分子印跡固相萃取–高效液相色譜法的優化及在測定植物油中苯并(a)芘含量的應用

李文廷，劉 玲,2，夏加恩，董玉英，冉亞莉，趙 麗?

（1. 昆明市疾病預防控制中心，云南 昆明 650228；2. 昆明醫科大學 公共衛生學院, 云南 昆明 650500；3. 昆明市東川區疾病預防控制中心, 云南 昆明 654100）

食用植物油是居民膳食的重要組成部分，也是補充人體所需營養物質的重要來源[1-2]。據報道中國居民平均每標準人日食用植物油的攝入量為37.1 g，食用油與人們的生活、健康息息相關，隨著經濟社會的發展及人們營養健康意識的增強，植物油在人體健康與疾病預防方面的影響受到極大重視，食用油的質量和安全性問題主要來自油料作物的種植、收獲、儲存、加工和使用等環節，特別是食用油品在加工環節的污染狀況引發人們的廣泛關注[3-5]。

苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]為多環芳烴類化合物，是世界上排名前三的強烈致癌性物質。苯并芘是由脂肪、膽固醇、蛋白質和碳水化合物等在高溫烘烤、干燥、熏制和烹調（煎、炸、烤、炒等）加工過程中，發生熱裂解、環化和聚合等反應形成，主要通過飲食進入人體，對人體很多器官例如眼睛，乳腺等造成危害[6-10]。我國標準GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》[11]規定了植物油中苯并(a)芘的限量為10 μg/kg。許多植物油如芝麻油、亞麻籽油、菜籽油等加工工藝采用壓榨法需要高溫炒籽，若溫度控制不佳就易導致苯并(a)芘超出國家限量標準[12-13]。地溝油中苯并芘的檢出率及超標率均保持高位值，并且地溝油流入市場的事件也是時有發生[14]，因此，對于食用植物油中苯并(a)芘的檢測尤為重要，保障居民對植物油食用的安全性。

目前，苯并芘的檢測方法主要有熒光分光光度法、高效液相色譜、氣相色譜-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用法等[15-22]，熒光分光光度法的樣品前處理步驟較為復雜，靈敏度較低，質譜法中苯并芘的碎片特征離子峰響應值較低，不易進行定性定量，而液相方法具有較高的靈敏度及較便捷的樣品處理方法。食品安全國家標準方法 GB 5009.27—2016《食品中苯并(a)芘的測定》[23]推薦的檢測方法主要是利用中性氧化鋁固相萃取小柱或分子印跡固相萃取小柱對樣品進行凈化。中性氧化鋁固相萃取柱對于其他種類的樣品較為理想，但通過實驗分析后，對于食用植物油的處理仍存不足之處，樣品過柱經氮吹或旋轉蒸發濃縮時，油脂較難去除，耗時較多，影響后續上機測定分析，對于批量樣品的監測較難開展，而使用分子印跡固相萃取凈化柱進行樣品前處理，具有操作便捷，有機試劑消耗較少，省時高效，樣品處理后凈化效果相對比較高，干擾色譜峰較少。有文獻報道采用分子印跡固相萃取小柱對植物油苯并芘的萃取凈化效果驗證[24]，通過兩種固相萃取凈化柱比對植物油中苯并芘的凈化效能[25]，使用串聯固相萃取凈化小柱去除油脂干擾成分研究[26]，而本文針對以上方法中存在的問題缺點以及結合實驗分析過程中檢測技術進行了研究，通過兩種固相萃取凈化效果分析，最佳檢測波長的選擇，多種流動相配比分離效果研究以及不同規格色譜柱選擇的考察，最終確定相關色譜技術的優化條件，針對植物油樣品建立具有分析簡單、高效便捷、準確性好、回收率高等優點測定苯并(a)芘的方法，使其應用于特別是批量的食用植物油樣品中苯并(a)芘的準確定量，對相關基層檢測部門具有指導意義，為政府職能部門提供技術及數據支持，保障居民的食品安全及大眾健康。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

本實驗樣品：市售抽查樣品，包括30件菜籽油、5件花生油、4件芝麻油、1件玉米油、1件核桃油，共計 41件，其中 83%的樣品采集于農貿市場小作坊制作成品。

1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜儀U3000：美國ThermoFisher公司；分析天平XS205DU：瑞士Mettler Toledo公司；智能臺式高速冷凍離心機3H16RI：湖南赫西儀器裝備有限公司。

