上反應臟器的損傷程度。本研究小鼠注射D-Gal N 后血清ALT、AST 和肝脾系數明顯升高、肝臟出現組織病理損傷。與模型組比較，黃甲軟肝顆粒各組均能顯著降低血清ALT 和AST 的水平、均降低肝脾指數且脾指數降低有顯著性，組織病理學檢查發現各給藥組動物肝損傷程度顯著減輕。綜上所述，黃甲軟肝顆粒對D-Gal N 所致的小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用。

小鼠反復注射Con A 致肝纖維化［12-13］，該模型中肝細胞受損不嚴重，炎癥反應引起膠原沉積為其主要表現，適合予以研究肝纖維化免疫疾病、吞噬細胞、Ito細胞及自身免疫性肝病等方面問題［14］。本研究中，小鼠注射Con A 可引起血清ALT、AST 和肝脾指數顯著升高；黃甲軟肝顆粒高、中劑量組可有效降低模型動物血清ALT、AST 升高水平，且黃甲軟肝中劑量組的肝指數明顯減小、其它給藥組肝脾指數有降低趨勢。綜上所述，黃甲軟肝顆粒對Con A 引起的肝纖維化有一定的治療作用。

綜合本實驗結果，可證實黃甲軟肝顆粒對小鼠D-Gal N 致急性肝損傷有明顯的保護作用并對Con A引起的肝纖維化有一定的治療作用，為其臨床使用提供實驗依據。