糖尿病視網膜病變相關標志物的研究進展△

張春會 查 旭 張遠平

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病(DM)微血管病變中最嚴重和最常見的并發癥之一,隨著DM患病率的不斷增加[1],DR的患病率也呈現上升趨勢。數據顯示,我國DM患者中DR患病率約為22.4%[2],且存在種族和地域差異[3]。目前,DR的確切致病機制尚未完全明確,臨床依據其特異性的眼底改變可分為非增生型DR(NPDR)和增生型DR(PDR)兩階段,而糖尿病性黃斑水腫(DME)可出現于病程的任何階段[4]。既往研究表明,良好的血糖、血壓、血脂管理在DR防控中發揮重要作用,然而單獨預測DR風險的能力有限[5-6]。常規的臨床治療方案,如眼內注射抗血管內皮生長因子(VEGF)和類固醇藥物、視網膜激光光凝治療,治療周期較長,費用昂貴,且部分患者的治療效果不佳,病程后期往往還需聯合玻璃體切割術[7]。病情嚴重的患者還可能出現失明[8]、認知障礙[9],甚至增加心血管疾病的發病風險[10]。而及早發現和干預被認為是減少患者視力損害的關鍵[11],因此,尋找并發現能夠預測DR發生的影像學和生物學標志物顯得至關重要。

1 DR的影像學標志物

1.1 眼底彩色照相相關診斷標志物

眼底彩色照相是一種快速有效的DR篩查方法,2002年制定的基于7個標準化的30°眼底彩色照相的國際DR分期標準已被廣泛認可并應用于臨床診斷和治療中[4]。Muraoka等[12]研究證實,眼底彩色照相顯示的患者視網膜小靜脈擴張與DME發病相關。然而操作的復雜性限制了其在臨床篩查或基層醫院的廣泛應用。隨著現代超廣角(UWF)眼底成像系統的出現,給視網膜疾病的快速診斷帶來了曙光。UWF在單個視野中可捕獲渦靜脈前最少100°的視網膜圖像,相較于傳統的眼底照相能更好顯示周邊區域的病變,從而更準確地預測DR的活動[13]。

1.2 熒光素眼底血管造影相關診斷標志物

自1961年引入熒光素眼底血管造影(FFA)后,因其在顯示視網膜無灌注區、新生血管和血管滲漏等細節信息中的高敏感性,一直被認為是視網膜血管系統疾病的金標準成像手段。有研究通過比較輕度至中度NPDR患者的眼底彩色照相和FFA特征發現,FFA對DR的檢測準確率高于眼底彩色照相,同時FFA的檢測結果更有助于及時發現眼底彩色照相遺漏的周邊部病變[14]。隨著影像學技術的不斷革新,超廣角熒光素血管造影(UWFA)技術逐漸進入人們的視野,它通過新型的自動微血管瘤計數技術證明了微血管瘤數量的增加與DR嚴重程度之間存在關聯[15]。還有研究發現,PDR患者中央與周邊無灌注指數均大于NPDR患者,中央無灌注區面積擴大與患者黃斑中心凹下視網膜厚度增加和視力下降相關[16]。盡管其屬于有創操作,造影劑還可能引起過敏反應,但它依舊作為評估DR嚴重程度的一個最精準有力的工具,尤其在威脅視力的DR(VTDR)患者或有臨床意義的黃斑水腫(CSME)患者的診斷或激光光凝治療中更具優勢。

