紫外分光光度法檢測海南霉素的研究

池可心，姚衛蓉?

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

海南霉素鈉（C47H79O15Na）是一種廣泛添加在雞、牛、羊等動物飼料中的新型一元酸聚醚類抗生素，主要用于防治球蟲病[1]、調節生長代謝[2-3]。海南霉素的上市產品為含 1%海南霉素純品的預混劑（球克），《中國飼料藥物添加劑使用規范》規定其預混合飼料規格為 10 mg/g，目前海南霉素用于預防球蟲病的使用以500～750 μg/g水平混飼（以海南霉素鈉預混劑計）[4]。

目前飼料中海南霉素檢測定量方法僅有液相色譜串聯質譜法[5]，海南霉素鈉預混劑生產過程中檢測方式僅有茴香醛衍生法–紫外分光光度法[6]，液相色譜串聯質譜檢測成本高，對研究人員操作要求高，需要開發一種成本低、簡單的方法以滿足在簡單條件下對海南霉素快速檢測方法，同時為海南霉素鈉預混劑生產控制中提供一種簡單、準確的檢測方法。

海南霉素沒有發光基團，要通過分光光度法檢測海南霉素，需要通過衍生法引入發色基團。目前聚醚類藥物常用的衍生劑有茴香醛[6]、香草醛[7]、對二甲氨基苯甲醛[8]、2,4-二硝基苯肼（DNP）[9]，本文前期嘗試用不同衍生劑對海南霉素進行衍生化，包括DNP、茴香醛[6]、香草醛、對二甲氨基苯甲醛，發現除DNP外，都能與海南霉素發生顯色反應。香草醛等衍生劑一般與濃硫酸、濃鹽酸配合使用，加濃酸的目的主要是使羧基脫水、提供酸環境。香草醛濃酸顯色原理是海南霉素與香草醛發生雙分子縮合生成共軛雙鍵系統，濃酸使目標物分子中羧基脫水，增加雙鍵結構，再經雙鍵位移等反應生成共軛雙鍵[10-11]，如圖1所示。本文擬利用對二甲氨基苯甲醛、香草醛衍生，通過調節衍生劑濃度、溫度、不同的酸及濃度對衍生條件進行優化，以達到較低的檢測限，建立一種低成本、操作簡單的方法檢測海南霉素，用于快速檢測飼料、海南霉素鈉預混劑中海南霉素的含量。

圖1 海南霉素衍生示意圖Fig. 1 Derivative diagram of hainanmycin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南霉素標準品：中國獸醫藥品監察所；海南霉素鈉預混劑（含1%海南霉素）：山東勝利生物工程有限公司；香草醛、茴香醛、對二甲氨基苯甲醛（分析級）：北京百靈威科技有限公司；鹽酸、硫酸、甲醇、乙醇（分析級）：上海國藥集團有限公司；雞飼料，石家莊正大飼料。

1.2 儀器與設備

小型高速粉碎機：河北本辰科技有限公司；VORTEX-GENIE2型SI可調速漩渦混合器：美國Scientific Industries公司；SHZ-B水浴恒鍋：上海晶談儀器制造有限公司；T10系列雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；干式氮吹儀：上海梓桂儀器有限公司；Thermo Scientific臺式離心機：美國 Thermo Fisher Scientific；Milli-Q 超純水系統：美國 Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 對二甲氨基苯甲醛衍生劑的制備與檢測

對二甲氨基苯甲醛衍生劑：90 mL無水乙醇，加入3 g對二甲氨基苯甲醛，超聲溶解后置于冰水中，緩緩加入10 mL濃硫酸，混勻，避光保存，兩周內有效。

稱取海南霉素鈉標準品用乙醇稀釋至 20～200 μg/mL得到一系列不同濃度稀釋液，取樣品溶液 0.6 mL（以無水乙醇為空白對照）、顯色劑0.4 mL置于10 mL 具塞試管內，渦旋震蕩1 min混勻，放入90 ℃恒溫水浴中5 min，取出試管后用冷水冷卻，在λmax= 600 nm處測得其吸光度值，以海南霉素濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 香草醛衍生劑的制備與檢測

