5個棘胸蛙養殖群體微衛星遺傳多樣性分析

魏朝宇，汪小冬，魏秀英，袁 鴻，姚紅艷，陳敦學*

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025; 2. 貴州大學 漁業資源與環境研究中心，貴州 貴陽 550025;3. 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室(貴州大學)，貴州 貴陽 550025;4. 湖南農業大學 動物科學學院, 湖南 長沙 410128)

棘胸蛙Quasipaaspinosa又名石蛙、石雞等，隸屬兩棲綱Amphibian無尾目Anura叉舌蛙科Dicroglossinae棘胸蛙屬Quasipaa，主要分布在中國南方八省[1]。由于生態環境破壞和過度捕抓，棘胸蛙野生資源急劇減少，目前已被中國物種紅色名錄列為易危等級[2-3]。棘胸蛙蛙肉具有高蛋白和低脂肪的特點，被認為是藥補、食補佳品，市場需求旺盛[4]。為了滿足人們對蛙肉的需求，減少對野生資源的消耗，我國從20世紀80年代開始進行人工養殖，但主要采取“野外捕撈，就地繁養”模式，對繁殖群體缺乏遺傳特征分析[2]，容易造成近親繁殖，導致棘胸蛙出現個頭小、抗病性差等問題[5]，因此，迫切需要對棘胸蛙養殖群體開展遺傳多樣性研究，評估棘胸蛙養殖群體的遺傳現狀，為提高養殖效益和選育棘胸蛙良種提供數據支撐。目前，養殖群體遺傳多樣性研究在魚類中開展得較多，普遍認為養殖群體遺傳多樣性低于野生群體[6-9]。對棘胸蛙遺傳多樣性的研究依然很少，且主要集中在野生群體的研究，例如，劉南君等[10]采用RAPD技術分析貴州省寬闊水域棘胸蛙遺傳多樣性，認為貴州省棘胸蛙具有較高水平的遺傳多樣性和環境適應能力；王茂元等[11]采用GBS技術，證明福建南平棘胸蛙種群已表現出雜合度降低、遺傳多樣性下降等趨勢；Zheng等[12]運用15個SSR位點對棘胸蛙2個群體進行分析，結果揭示棘胸蛙具有較高的多態性；Ye等[13]利用線粒體基因(12S rRNA 和16S rRNA)證明棘胸蛙具有很高的遺傳多樣性。

由于缺乏對養殖群體種質資源的研究，目前棘胸蛙養殖產業健康發展依舊存在隱患。選擇合適的分子標記將有助于我們了解物種的遺傳特征，進而推動種質資源開發與創新利用[14]。微衛星又稱簡單重復序列，主要由高突變的核心序列和保守的側翼序列組成，具有數量多、分布廣泛且均勻、雜合率高、重復性好且數據易統計等優點[15]，被廣泛應用于水產動物種質資源評估、群體遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定等方面[12,16]。截止2021年7月，NCBI數據庫公布的棘胸蛙SSR位點僅31個，遠不足以評價棘胸蛙遺傳多樣性。因此，本研究通過轉錄組篩選棘胸蛙9對有效SSR位點，并依托9個位點對5個養殖群體棘胸蛙(148個樣本)進行遺傳多樣性分析，闡明棘胸蛙養殖群體的遺傳現狀，以期為棘胸蛙種質資源開發利用和良種培育提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗所用棘胸蛙蝌蚪采自江西明月山石蛙養殖股份有限公司(江西群體30尾)、浙江雙吉山養殖有限公司(浙江群體30尾)、廣西賀州全宇石蛙養殖專業合作社(廣西群體28尾)、廣東清遠市盈信農業有限公司(廣東群體30尾)、福建德化雙全農業有限公司(福建群體30尾)，共計148尾。樣本用無水乙醇浸泡，-20 ℃保存備用。

1.2 基因組DNA提取

取少量的肌肉，用基因組DNA試劑盒(北京天根生化科技有限公司)并參照說明書進行DNA提取，提取后的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并于-20 ℃保存備用。

1.3 微衛星DNA引物設計與合成

用轉錄組開發棘胸蛙潛在的SSR位點，選擇SSR兩端序列長度≥50 bp且堿基重復類型為2堿基重復與3堿基重復的序列，primier 5.0進行引物設計；隨機挑選50對引物進行驗證，以浙江(ZJ)群體棘胸蛙基因組DNA為模板擴增，以產生穩定擴增條帶且條帶大小與預期一致為篩選依據。共篩選到15對引物，進而將擴增產物用 8% 非變性聚丙烯酰胺電泳和硝酸銀染色觀察，根據條帶穩定情況，篩選出9對引物(見表1)。

表1 9對微衛星位點信息Tab. 1 Information of 9 microsatellite loci

1.4 PCR擴增

將篩選得到的9對引物分別在148個樣品中進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μL：2×Tap PCR Master Mix(MT201，博邁德生物，中國)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，引物在各自合適的退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠檢測擴增效果。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染