標準物質苯并芘：中國計量研究院；中性氧化鋁柱和分子印跡柱：普瑞邦（中國）公司；甲醇和乙腈均為色譜純。

1.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×150 mm, 5.0 μm），柱溫為 35 ℃，激發波長：365 nm，發射波長410 nm，流動相A相：乙腈，B相：水，流動相配比為90%乙腈+10%水，流速為1.0 mL/min，進樣體積為20 μL，分析運行時間為10.0 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準溶液配制

乙腈中苯并(a)芘標準使用液(100 μg/L)：準確定量量取苯并(a)芘標準物質于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，用于標準曲線制作實驗分析，避光保存在0～5 ℃的冰箱中。

1.4.2 樣品前處理

稱取0.400 g植物油樣品，加入5.0 mL正己烷并旋渦混合0.5 min，采用苯并(a)芘分子印跡柱進行固相萃取凈化，先依次用5.0 mL二氯甲烷及5.0 mL正己烷將柱子活化，樣品溶液轉移到柱子，待液面降至柱床時，用6.0 mL正己烷淋洗柱子，棄去流出液。用6.0 mL二氯甲烷洗脫并收集，接著在40 ℃下氮氣吹干，準確吸取1.0 mL乙腈渦旋復溶0.5 min，過0.22 μm濾膜后待測。

1.5 數據分析

采集到的數據使用Chromeleon 7.lnk進行定性定量分析，樣品分析時通過樣品色譜峰保留時間進行定性，通過峰面積進行定量。

2 結果與分析

2.1 凈化方法的選擇

進行兩種凈化柱凈化效果的考察，樣品經正己烷溶解過中性氧化鋁柱，洗脫后分別采取直接氮吹法和減壓旋轉蒸發法兩種方法進行濃縮，經1 h長時間的濃縮均較難將油脂徹底去除，經乙腈復溶后，提取效果欠佳，整個前處理步驟所需溶劑及處理時間均較多，嚴重影響工作效率，不適宜批量樣品的處理。苯并芘分子印跡柱凈化實驗則較為高效，且凈化效果相對較為理想，樣品通過柱子凈化洗脫后，可直接進行氮吹濃縮，10 min即可近干，加入乙腈溶解過濾膜后即可上機測定分析，所需試劑及處理時間均較少，顯著提高了工作效率，特別適用于大批量樣品的處理，因此采取苯并芘分子印跡柱凈化方法進行樣品前處理，凈化效果如圖1所示。

圖1 加標樣品經固相萃取凈化后的色譜圖Fig.1 Chromatograms of spiked samples purified by solid phase extraction

2.2 檢測波長的考察

根據文獻查閱，目前苯并芘的檢測波長各異，通過選擇不同的激發波長（Excitation wavelength，Ex）和發射波長（Emission wavelength，Em），在相同色譜條件對 10.0 μg/L苯并芘標準溶液進樣1.0 μL進行測定考察分析，如表1實驗數據顯示，苯并芘的響應強度具有較大差異，在Ex / Em 384 nm/406 nm的條件下，雖然具有較大響應強度，但也具有較高的噪聲值，進而使信噪比降低，綜合信噪比數據，選擇Ex / Em 365 nm/410 nm為苯并芘的測定波長，具體色譜圖見圖2。

圖2 不同檢測波長的色譜圖Fig.2 Chromatogram at different detection wavelengths

表1 不同檢測波長的色譜參數Table 1 Chromatographic parameters for different detection wavelengths

2.3 流動相考察

分別對流動相組成和配比進行考察，如圖3所示，當有機相為乙腈時，隨著有機相比例增加，苯并芘色譜峰保留時間逐漸變小。當有機相為甲醇時，苯并芘的分離情況相對較差，但混合乙腈時有較大改善，具體實驗數據見表2。

圖3 不同流動相的色譜圖Fig.3 Chromatogram of different mobile phases

表2 流動相考察Table 2 Mobile phase inspection

改變流動相配比情況進行目標化合物分離效果分析，80%甲醇洗脫的色譜峰已經出現較大峰寬，峰型出現前沿及不對稱情況，70%甲醇洗脫時已沒有明顯的色譜峰顯示，60%乙腈和60%甲醇進行沖洗，未檢測到色譜峰，根據色譜圖出峰情況分析，從圖中可以看出，乙腈作為流動相比較適合苯并芘的洗脫，具有較高的響應，甲醇作為洗脫流動相未有理想的洗脫效果，因此選擇90%乙腈–10%水作為苯并芘的洗脫流動相。具體譜圖情況如圖3所示。

