巖黃連總生物堿提取工藝及抗氧化活性研究

李 伶，唐文迪，陳壽渙，寧裕龍，覃江克*

(1.廣西師范大學 化學與藥學學院，廣西 桂林 541004；2.省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室(廣西師范大學)，廣西 桂林 541004)

巖黃連CorydalissaxicolaBunting(簡稱CSB)是罌粟科Papaveraceae紫堇屬Cordalis植物石生黃堇的全草，因生于巖石旁，功效類似黃連而得名[1]。巖黃連長于高山峭壁上或石縫中，在我國西南地區分布最多，是典型的喀斯特地帶藥用植物，其性涼、味苦，具有清熱解毒、利濕、止血、止痛等功效[2-3]。研究表明，巖黃連具有保肝、抗肝纖維化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用，臨床用于治療病毒性肝炎等疾病，具有良好療效[4-9]。一般認為巖黃連中的生物堿類化合物是其藥效物質[10]，目前對巖黃連的研究主要集中在巖黃連總生物堿的組織分布，單體化合物的分離、鑒定與藥理活性研究上[11-17]。巖黃連總生物堿的提取是其后續分離純化、活性評價和產品開發的基礎，因此優化巖黃連總生物堿的提取工藝具有重要現實意義。

目前，總生物堿的提取方法有酸水提取法、醇類溶劑提取法、親脂性有機溶劑提取法、超聲或微波輔助提取法等[18]。酸水提取法具有腐蝕性和成鹽損耗大等缺陷，而其他親脂性有機溶劑毒性高，超聲或微波輔助提取法需要特殊設備不太適合大規模生產。相對其他方法，乙醇提取法具有工藝簡單、經濟便捷、效率高、溶劑易回收、綠色環保等優點，易為廣大生產廠家所接受。目前，對于巖黃連總生物堿的提取工藝鮮有報道[19]，且因提取方式、考察指標、參數設定等的差異，常造成研究結果差異性較大，為了滿足生產需求尚需系統考察和進一步完善。

自由基是人體內氧化反應過程中產生的中間代謝產物，對機體具有雙重作用，適量的自由基可以在生物體內作為信息和調控分子，是一種具有廣泛作用的多功能介質。然而，在特定條件下自由基會異常累積，導致機體發生氧化損傷，進而引發氧化應激性相關疾病，如肝癌、肝損傷、病毒性肝炎、肝纖維化等疾病[20-25]。研究表明，巖黃連總生物堿對以上肝類疾病具有良好的療效，其良好療效除了與其細胞毒性、抗炎等藥理活性有直接關系外，亦可能與其抗氧化活性密切相關[4-9]，故有必要對巖黃連的抗氧化活性進行考察，以便更好地闡明其作用機理。

鑒于以脫氫卡維丁為代表的總生物堿是巖黃連的主要藥效組分[26]，本實驗采用乙醇提取法，以脫氫卡維丁的得率為評價指標，采用單因素實驗系統考察提取溫度、提取時間、乙醇體積分數、料液比和提取次數等因素對得率的影響，并通過L9(34)正交試驗確定從巖黃連中提取總生物堿的最優提取工藝條件，結合體外抗氧化實驗評價巖黃連總生物堿粗提物的自由基清除能力，旨在為其后續的分離純化、藥理活性及應用開發提供一定實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巖黃連CorydalissaxicolaBunting于2018年6月購于廣西東蘭縣，由廣西師范大學唐紹清教授鑒定為罌粟科紫堇屬巖黃連。

脫氫卡維丁對照品(純度大于98%，批號111667-200401，中國藥品生物制品檢定所)；脫氫甲卡維丁、巴馬汀(實驗室自制)；乙醇(分析純，上海泰坦科技股份有限公司)；甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)；三氟乙酸(TFA)(色譜純，上海泰坦科技股份有限公司)；碘化鉍鉀(浙江海川化學品有限公司)；去離子水(實驗室自制)；其他試劑均為分析純。

FW177 粉碎機(上海書培實驗設備有限公司)；單列數顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)；AL104電子天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司)；TU-1820紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；LC-20A分析型高效液相色譜儀(日本島津科技公司)；Inertil ODS-3(4.6 mm×250 mm)分析柱(日本島津科技公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖黃連總生物堿含量的測定

1.2.1.1 對照品溶液的配制

精密稱取脫氫卡維丁對照品10 mg，加入1%鹽酸乙醇溶液溶解，定容至100 mL，作為儲備液(0.1 g/L)備用。

1.2.1.2 最大吸收波長的確定

將提取的樣品溶液和對照品溶液分別在200～800 nm波長范圍掃描，結果在346 nm處有最大吸收。

1.2.1.3 標準曲線的繪制

精密吸取對照品儲備液，用1%鹽酸乙醇溶液稀釋，分別配制成2、4、6、8、10、12 mg/L溶液，以1%鹽酸乙醇溶液為空白，在346 nm處測量吸光度，以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線?；貧w方程和相關系數分別為y=0.066 62x-0.002 78，R2=0.999 45。

