芽孢桿菌源Fengycin合成調控研究進展

王一凡,張飛燕,孟祥荷,王雅娜,米婧璇,劉洪偉 ,趙山山,張麗萍

(1.河北工程大學,河北 邯鄲 056009;2.河北省科學院生物研究所,河北 石家莊 050052;3.河北省人民醫院,河北 石家莊 050057)

0 引言

Fengycin是芽孢桿菌屬微生物的次級代謝產物[1],是芽孢桿菌發揮抗生作用的重要物質[2],其結構、合成方式、特性、功能等不斷被發掘。在結構上,由于Fengycin的脂肪酸部分如長度、分支、羥基化和肽鏈中氨基酸的類型及序列不固定,可以有多個組合,常以多個同系物的混合形式共存于細胞中。Fengycin具有低生態毒性、溫和的生產條件、較高的穩定活性以及高度的生物降解性等優點,且在馬鈴薯晚疫病[3]、棉花黃萎病[4]、辣椒疫霉病[5]、水稻米曲霉病[6]、蘋果青霉病[7]等多種植物病害,雞禽流感[8]等動物病害以及結腸癌[9]和腫瘤[10]等人類臨床疾病上都有一定的應用價值。但目前Fengycin產量低、生產成本高,嚴重限制了其生產應用。本文在闡述Fengycin生物合成的基礎上對發酵工藝優化、誘變育種及基因工程理性設計提高發酵水平進行綜述,以期為解決Fengycin產量低等問題提供理論參考。

1 Fengycin的生物合成

Fengycin是由非核糖體途徑合成的脂肽類活性物質,在菌體生長停止之后合成的微生物次級代謝產物。Fengycin的肽環是由第3位的D-Tyr和末位的L-Ile以內酯鍵結合而成,再與帶有14～18個碳原子的β-羥基脂肪酸以內酯鍵連接(圖1)。

由于肽環上第3、4、6、9、10位氨基酸的變化,不同碳原子數的脂肪酸以及構型的差異使得Fengycin也存在許多同系物和同分異構體,如Fengycin A[11]、Fengycin B[12]、Fengycin C[13]、Fengycin S[14]等(表1)。

Fengycin由非核糖體肽合成酶NRPS通過腺苷?；Y構域識別、結合特定的氨基酸,并由ATP激活,激活的氨基酸與4-磷酸泛酰巰基輔基以共價鍵形式結合,再與縮合結構域特定部位結合,在縮合結構域的作用下,按相鄰合成酶各組成模塊的順序依次向前直連接成多肽鏈。編碼Fengycin的操縱子fen由合成酶的基因fenC、fenD、fenE、fenA、fenB共同構成,分別編碼FenC、FenD、FenE、FenA和FenB單體酶,它們線性排列共享一個啟動子。每個單體酶一般含1～3個氨基酸激活模塊,且每個模塊具有接受特定氨基酸及形成相應肽鍵的功能[15]。Fengycin的合成途徑是啟動子啟動后,FenC組裝前兩位氨基酸L-Glu和D-Orn;FenD組裝第三、四位氨基酸D-Tyr和D-Thr;FenE組裝第五、六位氨基酸L-Glu和D-Ala;FenA組裝七、八、九位氨基酸L-Pro、L-Gln和L-Tyr;FenB組裝最后一位氨基酸L-Ile[16],組裝完成后中斷肽鏈合成從NRPS上釋放出Fengycin。

2 Fengycin的合成策略

Fengycin在農業、醫藥、食品等行業中都具有應用價值,但因其合成生產存在產量低、成本高和規模小等問題,限制了其產業化應用。目前只有MedChemExpress、SigmaAldrich等少數企業能夠微量生產。為了Fengycin能得到更加廣泛的應用,主要通過發酵工藝優化、誘變育種及基因工程理性設計等策略提高其產量。

2.1 發酵工藝優化

發酵條件優化可提高菌株的Fengycin產量。目前優化主要集中在發酵培養基組分及發酵條件。Wei等人[17]通過單因素試驗得到的培養基配方為木糖20.00 g/L、豆粕21.90 g/L、NaNO33.10 g/L、MnSO4·H2O 0.20 g/L,初始pH為7.50,轉速為180 r/min,發酵溫度為30 ℃,此發酵策略使菌株168DSABA的Fengycin產量提高了4.26倍。Maliheh等人[18]通過添加氨基酸來提高菌株UTB96的Fengycin產量,添加賴氨酸將Fengycin產量提高了27%,添加丙氨酸將Fengycin產量提高了47%。陳曉萌[19]通過響應面優化試驗得到的培養基配方為玉米粉3.85%、黃豆餅粉1.57%、FeSO4·7H2O 0.03%、NaH2PO4·2H2O 0.02%、Na2HPO4· 2H2O 0.04%,初始pH為7.00,接種量為8.50%,轉速為190 r/min,培養溫度為37 ℃,培養時間為33 h,用優化后的發酵條件進行發酵培養菌株Z-14使得Fengycin的產量提高了4.19倍。

