肺炎支原體SAT 檢測的室內質量控制與室間質量評價

王 冰 許佳音 李亞迪 劉子晗 韓欣洋 魏光燦 郝軍榮，2 李 雙 董明綱 劉心星

1.河北北方學院藥學院，張家口，075000，中國

2.河北省神經藥理學重點實驗室，張家口，075000，中國

3.張家口健垣精準醫學有限公司，張家口，075000，中國

4.河北北方學院學報編輯部，張家口，075000，中國

支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一種主要的非典型肺炎，在流行病期間，肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）在普通人群中引起20% 至40% 的社區獲得性肺炎（communityacquired pneumonia，CAP），在封閉人群中高達70%［1］。而且MPP 好發于兒童或青少年，在門診患兒中約20%～40%感染MP，而住院CAP 患兒中感染率約為10%～20%［2-3］，發病無明顯季節性［4］。并且MPP 有一定的傳染性，有臨床統計顯示，自二十世紀九十年代以后支原體肺炎有大流行趨勢［5］。其發病機制主要是肺炎支原體直接與間接損傷，導致支原體吸附在呼吸道黏膜上皮細胞引起氧化應激反應或者引起呼吸系統以外的反應及免疫功能抑制或紊亂等［6］。支原體肺炎臨床上以發熱、無痰或者少痰的持續性咳嗽為主要表現，也有厭食、胸骨下疼痛等特征，從癥狀上很難與其他肺炎相區別。對MP 進行早期快速診斷不僅可以降低并發癥的發生率，也可遏制其繼續傳播，減輕患者及家人的痛苦。RNA 實時熒光恒溫擴增檢測技術（simultaneous amplification and testing，SAT）可以用于MP 感染早期診斷。

SAT 是以rRNA 為靶標，與帶有T7 啟動子的引物結合，開始逆轉錄為cDNA；在M-MLV RT 酶的R Nase H 活性下，靶標RNA 鏈降解，形成單鏈cDNA；之后反向引物與cDNA 結合，在M-MLV RT 酶的聚合酶活性作用下，產生靶標核酸（RNA）的一個雙鏈DNA 拷貝，且該雙鏈帶有T7 啟動子，在T7 RNA 聚合酶的作用下，一條DNA 雙鏈上產生多個（100～1 000 個）RNA 拷貝；每一個RNA 拷貝再從反轉錄開始下一個擴增循環；同時，帶有熒光標記的探針和拷貝的RNA 特異結合，產生熒光。檢驗結果根據實時熒光信號的出現時間和強度，對檢驗結果進行判定。

與傳統的PCR 檢測DNA 技術相比SAT 技術具有更高的準確性。并且MP-DNA 提取采用煮沸裂解法，而MP-SAT 的提取采用磁珠提取法，相關研究證實，磁珠法的提取效率是煮沸裂解法的10 倍［7］，大大縮短了檢驗所需時間，可以達到快速診斷的要求。且通過林苗苗［8］等研究可知，MP-SAT 檢測對MP 感染的診斷敏感度、特異度及準確率均高于MP-DNA，可以明顯縮短窗口期，對支原體肺炎的早期快速診斷具有重要意義。

本研究在張家口健垣醫學檢驗實驗室采用SAT 檢測方法對MP 進行檢測，結合質控品、陽性對照、陰性對照以及內標信號檢測結果的比較驗證實驗方法的精密度和準確性以完成室內質量控制（internal quality control，IQC），并將對質控品的檢測結果與天津兒童醫院兒研所分子實驗室提供的MP 標本檢測結果進行比較進行室間質量評價（external quality assessment，EQA）。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑

MP 核酸檢測試劑盒，批號：2018.01.01，上海仁度生物科技有限公司提供；試劑盒A：裂解液、核酸提取液、洗滌液；試劑盒B：反應液、酶液、檢測液、陽性對照、內標、陰性對照；0.9%生理鹽水。

1.1.2 儀器

TL-998 實時熒光定量PCR 儀，西安天隆科技；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技；Mini-6k 微型離心機，常州梅香儀器；QL-901 漩渦混勻器，上海雙旭科技；BHC-1300IIB2 生物安全柜，上海一恒科技；移液器，大龍科技；TU-100C 干式恒溫儀，上海一恒科技；5～120 μL 連續加樣槍，大龍醫療。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本處理

將天津兒童醫院兒研所分子實驗室提供MP 的9例樣本與適量的生理鹽水混勻，將此混合液和裂解液按照1∶1 比例（各取500 μL）混勻備用，即為待測樣品。

1.2.2 試劑準備

將試劑盒A 和B 置于室溫下溶解，充分混勻。并將試劑盒B 內各試劑充分溶解后離心，放到桌面靜置備用。其中檢測液要避光保存，且所有試劑應避免反復凍融。

擴增檢測液的準備：以每個樣品40 μL 反應液和25 μL 檢測液的比例，配制所需擴增檢測液，混勻，3 000～4 000 rpm 離心10 秒備用。

稀釋內標：取90 μL 裂解液于EP 管內，再加入10 μL內標，進行10 倍稀釋，混勻備用。

質控品稀釋：取質控品10 μL，加入90 μL 的裂解液混勻，作為陽性對照。取上述陽性對照40 μL，再加入360 μL 的裂解液進行10 倍稀釋；在稀釋10 倍質控品的基礎上再稀釋10 倍，進行100 倍稀釋。同理再進行1 000 倍稀釋，其中100 和1 000 倍稀釋分別準備四管。