1.2.1.4 提取樣品溶液濃度測定方法

量取樣品溶液，根據1.2.1.3方法測定吸光度，通過標準曲線計算提取樣品溶液中巖黃連總生物堿的濃度，按式(1)計算得率：

(1)

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 提取溫度對巖黃連總生物堿得率的影響

稱取5份巖黃連粉末，每份4 g，按料液比1∶10(質量(g)∶體積(mL)，全文同)加入體積分數80%乙醇，分別于50、60、70、80、90 ℃提取2 h，各提取3次，趁熱過濾，合并提取液，用移液槍精密吸取50 μL提取液，稀釋200倍后測定提取液中巖黃連總生物堿的含量，計算巖黃連總生物堿得率。

1.2.2.2 提取時間對巖黃連總生物堿得率的影響

稱取5份巖黃連粉末，每份4 g，按料液比1∶10加入體積分數80%乙醇，于70 ℃分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，各提取3次，趁熱過濾，合并提取液，用移液槍精密吸取50 μL提取液，稀釋200倍后測定提取液中巖黃連總生物堿的含量，計算巖黃連總生物堿得率。

1.2.2.3 乙醇體積分數對巖黃連總生物堿得率的影響

稱取5份巖黃連粉末，每份4 g，按料液比1∶10分別加入體積分數60%、70%、80%、90%、95%乙醇，70 ℃提取2 h，各提取3次，趁熱過濾，合并提取液，用移液槍精密吸取50 μL提取液，稀釋200倍后測定提取液中巖黃連總生物堿的含量，計算巖黃連總生物堿得率。

1.2.2.4 料液比對巖黃連總生物堿得率的影響

稱取5份巖黃連粉末，每份4 g，按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入體積分數80%乙醇，70 ℃提取2 h，各提取3次，趁熱過濾，合并提取液，用移液槍精密吸取50 μL提取液，稀釋200倍后測定提取液中巖黃連總生物堿的含量，計算巖黃連總生物堿得率。

1.2.2.5 提取次數對巖黃連總生物堿得率的影響

稱取5份巖黃連粉末，每份4 g，按料液比1∶10加入體積分數80%乙醇，70 ℃提取2 h，各提取1、2、3、4、5次，趁熱過濾，合并提取液，用移液槍精密吸取50 μL提取液，稀釋200倍后測定提取液中巖黃連總生物堿的含量，計算巖黃連總生物堿得率。

1.2.3 正交試驗

在單因素實驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗進一步分析提取溫度、提取時間、乙醇體積分數及料液比對巖黃連總生物堿提取的影響，優化其乙醇提取工藝條件，所設計的因素水平見表1。

表1 巖黃連總生物堿提取L9(34)正交試驗因素水平Tab. 1 L9(34) factors and levels of orthogonal test of extracting of total alkaloids from CSB

1.2.4 提取物的鑒別與分析

取最優工藝下獲得的提取物，采用碘化鉍鉀顯色法[27]檢驗是否含生物堿；以脫氫甲卡維丁、脫氫卡維丁、巴馬汀為對照品，采用高效液相色譜法(HPLC)對提取物進行分析。

HPLC色譜條件：檢測波長346 nm，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，甲醇-0.1% TFA溶液為流動相梯度洗脫(甲醇0～30 min，體積分數10%～100%；30～40 min，體積分數100%)。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 待測樣品液的制備

將巖黃連總生物堿提取液冷凍干燥，準確稱量500 mg，加入1%鹽酸溶液溶解，定容至100 mL，作為儲備液(5 g/L)備用。用1%鹽酸溶液稀釋待測樣品儲備液，分別配制成1、2、3、4、5 g/L的待測樣品。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率的測定

參照文獻[28]方法，分別移取2 mL不同濃度(1～5 g/L)的樣品液與2 mL的DPPH(2×10-4mol/L)溶液于試管中，混勻，30 ℃恒溫反應30 min，在517 nm處測定其吸光度，同時以Vc為對照品。每個樣品重復3次并取其平均值，按式(2)計算清除率：

清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]。

(2)

式中:Ai為加入樣品后的吸光度；Aj為樣品自身的吸光度；Ac為空白對照液吸光度。

1.2.5.3 ABTS自由基清除率的測定

參照文獻[29]方法，準確配制7.6 mmol/L ABTS儲備液和2.6 mmol/L高硫酸鉀儲備液，并將兩者等體積混合避光反應12 h，得到ABTS溶液，測定時用無水乙醇將配制好的ABTS溶液稀釋至在734 nm處的吸光度值為0.70±0.02。分別移取0.1 mL不同濃度(1～5 g/L)的待測樣品液于試管中，加入4.9 mL稀釋后的ABTS溶液，混勻，30 ℃恒溫反應10 min，在734 nm處測定其吸光度，同時以Vc為對照品。每個樣品重復3次并取其平均值，按式(2)計算清除率。