擴增產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，產物上樣量為2 μL，內外電泳槽各加入1×TBE電泳緩沖液，設置電壓180 V，電流150 mA，電泳5 h后，硝酸銀染色并觀察其條帶情況。

1.6 數據分析

用Popgen32軟件計算各位點的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、近交系數(Fis)、遺傳分化系數(Fst)及Hardy-Weinberg平衡檢驗。用Cervus計算各位點的多態信息含量(PIC)?；谌后w間的Nei’s遺傳距離使用MEGA構建UPGMA系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 微衛星位點的多態性

9對引物在棘胸蛙5個養殖群體中共檢測到46個等位基因，詳見表2。各位點等位基因數為4～9個，平均為5.111個。其中，引物W115檢測到的等位基因數最多，為9個。各位點的有效等位基因數介于1.731～5.291，均值為2.702。觀測雜合度在0.007～0.322，平均值為0.182。期望雜合度介于0.423～0.815，平均值為0.589。9對引物的多態信息含量介于0.392～0.789，平均值為0.536。其中，引物W128、W115、W212和W103表現為高度多態位點，其余為中度多態性。

表2 9個位點的遺傳多樣性參數Tab. 2 Genetic diversity indices of 9 microsatellite loci in five cultured populations

從群體內近交系數(Fis)和遺傳分化系數(Fst)來看，近交系數在引物W276(-0.147)表現為負值，其余均為正值，平均值為0.523。遺傳分化系數在0.070～0.717，平均值為0.332。位點W326的遺傳分化系數為中度分化(0.05～0.15)，其余位點均為高度分化。平均總遺傳分化系數為0.332(遺傳分化系數大于0.15)，屬于高度分化。

2.2 棘胸蛙群體的遺傳多樣性

分析9個SSR位點在5個養殖群體中的多態性，結果見表3，發現5個群體的平均等位基因數(Na)為2.889～3.444，其中廣東群體最少，江西群體最多。有效等位基因數(Ne)平均為1.737～2.131，江西群體最少，廣西群體最多，5個養殖群體的總體平均值為1.945。5個群體 PIC值平均在0.312～0.400，平均值為0.355，其中江西群體最低，浙江群體最高。5個養殖群體的觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.130～0.230和0.353～0.468。其中浙江群體的Ho和He均達到最大值，而觀測雜合度和期望雜合度的最小值分別出現在福建群體和江西群體(表3)。

表3 5個群體在9個微衛星位點的遺傳多樣性參數Tab. 3 Genetic diversity indices of 9 microsatellite loci in different cultured populations

2.3 群體間遺傳相似度和聚類分析

不同養殖群體棘胸蛙的遺傳相似度和遺傳距離存在較大差異，其中：廣東和廣西遺傳相似度最高(0.819)，遺傳距離最近(0.200)；福建和江西的遺傳相似度最低(0.441)，遺傳距離最遠(0.819)(表4)。利用MEGA軟件構建UPGMA系統發育進化樹，結果顯示，廣東群體和廣西群體聚為一支，而后再與福建群體聚在一起，而浙江和江西群體聚為一支，具有明顯的地理區系(圖1)。

圖1 基于Nei’s無偏遺傳距離構建的5個棘胸蛙養殖群體UPGMA樹Fig. 1 UPGMA dendrogram of five cultured populations of Q. spinosa based on Nei’s

表4 5個棘胸蛙養殖群體的遺傳相似度和遺傳距離Tab. 4 Genetic distance genetic similarity of 5 cultured populations of Q. spinosa

進一步利用AMOVA軟件進行群體內和群體間的遺傳變異分析，結果顯示，有70.95%的遺傳變異來自群體內，而群體間的變異為29.05%，群體內的變異大于群體間的變異(表5)。

表5 5個棘胸蛙群體的方差分析Tab. 5 AMOVA analysis among five Q. spinosa populations

2.4 Hardy-Weinberg平衡分析

利用Popgen軟件，經Hardy-Weinberg平衡(HWE平衡)的卡方檢驗發現，在棘胸蛙5個養殖群體，9個多態性SSR位點組合而來的45個位點中，大部分都偏離了平衡狀態，呈現極顯著偏離 HWE 平衡(30個位點)，僅有11個位點未偏離HWE 平衡，另有4個位點為單倍性位點，未進行HWE 平衡分析(表6)。江西、浙江、廣西、廣東和福建5個養殖群體中，分別有5、8、8、5、4個位點偏離了HWE 平衡。此外，有2對引物(W326和W115)在5個養殖群體中均偏離HWE 平衡。

表6 5個群體在9個微衛星位點的Hardy-Weinberg平衡分析Tab. 6 Hardy-Weinberg equilibrium of 5 populations at 9 microsatellite loci