香草醛衍生劑：4 g香草醛溶于80 mL乙醇中，攪拌溶解，置于冰水中，緩緩加入20 mL濃鹽酸，搖勻后放置4 ℃冰箱保存，兩周內有效。

稱取海南霉素標準鈉鹽標準品用乙醇稀釋至5～50 μg/mL得到一系列不同濃度稀釋液，取樣品溶液 0.6 mL（另取無水乙醇為空白對照），置于10 mL具塞試管內，加入0.4 mL香草醛衍生劑，渦旋震蕩1 min混勻，放入90 ℃恒溫水浴中反應5 min，在λmax= 590 nm處測得其吸光度值，以海南霉素濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，衍生示意如圖1。

1.4 香草醛衍生條件的優化

1.4.1 酸種類與濃度對吸光度值的影響

在反應溫度75 ℃、反應時間35 min香草醛濃度4%（g/100 mL）的條件下，加入不同濃度的鹽酸、硫酸配置衍生劑，硫酸濃度分別為2.5%、5%、10%、15%、20%，鹽酸濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%，以海南霉素濃度10 μg/mL按照1.3.2檢測方法分別測得吸光度值。

1.4.2 香草醛濃度對吸光度值的影響

固定反應溫度75 ℃、反應時間35 min，以鹽酸濃度20%配置衍生劑，香草醛濃度分別為1、2、4、6 g/100 mL，以海南霉素濃度10 μg/mL按照1.3.2檢測方法分別測得吸光度值。

1.4.3 反應溫度、時間對吸光度值的影響

香草醛濃度 4%，鹽酸濃度 20%，配置衍生化試劑，量取衍生化試劑液0.4 mL于10 mL具塞試管中，加入0.6 mL乙醇–海南霉素標準品溶液（海南霉素濃度為10 μg/mL），渦旋震蕩1 min搖勻，分別放置 65、75、85、90 ℃水浴中反應5、15、25、35、45、55 min后，取出冷卻至室溫，在590 nm處測得最大吸光度值。

1.4.4 衍生劑占反應總體積比對吸光度值的影響

香草醛濃度 4%，鹽酸濃度 20%，配置衍生化試劑，量取衍生化試劑0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL于10 mL具塞試管中，分別加入0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.3 mL的乙醇–海南霉素標準品溶液（海南霉素含量均為10 μg），渦旋震蕩1 min搖勻，置90 ℃水浴中反應5 min，取出試管冷卻至室溫，在590 nm處測得最大吸光度值。

1.4.5 衍生反應后產物穩定性考察

取樣品溶液0.6 mL海南霉素10 ug/mL（另取乙醇為空白對照），置于10 mL具塞試管內，加入0.4 mL一定濃度的香草醛4%–鹽酸20%乙醇溶液（現用現配），渦旋震蕩 1 min混勻，放入90 ℃恒溫水浴中避光反應5 min后在590 nm處測得其吸光度值，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、12 h時間段監測其紫外吸收變化情況，考察其衍生反應物的穩定性。

1.5 飼料中海南霉素的檢測

在空白雞飼料中加海南霉素，制得含有5、10、50 mg/kg海南霉素水平的樣品飼。稱取2 g雞飼料，置于50 mL離心管內，加入8 mL乙酸乙酯，震蕩提取2 min，放入超聲清洗機中，超聲提取5 min后，用離心機5 000 r/min離心5 min后取上清，轉移至燒瓶中，于45 ℃旋轉加熱蒸發至近干，然后加入2 mL乙腈復溶，取出至離心管中，再加入2 mL乙腈飽和正己烷溶液震蕩1 min，用離心機在5 000 r/min下離心5 min，去除正己烷層溶液，將下層溶液用氮氣吹至近干，加入 0.6 mL 90%乙醇溶液復溶，轉移至10 mL具塞量筒中，按照方法3.2.5進行檢測，測得590 nm處吸光度值，用基質匹配標準曲線計算回收率。

因為飼料基質在與香草醛衍生化時會有基質干擾，需要用基質標準曲線定量?？瞻罪暳咸崛艋?，用0.6 mL 5～50 μg/mL海南霉素標準溶液復溶，按照方法 1.3.2進行測定繪制基質標準曲線。

1.6 預混劑中海南霉素的檢測

對海南霉素鈉預混劑提取溶劑進行優化，在2 g海南霉素鈉預混劑，分別加入10 mL甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷，震蕩 2 min，超聲提取5 min，取0.5 mL定容至100 mL，取100 μL按照方法1.3.2進行檢測。