1.3 光學相干斷層掃描相關診斷標志物

光學相干斷層掃描(OCT)可對視網膜和脈絡膜的各個層次進行高質量無創性成像,臨床常用于視網膜疾病的診斷和監測治療反應。通常將黃斑中心凹1 000～3 000 μm區域[17]內層視網膜結構紊亂(DRIL)看作是DME較為可靠的標志物,定義為正常的神經節細胞層-內叢狀層復合物、內核層和外叢狀層結構紊亂,OCT表現為相鄰結構的邊界模糊。DRIL可反映視覺信息從光感受器到神經節細胞途徑的破壞。有研究顯示,它的存在可能是DR患者黃斑區域視網膜毛細血管出現無灌注區的可靠預測指標[18]。DR患者還表現為外層視網膜結構的改變。Maheshwary等[19]研究顯示,視網膜內外節(IS/OS)和外界膜連續性破壞可作為DR患者視力恢復欠佳的預測因子。OCT上視網膜各層次出現的界限清楚的高反射點與小膠質細胞的活化和積聚有關,提示視網膜活動性炎癥的存在,被視為是DR患者視力預后不佳的生物標志物[20]。在OCT上外界膜(ELM)和橢圓體帶完整性的破壞[21]、黃斑中心凹下神經視網膜脫離[22]等改變也受到了臨床醫生的關注并可作為DR發生發展或監測治療反應的可靠標志物。作為供給部分外層視網膜血供的脈絡膜,其解剖結構或血管系統的破壞也可能影響患者視網膜功能。ünlu等[23]對DR患眼進行研究發現,黃斑中心凹下脈絡膜厚度與DR的嚴重程度呈正相關。脈絡膜血管指數(CVI)被認為是評估脈絡膜血流灌注情況相對穩定的指標,有研究發現,DR患眼的CVI與健康眼相比顯著降低,且隨著DR嚴重程度的加劇,CVI明顯降低[24],提示CVI的改變可作為DR存在或進展的一個可靠標志物。關于脈絡膜改變對DR 的影響目前存在較多爭議,臨床仍需進一步研究,探索更為準確的評估DR發生發展的臨床影像學標志物。

1.4 光學相干斷層掃描血管造影相關診斷標志物

光學相干斷層掃描血管造影(OCTA)是新興的一種無創視網膜微血管可視化方法,可顯示黃斑中心凹無血管區(FAZ)、視網膜淺層和深層毛細血管叢的血管信息。一些定量指標,如血管密度、血管直徑指數、分形維數、無灌注區面積和FAZ的面積/圓度等均已被應用于DR臨床標志物的篩選。Memon等[25]的研究表明,淺層視網膜的血管密度和灌注值隨著DR嚴重程度的增加而降低,并可能存在FAZ不規則改變,其面積也隨著疾病嚴重程度的增加而增加。Lei等[26]研究發現,DR患者的視網膜毛細血管和大血管的反應不同,視網膜大血管直徑每增加1 μm,DME發病率將增加1.9倍,而淺表毛細血管擴張1 μm,橢圓體帶破壞的發生率則增加3.9倍,考慮可能與視網膜高灌注引起的小動脈和小靜脈擴張所導致的黃斑水腫有關,并認為毛細血管的血管直徑是DR分期的潛在可靠指標[27]。然而,OCTA在識別微血管滲漏方面不如FFA靈敏,且操作過程中要求患者的配合度較高,否則可能存在偽影,一定程度限制了其臨床運用的范圍。

1.5 人工智能在DR診斷中的應用

面對龐大的DR患者群體,僅依靠有限的眼底病?？漆t生難以有效應對臨床上DR的篩查、診斷、隨訪等需求。隨著機器學習的迅猛發展,國內外學者已廣泛聚焦于人工智能(AI)在眼底疾病的應用,并在DR檢測方面取得了卓越的成績,突顯了其在DR篩查方面的超高效力[28]。有研究結合影像學檢查系統將AI技術與傳統的專家診斷對比發現,AI系統同傳統的專家診斷具有較高的一致性,并認為AI可應用于初級醫療機構的篩查工作[29]。此外,國外一項前瞻性多中心研究評估了由美國食品藥品監督管理局批準的基于云視網膜診斷軟件的自動DR檢測系統(EyeArt),結果顯示,通過分析眼底彩色照相上的DR改變,該系統在早期輕度DR和晚期VTDR檢測方面具有較高的安全性和準確性,能廣泛改善非眼科專業醫護人員對DM患者的DR篩查和監測[30]。然而,盡管AI在DR篩查中的優越性已得到了較多認可,但在臨床工作中仍面臨較多的挑戰,如數據獲取、分析指標、機器算法、經濟效益、相關的法律和道德問題。但是,隨著AI技術的不斷更新,憑借其獨特的優勢定會突破重重阻礙服務于臨床,為DR患者的診斷和治療提供幫助。

2 DR相關分子生物標志物的研究進展

DR是多因素作用所導致的疾病,僅單一的致病因素尚不能全面地解釋其發病機制。隨著DR患病率的增加,高通量的組學技術從多因素水平探索DR的致病機制成為熱點,以尋找更加精準的DR風險預測標志物。