1.2.5.4 羥基自由基清除率的測定

參照文獻[30]方法，分別移取1 mL不同濃度(1～5 g/L)的樣品溶液于試管中，加入1 mL濃度為9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，1 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，蒸餾水定容至5 mL，再加入 1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液啟動反應，37 ℃恒溫反應10 min，于510 nm波長處測定其吸光度，同時以Vc為對照品。每個樣品重復3次并取其平均值，按式(2)計算清除率。

1.2.5.5 超氧陰離子自由基清除率的測定

參照文獻[31]方法，在10 mL具塞試管中依次加入4.5 mL濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)，4.2 mL蒸餾水，混勻，25 ℃恒溫反應20 min后，立即加入25 ℃預熱的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速混勻，在325 nm處測定吸光度，每隔30 s測定1次，連續測定5 min，計算線性范圍內每分鐘的吸光度增加值ΔA0。按上述步驟，在試管中加入1 mL不同濃度(1～5 g/L)待測樣品溶液，同時減少等體積的蒸餾水，其余操作同上，計算線性范圍內每分鐘的吸光度增加值ΔAi。以Vc為對照品。每個樣品重復3次并取其平均值，按式(3)計算清除率：

清除率=(1-ΔAi/ΔA0)。

(3)

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溫度對巖黃連總生物堿得率的影響

由圖1可知，巖黃連總生物堿得率與提取溫度呈正相關，當提取溫度為60～80 ℃時，巖黃連總生物堿得率隨著溫度升高呈增長趨勢，當提取溫度達到80 ℃后，巖黃連總生物堿得率趨于平穩，考慮到生物堿高溫下會分解，選擇提取溫度60、70、80 ℃為考察水平。

圖1 提取溫度對巖黃連總生物堿得率的影響Fig. 1 Effect of extracting temperature on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.2 提取時間對巖黃連總生物堿得率的影響

由圖2可知，當提取時間為1.0～1.5 h時，巖黃連總生物堿得率隨提取時間增加呈直線上升趨勢，提取時間達到1.5 h后，巖黃連總生物堿得率呈現平緩上升趨勢，變化不明顯?？紤]到實際生產效益，選擇提取時間2.0、2.5、3.0 h為考察水平。

圖2 提取時間對巖黃連總生物堿得率的影響Fig. 2 Effect of extracting time on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.3 乙醇體積分數對巖黃連總生物堿得率的影響

由圖3可知，乙醇的體積分數在60%～70%時，巖黃連總生物堿得率隨乙醇濃度增加呈上升趨勢；在乙醇體積分數為70%時，得率達到最高值，當乙醇體積分數超過70%后，巖黃連總生物堿得率呈下降趨勢。原因是巖黃連總生物堿具有一定的極性，在一定的極性條件才最適合將其浸出，過高或過低的乙醇體積分數均不利于巖黃連總生物堿的浸出，結合圖3我們選擇乙醇體積分數60%、70%和80%進行考察。

圖3 乙醇體積分數對巖黃連總生物堿得率的影響Fig. 3 Effect of ethanol concentration on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.4 料液比對巖黃連總生物堿得率的影響

由圖4可知，巖黃連總生物堿得率隨料液比的增加整體呈上升趨勢，這是因為料液比越大，提取液中生物堿的濃度越低，越有利于生物堿轉移到提取液中；但當料液比超過1∶12后，得率開始變化不大，表明生物堿浸出趨于平衡。綜合考慮，選擇料液比1∶10、1∶12、1∶14為考察水平。

圖4 料液比對巖黃連總生物堿得率的影響Fig. 4 Effect of feed liquid ratio on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.5 提取次數對巖黃連總生物堿得率的影響

由圖5可知，隨著提取次數的增加，巖黃連總生物堿的得率增大，當提取3次后再增加提取次數，得率基本不變，為5.36%。原因是達到一定提取次數后，巖黃連總生物堿已完全浸出，再增加提取次數對得率影響不大，且不利于后期的蒸發濃縮。綜合考慮，選擇提取3次為最佳提取次數。

圖5 提取次數對巖黃連總生物堿得率的影響Fig. 5 Effect of extraction times on the yield of total alkaloids from CSB