1.7 數據分析

所有實驗至少進行三次，用SPSS 25.0和EXCEL 2021對數據進行統計和分析，Origin 2021b軟件進行作圖處理。

2 結果與討論

2.1 對二甲氨基苯甲醛法

對二甲氨基苯甲醛對海南霉素衍生后，最大吸收波長在 600 nm處，對二甲氨基苯甲醛衍生條件進行優化，包括衍生劑濃度、衍生反應溫度、酸的種類及濃度等。在優化條件下結果見圖2所示，其最低檢測濃度為20 μg/mL，海南霉素濃度在 20～200 μg/mL與吸光度值線性擬合良好，R2＞0.99，但由于該方法檢測限高，不能滿足檢測飼料中低濃度的要求，因此此方法僅能適用于檢測標準品溶液和預混劑中高濃度海南霉素檢測。

圖2 對二甲氨基苯甲醛衍生海南霉素紫外分光圖和線性回歸擬合圖Fig. 2 UV spectra and linear regression fitting of Hainanmycin derivatived by p-methylaminobenzaldehyde

2.2 香草醛法

香草醛對海南霉素衍生后，最大吸收波長在590 nm處，對香草醛衍生條件進行優化，衍生劑濃度、溫度，使用酸濃度等，如圖3所示其最低檢測濃度為5 μg/mL，海南霉素濃度與吸光度值線性擬合均良好，R2大于0.99，能滿足檢測飼料中低濃度的要求，此方法能適用于檢測標準品溶液、飼料中常量級海南霉素檢測、預混劑中高濃度海南霉素檢測。

圖3 香草醛衍生海南霉素紫外分光圖和線性回歸擬合圖Fig. 3 UV spectra and linear regression fitting of vanillin-derived hainanmycin

2.3 酸種類與濃度對香草醛衍生吸光度值的影響

如圖4所示，使用不同濃度硫酸、鹽酸配置香草醛衍生劑，在相同的反應條件下，香草醛衍生劑使用硫酸、鹽酸的最佳濃度分別為10%、20%時效果最好，使用20%鹽酸時效果優于10%硫酸，因此，決定使用20%鹽酸作為香草醛衍生劑的使用酸及濃度。

圖4 不同酸及使用濃度對海南霉素衍生化效果Fig. 4 Effect of different acids and concentrations on derivative hainanmycin

2.4 香草醛濃度對香草醛衍生吸光度值的影響

在相同反應條件下，75 ℃水浴加熱35 min，以鹽酸濃度為20%，香草醛濃度分別為1、2、4、6 g/100 mL配置不同香草醛含量的衍生劑，結果如圖5所示，隨著香草醛濃度的升高，衍生效果越好，當香草醛含量為 4%時，在海南霉素相同濃度下衍生產物吸光度值最高，當再增加香草醛的含量時，衍生效果反而變差、吸光度值下降，因此選擇香草醛含量為4%時配置衍生劑。

圖5 不同香草醛濃度衍生劑衍生效果Fig. 5 Effects of different vanillin concentration derivatives on derivatization

2.5 反應溫度、時間對香草醛衍生吸光度值的影響

如圖6所示，在反應溫度 65 ℃時，吸光度值隨著反應時間的增加而呈現緩慢增加的趨勢；在反應溫度 75 ℃時，吸光度值隨著反應時間先增加后降低的趨勢，反應時間為35 min時吸光度值達到最大；在反應溫度85 ℃時，吸光度值隨著反應時間先增加后降低的趨勢，反應時間為15 min時吸光度值最高；反應溫度 90 ℃時，在 5 min時吸光度值就達到最高，隨著反應時間延長吸光度值下降，乙醇逐漸蒸干，海南霉素也可能在高溫下分解。因此選擇溫度90 ℃、時間5 min作為最佳反應時間和溫度。

圖6 不同反應溫度和時間對香草醛衍生海南霉素的影響Fig. 6 Effect of different reaction temperature and time on vanillin-derived hainanmycin

2.6 衍生劑占反應總體積比對香草醛衍生吸光度值的影響

如下圖7所示，控制反應總體積為1 mL，隨著衍生劑占反應總體積比增高，吸光度值呈現先升后降的趨勢。衍生化試劑與乙醇溶液反應體積比4∶6時，吸光度值達到最大；體積占比超過 4∶6后，吸光度值逐漸降低，可能衍生化試劑濃度過高影響其與香草醛發生縮合，導致海南霉素反應不充分，因此選擇最適宜的衍生化體積比為4∶6。

圖7 衍生劑體積與乙醇反應體積比對海南霉素衍生化影響Fig. 7 Effect of the ratio of derivative volume to ethanol reaction volume on the derivatization of hainanmycin