2.1 基因組學分子標志物

DM屬于多基因遺傳病,連鎖分析、候選基因關聯和全基因組關聯研究均表明,遺傳因素在DR的發病中起著重要作用,尋找DR發病易感基因引起了較多關注[31-32]。據估計,DR的遺傳率為27.0%,而PDR的遺傳率則高達52.0%[33]。Li等[34]通過甲基化芯片評估2型DM患者的超過85萬個基因位點,首次在2型DM患者中檢測到與DR相關的差異甲基化區域和差異甲基化位點(DMS),結果顯示,S100A13基因中的DMS是DR的潛在生物標志物。葉酸主要在細胞分裂和分化中起作用,其中亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T的紊亂將會導致多種疾病的發生。一項基于我國人群的薈萃分析表明,MTHFR C677T多態性增加了DR的患病風險[35]。隨著新一代全基因組外顯子測序技術、數據分析的發展和研究樣本的擴增,基因組學研究將有助于發現新的生物標志物和治療靶點。

2.2 轉錄組學分子標志物

轉錄組學是從RNA水平研究生命體基因表達的情況,隨著測序技術的逐漸成熟,測序結果提供了更加精確和全面的DR早期分子標志物。由于DR早期的組織學標志是選擇性周細胞丟失,Rangasamy等[36]運用RNA測序和qPCR分析對DM小鼠模型中分離的視網膜周細胞進行轉錄組學分析,差異表達分析顯示,217個基因,如ext2基因、B3gat3基因、Gpc6基因、PIP5K1C基因和Pten基因表達顯著上調,495個基因,如NOTCH3基因、XBP1基因、Gpc4基因、Atp1a2基因和AKT3基因表達下調,并進一步驗證了NOTCH3基因在DR小鼠血-視網膜屏障改變中的作用。Shao等[37]則通過轉錄組學分析經低糖、高糖環境處理后人視網膜內皮細胞,獲得和轉甲狀腺素蛋白(TTR)相關的非編碼RNA(LncRNAs)和mRNA,首次構建了LncRNA-mRNA調控網絡,并獲得了853個TTR-mRNAs和48個TTR-LncRNAs,其功能涉及細胞周期、細胞凋亡、炎癥信號通路、氧化應激反應、新生血管和自噬,并證實LncRNAs MSTRG.15047.3和LncRNAs AC008403.3在DR患者房水和血清中的表達水平均顯著高于正常對照組,LncRNAs FRMD6-AS2的表達水平顯著低于正常對照組。

2.3 蛋白質組學分子標志物

技術的進步使得以全面的蛋白質性質研究為基礎的高通量蛋白質組學研究成為可能,通過檢測諸如房水、淚液、血清和玻璃體液等生物體液可以發現相關生物標志物。Song等[38]研究發現,DR患者房水中白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、VEGF、轉化生長因子-β(TGF-β)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等8種細胞因子在疾病發生發展中發揮一定作用,并可作為判斷DR嚴重程度的生物標志物和潛在治療靶點。此外,淚液中的脂質運載蛋白1抗體、乳轉鐵蛋白、溶菌酶C、內毒素、脂蛋白A和免疫球蛋白λ鏈[39-40]等也參與DR的進展。由于淚液未與視網膜系統直接接觸,能否通過檢測淚液蛋白成分來預測視網膜病變情況尚存在爭議。但考慮到DR患者視網膜血管系統的改變可以調節淚液的分泌,即使它未與視網膜直接接觸,一定程度上也可反映視網膜的改變。溫德佳等[41]通過液相色譜-串聯質譜技術分析了28例PDR患者和4例玻璃體混濁患者的玻璃體,并經過通路富集分析發現,Chemerin、Sema 4B、ApoB和HSP70可作為防治PDR的新靶點。通過全面揭示組織或細胞內蛋白質的表達狀況,臨床已運用蛋白質組學技術發現了多種疾病的分子標志物。因此,靈敏度高、特異性強的蛋白質組學技術的迅速發展有望為尋找可預測DR風險的潛在標志物提供有力的理論依據和解決途徑。

2.4 脂質組學分子標志物

脂質組學不僅提供關于單個脂質本身的信息,還提示特定脂質缺乏對整個生物體的影響[42]。有研究表明,DR與脂質代謝紊亂高度相關[43]。Koehrer等[44]將對照組和不同階段的DR患者紅細胞膜進行脂質體分析,結果顯示,各階段DR患者紅細胞磷脂和多不飽和脂肪酸均低于對照組。早期DR患者的主要病理特征是視網膜微血管高通透性,Ibrahim等[45]通過對人視網膜內皮細胞脂質體進行篩選發現,12/15-脂氧合酶可能通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶依賴機制參與DR的發生。脂質作為一種能量儲存形式,參與細胞活動的調節,由于脂質分子結構具有多樣性、復雜性等特點,目前對脂質代謝網絡和功能調控機制的研究不夠深入。隨著精準醫學時代的到來,脂質組學將被廣泛應用于生物標志物的發現和研究調控DR的病理生理機制。