由于樣品基質較為復雜，從樣品加標回收實驗的色譜圖圖4可以看出，前期有較大的溶劑雜質峰，若再增加有機相的比例，目標峰和雜質峰將會重疊，達不到目標峰的分離效果，所以不適合用純的有機相進行苯并芘的洗脫。

圖4 樣品加標回收色譜圖Fig.4 Standard-added recovery chromatogram

2.4 色譜柱選擇

分別考察了采用Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm, 5.0 μm）250 mm 及 Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×150 mm, 5.0 μm）對樣品進行檢測分析情況，根據檢測結果分析不同色譜柱柱效，使用相同的流動相條件進行洗脫時，短柱子能有效提高工作效率，減少試劑的使用量，經濟環保。如圖5顯示，色譜峰保留時間具有較大差異，所以選擇150 mm的柱子進行實驗分析。

圖5 不同柱長的分離色譜圖Fig.5 Separation chromatograms of different column lengths

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系

用乙腈將苯并芘標準使用液稀釋制備成濃度為 0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L 的標準系列溶液，在上述條件下進行測定，以濃度X為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線進行線性回歸，在0.3～20 μg/L 范圍內具有良好的線性關系，線性方程為y=6 640.404 4x+0.301 7，相關系數r=0.999 9。標準曲線色譜圖重疊圖見圖6所示，保留時間標準偏差為 0.35%，說明重復性較穩定，以 3倍信噪比計算得方法檢出限0.05 μg/kg，以 10倍信噪比得方法定量限 0.10 μg/kg，滿足實驗室檢測定量要求。

圖6 標準曲線色譜重疊圖Fig.6 Standard curve chromatogram overlay

2.5.2 方法回收率

選取苯并芘本底值未檢出的樣品，進行分子印跡柱凈化方式的加標回收實驗，加入標準物質使濃度為1.0、5.0、10.0 ng/mL，按照樣品前處理條件進行處理并上機測定，每個添加濃度做6個平行實驗，方法的平均回收率為87.6%～95.9%，RSD為1.08%～2.16%，數據見表3，實驗數據表明分子印跡柱凈化方法具有較高的回收率，相對標準偏差較小，處理植物油中苯并芘較為理想。

表3 苯并芘的加標回收率和精密度（n=6）Table 3 Scaling recovery rate and precision of benzopyrene (n=6) %

2.5.3 方法重復性

選取苯并芘本底值檢出的樣品進行重復性實驗分析，精確稱取樣品6份，按照樣品前處理條件進行實驗分析，計算相對標準偏差作為方法的精密度，精密度為 1.13%，表明實驗方法的重復性較強。檢測數據見表4。

表4 苯并芘的精密度（n=6）Table 4 Precision of benzopyrene (n=6)

2.6 實際樣品檢測

按照上述實驗方法對市場銷售的 41份樣品進行檢測，檢出16份，檢出率為39.0%。其中菜籽油檢出為13份，菜籽油檢出率為43.3%，占檢出樣品的 81.2%；花生油、芝麻油和核桃油各檢出1份，分別占檢出樣品的6.2%。散裝樣品檢出9份，散裝樣品檢出率為 47.4%，占檢出樣品的56.2%；預包裝樣品檢出 7份，預包裝樣品檢出率為 38.9%，占檢出樣品的 43.8%。根據國家標準GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》規定，植物油中苯并(a)芘的限量為10 μg/kg，共計 1份樣品超過標準限值，超標率為2.4%。檢測結果說明散裝植物油的檢出率比預包裝的高，菜籽油的檢出率遠高于其它類型的植物油，超標的樣品為榨油小作坊制造的散裝菜籽油。實驗測定結果表明，所采集的植物油合格率為97.6%，整體上植物油的食用較為安全。

3 結論

通過優化的分子印跡固相萃取超高效液相色譜檢測方法對植物油中苯并（α）芘含量進行檢測分析，實驗結果表明，分子印跡固相萃取柱更加適合處理植物油樣品，樣品經分子印跡柱萃取凈化后干擾基質較少，采用優化的檢測波長及流動相條件，苯并芘具有較好的色譜峰響應值及信噪比，選擇短程柱子能有效提高工作效率。該方法具有回收率高，精密度好，結果穩定，操作過程便捷，所需時間及試劑均較少，對環境比較友好，便于提高日常檢測工作效率，更加滿足于當前快節奏、多任務和樣品量多的檢測要求，適用于食用植物油中苯并芘的批量檢測及污染監測情況分析。但該方法中所使用的固相萃取柱存在成本問題，后續可開展液液萃取樣品中苯并芘的研究，減少檢測成本的投入，更加簡化樣品的前處理步驟，提高工作效率。