2.7 香草醛衍生反應后產物穩定性考察

如圖8所示，此顯色反應很穩定，反應后產物在1 h內吸光度下降不足5%，且在12 h內顯色度都無明顯變化。因此，此衍生反應生產的衍生物很穩定，能夠滿足檢測需求。

圖8 顯色反應穩定性Fig. 8 Color reaction stability

2.8 香草醛其他聚醚類抗生素衍生反應

用香草醛同樣對馬杜霉素、莫能菌素[12]、鹽霉素進行衍生反應（20 μg/mL），在400～800 nm波長掃描下，如下圖9所示，其各自最大吸收波長分別為464、517、522 nm，與海南霉素590 nm能夠明顯區分開來，說明香草醛衍生海南霉素的衍生產物具有可分辨的獨特性。

圖9 香草醛衍生不同聚醚類藥物的紫外光譜圖Fig. 9 UV spectrum of vanillaldehyde derived different polyether drugs

2.9 飼料中海南霉素的提取溶劑選擇

稱取2 g雞飼料，分別使用不同的提取試劑乙酸乙酯、乙腈、甲醇、異辛烷、90%乙腈水按照1.5方法進行提取凈化，并用香草醛衍生劑按照方法1.3.2進行檢測，測得590 nm處吸光度值，用基質匹配標準曲線計算回收率。如圖10所示，乙酸乙酯的回收率較高，因此使用乙酸乙酯作為飼料中海南霉素的提取溶劑。

圖10 不同溶劑提取飼料中海南霉素回收率（n=3）Fig. 10 Recovery rate of hainanmycin from feed by different solvents (n=3)

2.10 預混劑中海南霉素的提取溶劑選擇

對比甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異辛烷提取海南霉素鈉預混劑（1%海南霉素）的回收率，結果圖11所示，相同的條件下，甲醇的回收率最高，理論回收率高達93.3%～100.0%，乙醇、甲醇、乙酸乙酯次之，甲醇更適用于海南霉素鈉預混劑的提取，回收率最高。

圖11 不同溶劑提取海南霉素鈉預混劑回收率（n=3）Fig. 11 Recovery rates of hainanmycin sodium premix extracted with different solvents

2.11 方法學考察

2.11.1 飼料中海南霉素的檢測

前處理按照方法 1.3.2進行，海南霉素 5～50 μg/mL濃度范圍內，計算出飼料基質匹配標準曲線為 y = 0.021 9x + 0.044 4，R2＞0.99，由 3σ/K計算出LOD為1.6 μg/g，定量限為4.8 μg/g。雞飼料在5、10、50 μg/g海南霉素加標水平下，每個加標水平三個平行，回收率如表1所示，在75%～94%，通過分析這些加標樣品，計算日內精密度，一天重復3次。日內相對標準偏差為3.1%～11.2%，小于 15%，能夠滿足飼料中海南霉素檢測需求。

2.11.2 市場產品的實際檢測結果

由山東勝利公司提供的海南霉素鈉預混劑（1%海南霉素），按照方法 1.6進行提取，按照1.3.2香草醛衍生法方法進行檢測，計算預混劑中海南霉素含量，每個樣品三個平行，一天重復三次計算日內相對精密度。結果如表2所示，本方法的回收率在 83%～101%，日內相對標準偏為4.7%～5.7%，均小于15%，滿足檢測需求。

表2 市場產品的實際檢測回收率和相對標準偏差Table 2 Recovery rate and relative standard deviation of hainanmycin %

3 結論

本文通過對二甲氨基苯甲醛法、茴香醛法對海南霉素進行衍生，能夠對飼料、預混劑中海南霉素檢測。同時優化了飼料和預混劑中海南霉素的提取條件，乙酸乙酯用于飼料中提取、甲醇用于海南霉素鈉預混劑提取效果較好，香草醛衍生法在飼料和預混劑中回收率分別 75%～94%、83%～101%，相對標準偏差分別為 2.7%～8.4%、5.2%～7.3%，方法靈敏度高、特異性強、簡單快速，且能夠與其他聚醚類抗生素與香草醛衍生后的產物區分開來（最高吸收波長不同），香草醛衍生后海南霉素590 nm，鹽霉素522 nm，馬杜霉素464 nm，可以作為測定飼料和海南霉素鈉預混劑中海南霉素含量的一種有效手段。