2.5 代謝組學分子標志物

代謝物被認為是基因表達的終產物,與細胞的營養狀態及其他外界因素的影響密切相關,反映了細胞所處的環境,通過對代謝產物的深入研究,可以判斷機體的狀態。代謝組學是對某一生物或細胞在某一特定生理時期內所有低分子量(相對分子質量<1 000)代謝產物同時進行定性和定量分析的一門新興學科,借助高通量檢測和數據處理手段,以信息建模與系統整合為目標的系統生物學的一個分支[46]。Jin等[47]基于核磁共振的代謝組學研究方法,在老年性白內障、老年性白內障合并DM或DR患者的房水樣本中發現了25種主要代謝物,進一步的代謝通路分析顯示,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝在DR的發生發展中活性較高,因此,臨床可結合患者房水中一些小分子代謝物的改變來預測老年性白內障或合并DM患者術后DR發生發展的風險。Wang等[48]則運用氣相色譜-飛行時間質譜聯用方法在DR患者和非DM患者的玻璃體和房水樣本中發現了11種新的代謝產物,并通過代謝通路分析闡述了糖異生、抗壞血酸-醛酸代謝、纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸生物合成和精氨酸-脯氨酸的代謝異常在DR病程中的作用,認為它們可能為發現預測DR的診斷標志物和探索發病機制提供新的方向。但考慮到房水、玻璃體等生物樣本獲取過程的有創性,一定程度上限制了其在臨床篩查中的廣泛應用。國外有研究對DR患者和DM對照者的血漿樣本進行了非靶向代謝組學分析,結果顯示,126項代謝特征存在顯著差異,而通路分析顯示,精氨酸、瓜氨酸、谷氨酸半醛和脫羥基肉堿是造成這些途徑差異的關鍵代謝物[49]。代謝物作為基因組學的下游產物,最接近疾病表型,通過檢測DR患者的某些代謝產物尋找DR早期的生物標志物可開發一種較為完善的疾病診斷方法。

2.6 多組學技術在DR中的應用

隨著測序技術、質譜分析和生物信息學分析等技術的飛速進步,組學技術已廣泛應用于眼科領域,極大地推動了眼科學的發展,然而由于多因素疾病的復雜性,單一的組學技術并不能全面解釋疾病的發病機制。因此,采用先進的高通量測序和質譜等組學技術,整合多組學的數據和知識,系統地以動態、交互的思想揭示生命活動規律。有研究已將所取得的數據資源作為公開數據庫向公眾開放[50],這一舉措改變了單一組學研究的局限性。也有研究將腸道微生物組學和代謝組學技術相結合研究發現,PDR患者的腸道細菌豐度和菌群多樣性顯著降低,而微生物分類多樣性的喪失常被認為與系統性炎癥有關[51]。Wang等[52]整合轉錄組學和蛋白質組學的方法,在大鼠和人類的視網膜中均發現了miR-143顯著富集,并通過調節細胞基質黏附和調節缺氧誘導因子-1信號通路對內皮細胞活性產生負面影響,參與DR視網膜新生血管的形成。然而,一系列挑戰也隨著多組學技術的發展應運而生,如由于原始數據量龐大往往需要專業的生物信息人員先進行預處理、缺乏對跨組學研究的計算及分析方法等。因此,還需要進一步的努力來發現和驗證生物標志物作為診斷DR的有力工具,以便深入理解其發病機制從而創造早期個性化干預的機會。

3 結束語

機體長期處于高血糖的狀態下時2型DM患者最終可并發DR,然而,由于經濟或認知原因尚存在一些未被確診的2型DM患者,往往以視力下降等眼部癥狀首診于眼科,這可能會導致部分患者錯失最佳治療時機。因此,尋找能夠預測DR發生發展的相關影像學和生物分子標志物對于患者的篩查、治療和隨訪均非常重要?？紤]到生物過程本身的復雜性,單一的標志物難以全面準確地預測DR發生發展,應結合多組學技術及相關影像學標志物從而開發出更精準的可預測DR發生發展的特異性標志物,最大程度地保留患者的視力并減輕家庭及社會的經濟負擔。