2.2 正交試驗結果

由表2、表3可知，巖黃連總生物堿提取正交試驗中，各影響因素均不顯著，可直接根據極差分析選擇最優水平組合。由表2極差分析可知，各因素對巖黃連總生物堿得率影響由大到小依次為料液比、提取溫度、乙醇體積分數、提取時間；乙醇法提取巖黃連總生物堿的最佳工藝條件為A3B2C1D3，即巖黃連總生物堿的最優提取工藝為：提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h，乙醇體積分數60%，料液比1∶14，提取3次，在此條件下，巖黃連總生物堿的得率為7.34%。

表2 巖黃連總生物堿提取正交試驗結果Tab. 2 Results of orthogonal experiment on extraction of total alkaloids from CSB

表3 巖黃連總生物堿提取正交試驗方差分析結果Tab. 3 Variance analysis of orthogonal experimental on total alkaloids from CSB

2.3 提取工藝驗證實驗

精確稱取3份巖黃連粉末，每份4.00 g，按照最優工藝進行提取，測定其巖黃連總生物堿的得率，結果見表4。

表4 驗證試驗結果Tab. 4 Results of verification test

2.4 提取物的鑒別與分析

最優工藝條件下的提取物對碘化鉍鉀反應呈陽性，表明其含有生物堿類化合物。以巖黃連中含量高的代表性化合物：脫氫甲卡維丁、脫氫卡維丁、巴馬汀為對照品，采用HPLC法對該提取物進行分析(表5)，發現這3種生物堿的峰面積占比之和大于75%，表明該提取物的主要成分為生物堿，而且以這3種化合物為主。

表5 HPLC分析結果Tab. 5 Results of HPLC

2.5 抗氧化活性

2.5.1 巖黃連總生物堿粗提物對DPPH自由基的清除作用

以Vc為對照，分析巖黃連總生物堿粗提物對DPPH自由基的清除作用，測定結果如圖6所示。由圖6可知，在1～5 g/L，巖黃連總生物堿粗提物對DPPH自由基有較好的清除作用，且清除能力具有濃度依賴性。當濃度達到3 g/L時，對DPPH自由基的清除率為95%，再繼續增加濃度，其對DPPH自由基的清除能力增長趨于平緩且略優于Vc，IC50為0.675 g/L，說明巖黃連總生物堿粗提物對DPPH自由基有很好的清除能力。

圖6 巖黃連總生物堿粗提物對DPPH自由基的清除作用Fig. 6 DPPH· free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

2.5.2 巖黃連總生物堿粗提物對ABTS自由基的清除作用

以Vc為對照，分析巖黃連總生物堿粗提物對ABTS自由基的清除作用，結果如圖7。由圖7可知，巖黃連總生物堿粗提物對ABTS自由基具有中等程度的清除作用，隨著濃度的增加清除能力增強，但是在1～5 g/L，巖黃連總生物堿粗提物整體的清除率在60%左右，IC50為0.78 g/L，清除能力低于Vc。

圖7 巖黃連總生物堿粗提物對ABTS自由基的清除作用Fig. 7 ABTS+·free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

2.5.3 巖黃連總生物堿粗提物對羥基自由基的清除作用

以Vc為對照，分析巖黃連總生物堿粗提物對羥基自由基的清除作用，測定結果如圖8所示。由圖8可知，羥基自由基清除率隨著巖黃連總生物堿粗提物質量濃度的增加緩慢上升，表明巖黃連總生物堿粗提物對羥基自由基具有一定的清除能力。

圖8 巖黃連總生物堿粗提物對羥基自由基的清除作用Fig. 8 Hydroxyl free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

2.5.4 巖黃連總生物堿粗提物對超氧陰離子自由基的清除作用

圖9 巖黃連總生物堿粗提物對超氧陰離子自由基的清除作用Fig. 9 Superoxide anion free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

3 結論

本文采用乙醇提取法提取巖黃連中的總生物堿，在探討單因素對提取效率影響的基礎上，通過正交試驗對提取工藝進行優化，并研究其體外抗氧化活性。結果顯示，各因素對巖黃連總生物堿的得率影響由大到小依次為料液比、提取溫度、乙醇體積分數、提取時間；其最佳提取工藝為：提取溫度80 ℃，提取時間2.5 h，乙醇體積分數60%，料液比1∶14，提取3次，得率為7.34%。巖黃連總生物堿粗提物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基有較好的清除作用，對ABTS自由基和羥基自由基有一定程度的清除作用，其中，巖黃連總生物堿對DPPH自由基的清除率最好，IC50值為0.675 g/L。下一步，我們將在巖黃連總生物堿進一步分離純化的基礎上，深入研究其在細胞和動物水平上的抗氧化效應和其他藥理活性，以更好闡明其作用機制。

利用乙醇提取巖黃連總生物堿具有工藝簡單、經濟便捷、效率高、速度快等優點，獲得的巖黃連總生物堿粗提物具有良好的抗氧化活性。該研究為其后續的進一步分離純化、工藝放大和拓寬其利用途徑提供了實驗依據。