3 討論

3.1 多態信息含量及基因雜合度分析

多態性信息含量是描述遺傳多樣性的指標，標志著群體對環境變化的適應能力和生存能力[17-18]。一般認為，多態性信息含量大于0.5時，該位點表現為高度多態性；當多態性信息含量介于0.25與0.5之間時，為中度多態性；而當多態性信息含量小于0.25時，則表現為低多態性[19]，不適合直接作為育種材料。本文選取的9個SSR位點中，多態信息含量平均值為0.536，其中有5個位點屬于中度多態性，4個位點屬于高度多態性，據此我們認為5個棘胸蛙養殖群體整體呈現中度偏高的多態性。本文結果與課題組利用SSR長度多態性分析研究的結果[20 ]一致。Zheng等[12](微衛星標記)和劉南君等[10](RAPD分析)均認為棘胸蛙具有較高的遺傳多樣性，由于實驗群體為人工養殖群體，因人為干擾、近親繁殖等，導致多態性下降。類似現象在其他物種中也有報道，例如斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus[21]、斑節對蝦Penaeusmonodon[22]、許氏平鲉Sebastesschlegeli[23]和金邊鯉Cyprinuscarpiovar. Jinbian[24]等。

基因雜合度是衡量群體遺傳變異的最適參數[25-26]，雜合度可以分為觀測雜合度和期望雜合度，當觀測雜合度與期望雜合度值相近時，表明外部環境選擇及近交等因素對該物種遺傳變異影響較小，此時群體內處于遺傳平衡狀態[27]。本研究分析5個群體的期望雜合度和觀測雜合度，發現期望雜合度(0.589)遠遠高于觀測雜合度(0.182)；進一步分析每個群體間的雜合度，發現各個群體內部的期望雜合度均高于觀測雜合度，其中以福建群體的期望雜合度與觀測雜合度差別最大，達到2.88倍。類似現象在很多人工養殖(選育)群體中均有發現，例如中華絨螯蟹[8]、黃顙魚[9]、鳙魚[28]、大口黑鱸[29]等，可能是由于人工養殖群體近親繁殖普遍存在而使群體發生純合反應，導致雜合度降低，物種對環境變化適應性減低[30]。因此，在人工養殖棘胸蛙的過程中，應盡量擴大選育范圍，避免近親繁殖，同時，建議定期從外地良種場引進良種作為繁殖親本，以提高親本遺傳多樣性。

3.2 遺傳距離與遺傳分化系數相關性分析

遺傳距離是衡量群體間遺傳關系的指標，一般來說群體遺傳距離越近，遺傳相似度越大，則親緣關系越近[31-32]，并認為遺傳相似度大于0.5時，此時群體間的親緣關系為一級親緣關系[22]。本實驗中，廣西和江西群體、廣東和江西群體、福建和江西群體、福建與浙江群體的遺相似度較低(小于0.5)，可能與群體的地理位置有關；進一步構建群體遺傳的UPGMA進化樹，發現江西與廣東、廣西、福建群體遺傳距離較遠，同時福建與浙江群體遺傳距離也較遠，聚類分析結果與地理位置分布相吻合。

基因遺傳分化系數(Fst)是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數。Balloux等[32]認為，當群體間Fst值大于0.25時，表示群體間的遺傳分化極大。在我們選取的5個養殖群體中，平均Fst值達到0.332，顯示棘胸蛙的5個養殖群體已經呈現較大的遺傳分化。同時進行的分子方差分析結果顯示：棘胸蛙遺傳變異，大部分來自群體內個體之間，來自群體間的僅占29.05%。

3.3 HWE平衡分析

HWE平衡檢驗被廣泛應用于分析群體遺傳進化、結構特征[33]以及定位重要功能基因等方面[34]。在本文構建的45個SSR位點中，有30個位點極顯著地偏離了HWE平衡，偏離率達到66.67%，遠遠高于鱖的野生群體(21.67%)[35]。相較而言，養殖群體的HWE平衡偏離率往往比較高，例如軍曹魚Rachycentroncanadum偏離率達到53.13%[36]、克氏原螯蝦Procambarusclarkii偏離率達到82.5%[37]、紅羅非魚偏離率達到90%[31]、蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis偏離率達到77.5%[38]等，可能是由于人工養殖過程中，奠基者效益以及非隨機交配較嚴重，導致群體中純合子增加，雜合子缺失，使養殖群體的遺傳結構遭到破壞。本文進一步分析5個養殖群體的偏離情況，發現浙江和廣西群體HWE平衡偏離率較高，人工選擇力度較低。

4 結論

本文利用9對引物在5個棘胸蛙養殖群體中進行遺傳多樣性分析，結果顯示：棘胸蛙5個養殖群體呈現中度偏高的遺傳多樣性，群體間呈現高度分化，而群體內部則出現遺傳多樣性降低的現象，且嚴重偏離HWE 平衡，推測可能是瓶頸效益和奠基者效益導致了近親繁殖現象。因此，建議在人工養殖棘胸蛙的過程中，應盡量擴大選育范圍，避免近親繁殖，同時，定期從外地良種場引進良種作為繁殖親本，提高親本遺傳多樣性。