1.3 操作流程

將MP 質控品進行10 倍稀釋后作為陽性對照，并在陽性對照的基礎上進行10 倍、100 倍和1 000 倍的稀釋，其中100 倍和1 000 倍稀釋重復進行四次，與陰性對照和陽性對照在相同條件下，采用SAT 法對進行檢驗，觀察曲線，檢測靈敏度和精密度。并將天津兒童醫院兒研所分子實驗室提供MP 的多例樣本，進行檢測。

1.3.1 質控樣品準備

首先準備11 個1.5 mL EP 管，以陰性對照、稀釋后的質控品和陽性對照的順序依次標記為陰性對照、質控品10 倍、100 倍A、100 倍B、100 倍C、100 倍D、1 000 倍A、1 000 倍B、1 000 倍C、1 000 倍D 和陽性對照。再準備11 個1.5 mL EP 管，依次標記為陰性對照、MP①、MP②、MP③、MP④、MP⑤、MP⑥、MP⑦、MP⑧、MP⑨和陽性對照。

每管分別加入混勻的100 μL 核酸提取液和10 μL步驟1.2.2 中稀釋好的內標。

陰性對照、陽性對照和質控品稀釋管中各加入200 μL 的生理鹽水和200 μL 的裂解液。

陰性對照管中加入10 μL 的陰性對照，混勻。樣本管中加入待測樣品400 μL，混勻。陽性對照和質控品稀釋管中各加入10 μL相應的陽性對照和稀釋的質控品，混勻。

將所有充分混勻的EP 管，置于60℃電熱恒溫水浴鍋中保溫5 min，然后再室溫放置10 min。

1.3.2 樣品RNA 手工提取

將所有EP 管置于磁珠分離裝置上，靜置5 min，待磁珠清晰地吸附于管壁內側后，用移液器吸干凈管蓋和管里的氣泡和液體，保留磁珠吸凈后應清晰可見磁珠。每管加入1 mL 洗滌液，盡量將磁珠沖洗下來，渦旋混勻。洗滌步驟進行兩次。將EP 管移出，每管分別加入40 μL 擴增檢測液，渦旋混勻，取30 μL 混懸液于新的微量反應管中待測。

1.3.3 核酸擴增檢測

打開熒光檢測儀器并完成預熱：設定反應條件：溫度為42℃，40 個循環，每個循環1 min，熒光素通道設定為F1 和F2，熒光信號每分鐘收集一次，反應體系30 μL。

將上述準備好的微量反應管置于已設置好的干式恒溫儀中，其中60℃保持10 min，42℃保持5 min，同時將酶也預熱到42℃。用連續加樣器向每個微量反應管中分別加入10 μL 已預熱的酶液，立即蓋上管蓋，渦旋混勻。微量反應管迅速轉至熒光檢測儀器，立即啟動反應程序，期間不要隨意退出界面。

1.4 觀察指標

1.4.1 室內質量控制

靈敏度檢測：通過觀察10 倍稀釋、100 倍稀釋和1 000 倍稀釋質控品的曲線，看稀釋曲線是否為較完美的“S”形曲線，是否顯示陽性，且隨著濃度的減小，觀察擬合熒光數據，從而觀察檢測方法的靈敏度。

精密度檢測：觀察100 倍稀釋的4 條曲線和1 000倍稀釋的4 條曲線，通過比較曲線的重復性觀察檢測方法的精密度。

1.4.2 室間質量評價

將天津兒童醫院兒研所分子實驗室提供的9 例MP 標本，用SAT 檢測方法進行盲測，并將本實驗室的檢測結果與天津兒童醫院兒研所分子實驗室提供的結果進行對比，進行EQA。

2 結果與分析

2.1 室內質量控制

2.1.1 靈敏度檢測

對比質控品10 倍、100 倍和1 000 倍稀釋的曲線，發現1 000 倍稀釋的質控品能夠檢出陽性結果，近似為“S”型曲線，CT 值小于30 循環數，且隨著濃度的減小，擬合熒光數據也減?。‵ig.1），表明在1 000 倍稀釋的情況下，能夠檢測出具有應用價值的結果，即靈敏度高。

Fig.1 The curves of quality control products diluted at 10、100 and 1 000 are compared