2.2 誘變育種

通過菌種改造獲得高產Fengycin的菌株更具有實際生產意義,誘變育種是一種選育高產菌株的方法。陳尚里等人[20]通過紫外-ARTP-LiCl化學復合誘變選育高產菌株,先經紫外誘變,與野生型菌株YA-215對比,突變菌株mutUV503的Fengycin產量從113.02 mg/L提高到221.39 mg/L,將突變菌株mutUV503繼續ARTP-LiCl誘變,與突變菌株mutUV503對比,突變菌株mutUA397的Fengycin產量從221.39 mg/L提高到388.34 mg/L,復合誘變后Fengycin的產量提高了3.44倍。高兆建等人[21]采用紫外線-硫酸二乙酯化學復合誘變的方法,誘變菌株XF32,將突變菌株XF32-22所產Fengycin的抑菌活性提高了1.53倍。

2.3 基因工程理性設計

隨著合成生物學的發展,基于合成生物學基礎利用基因工程手段改造菌種對Fengycin的代謝途徑進行理性設計提高Fengycin的產量是未來的發展方向?；蚬こ淌侄沃饕瑔幼犹鎿Q、前體物質合成途徑設計、轉錄調控基因改造、分泌途徑改造等。

2.3.1 啟動子替換

Fengycin的合成基因簇長達37 kb,利用過表達方式來提高Fengycin的產量難度較大,而啟動子可以決定基因表達水平,因此替換fen啟動子成為提高產量的有效手段。替換啟動子主要是選擇天然強誘導型啟動子及人工嵌合誘導啟動子。Jin等人[22]將Fengycin生物合成基因簇的原生啟動子替換為階段依賴型啟動子PYLB,Fengycin產量從121.20 mg/L提高至137.05 mg/L。Yaseen等人[23]將來自B.subtilisBBG111的PPPS啟動子替換為來自BBG21的PFEN啟動子時,Fengycin的產量提高了約10倍。

2.3.2 前體物質合成途徑設計

在Fengycin合成過程中,脂肪酸及氨基酸前體的生物合成是第一步,前人對氨基酸及脂肪酸供應改變是否會影響Fengycin產量進行了相關研究。Gao等人[24,25]提高脯氨酸轉運相關基因opuE的表達量后,添加8.00 g/L外源脯氨酸,枯草芽孢桿菌Fengycin的產量從753.47 mg/L提高到871.86 mg/L;通過上調脂肪酸途徑中相關基因的表達,將Fengycin產量從174.63 mg/L升高至258.52 mg/L。Shu等人[26]分析了由fenE編碼的酶的功能,它包含兩個氨基酸激活模塊,FenE1和FenE2,FenE1激活L-Glu,FenE2激活和L-Ala、L-Val和l-2-氨基丁酸,這解釋了為什么枯草芽孢桿菌F29-3產生了兩種類型的Fengycin——Fengycin A和Fengycin B,與L-Ala相比,L-Val是FenE2體外更好的底物,這一發現與菌株F29-3產生的Fengycin B通常是Fengycin A的2倍的觀察結果一致。

2.3.3 轉錄調控基因改造

Fengycin的合成需要多種調控因子參與,可通過過表達或敲除這些調控因子的基因提高Fengycin產量。Lu等人[27]通過轉錄組分析發現培養基中添加果糖改變了氨基酸合成、脂肪酸代謝和能量代謝的轉錄,這些代謝途徑的改變有助于Fengycin的合成,使得Fengycin操縱子的表達水平提高了2倍。Gao等人[28]將編碼Dahms木糖利用途徑的基因整合到菌株168的amyE位點,并基于Dahms途徑的代謝特性,敲除乙酸激酶(ACKA)和乳酸脫氫酶(LDH)基因,將乙醛轉化為蘋果酸和草酰乙酸,乙醇醛再循環到TCA循環中,從而產生菌株BSU03,Fengycin的產量較原菌株增加了87%。

2.3.4 分泌途徑改造

對Fengycin分泌途徑的改造,可通過強化表達參與其分泌的跨膜蛋白增加產出。Fu等人[29]基于iTRAQ的菌株NCD-2蛋白組學分析PhoPR雙組分系統調控,與轉錄組學的比較分析揭示了支鏈氨基酸對Fengycin生成的調控,PhoPR雙組分系統(TCS)是一種信號轉導途徑,用于調節菌株的磷酸鹽饑餓反應,并調節低磷酸鹽條件下菌株NCD-2中Fengycin的產生,研究結果表明,PhoPR TCS通過影響支鏈氨基酸生物合成來調節Fengycin的產生。Zhao等人[30]對親本菌株ES-2-4和基因組重排菌株FMB72進行了比較蛋白質組學分析,以檢測差異表達的蛋白質,在鑒定的44個蛋白中,信號蛋白Com A和Spo0A可能在轉錄水平正調控Fengycin的合成。

3 展望

Fengycin具有低毒性、較高穩定性和高度生物降解性等優勢屬性,在農業、醫藥、食品等領域有很大的應用前景。Fengycin在實驗室研究階段已取得一定進展,但其大規模產業化仍受限于發酵工藝、生產菌種和生產成本等因素。展望未來,在發酵工藝方面,發酵液的泡沫分離及下游的提取純化等問題亟待解決。在誘變育種方面,開發新的高效誘變方法誘變高產菌株、新篩選方法減少高產菌株篩選的工作量。在基因工程理性設計方面,還需要探索效果更好的啟動子,尋找更合適的氨基酸及脂肪酸供應途徑,研究調控因子參與合成的方式,從而提高Fengycin產量。