2.1.2 精密度檢測結果

對比100 倍稀釋的四條曲線（Fig.2）；對比1 000 倍稀釋的四條曲線（Fig.3），均為“S”形曲線，重復性良好，即精密度高。

Fig.2 Comparison of curves diluted by 100A，100B，100C and 100D

Fig.3 Comparison of curves diluted by 1 000A，1 000B，1 000C and 1 000D

2.2 室間質量評價

以陰性看內標、陽性看靶標的標準觀察，發現只有第一個標本為陽性，其余均為陰性（Fig.4、Fig.5），張家口健垣醫學檢驗實驗室檢測結果與天津兒童醫院兒研所分子實驗室提供的結果一致（Tab.1），準確度極高，符合EQA 的要求，表明這次室間比對實驗通過。

Tab.1 MP-RNA test

Fig.4 Comparison of positive control，MP①，MP②，MP ③，MP④ and negative controls

Fig.5 Comparison of negative control，MP⑤，MP⑥，MP⑦，MP⑧，MP⑨ and negative controls

3 討論與結論

當前用于診斷MP 感染引起的肺炎的方法主要有血清學診斷、分離培養和分子生物學的診斷。MP 分離培養是診斷MP 感染的金標準［9］。然而它的成功培養不僅需要特殊的培養基、嚴格的實驗室衛生環境，還需要耗費長時間進行培養，樣本來源的途徑等因素對MP感染的診斷也具有重要的影響。并且有結果顯示利用分離培養的方法靈敏度僅為60%［10］，對于我們要達到早期快速臨床診斷的要求相距較遠。在我國常通過檢測血清學中MP 特異性抗體來判斷是否是MP 感染，然而隨著試劑盒商品化，患者年齡和標本采集時間等對MP感染的診斷產生影響，Beersma 等［11］以實時定量PCR 為金標準，比較12 種商品試劑盒的靈敏度和特異性的實驗中得到證實?？贵w檢測是目前國內MP 檢測的主要診斷手段。然而，單一的血清學檢測，無論樣本中抗體滴度是否高，對MPP 的早期診斷價值有限［10］。

支原體肺炎缺乏特異的臨床和影像學表現，早期不易做出診斷［12］，我們急需一種新方法來打破這個僵局。SAT 可在2～3 h 內完成，非常適合MP 的快速檢測［13］。它比傳統的細菌培養和血清學分析更快，而且重現性良好。所以SAT 作為新型的分子診斷技術，直接以存在活菌體內的MP 病原體的RNA 片段為靶標進行擴增從而達到快速診斷脫穎而出。且無創傷、操作簡便、靈敏度高以及能明顯縮短窗口期。更值得注意的是，SAT 技術屬于活菌檢測，不僅可以精確的檢測患者體內有無病菌，更可以準確反應病原微生物在體內是否存活與繁殖，便于患者的療效觀察和臨床指導用藥等優點，被廣泛應用于呼吸系統感染的檢測中。并有研究表明，MP-SAT 的檢測結果與相關研究結果相符［14-16］。在兒童MP 感染時，此方法尤受推崇。

IQC 和EQA 是實驗室全面質量管理體系的兩個非常重要的環節。其中，IQC 可以監測和控制實驗測定系統的精密度，有效的IQC 是保證實驗室檢測結果可靠的關鍵因素。IQC 為檢驗人員按照一定的頻度連續測定穩定樣品中的特定組分，并采用一系列方法進行分析，按照統計學規律推斷和評價本批次測量結果的可靠程度，以此判斷檢驗報告是否可發出，及時發現并排除質量環節中的不滿意因素［17］。將IQC 的數據同實驗室間進行對比，能同時提供正確度和精密度的信息，可用于評價實驗室的檢測的質量。

本研究依據2012 版《醫學實驗室質量和能力認可準則》和2012 版《醫學實驗室質量和能力認證準則》對醫學實驗室檢測系統性能評價的相關要求，對SAT 定性檢測項目的分析性能進行評價。通過實驗室內用SAT檢測MP 的方法靈敏度、精密度都好，說明實驗方法符合驗證要求。將用SAT 對MP 的檢測結果與天津兒童醫院兒研所分子實驗室進行EQA，結果顯示，在目前的實驗條件和方法下，本實驗室用SAT 方法檢測MP 的數據準確可靠。要想達到這樣結果，需要對實驗室的實驗人員進行嚴格培訓，并對正確的樣本采集、留取、操作和保存以及對實驗室內的溫度、濕度、壓力等進行嚴格控制，而且需要保證實驗使用的設備與試劑均符合要求。

本研究結果顯示：IQC 的驗證是通過觀察靈敏度、精密度和準確度來進行驗證，結果顯示良好，符合對IQC 的要求，表明本實驗室對SAT 定性檢測MP 的分析符合；通過與天津兒童醫院兒研所分子實驗室提供的結果進行EQA，顯示結果一致，表明本實驗室對SAT技術檢測MP 的EQA 通過驗證，該SAT 技術檢驗MP能夠在本實驗室投入使用。