血漿miR-9-3p的表達水平與2型糖尿病的關系及其臨床意義

孫雅楠　尹明潔　米穎　李斯

【摘要】? 目的? 探討代謝相關microRNA，microRNA-9-3p（miR-9-3p）在2型糖尿?。═2DM）患者血漿的表達水平，并評價血漿水平miR-9-3p對T2DM的診斷價值。方法? 選取2017年1月- 2019年6月醫院T2DM患者47例為T2DM組；健康人員28例為對照組。抽取患者靜脈血，提取miRNA，應用實時熒光定量PCR法（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR），檢測兩組血漿中miR-9-3p表達水平；應用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析血漿miR-9-3p對T2DM的診斷價值，評價診斷結果的真實性和一致性。結果? T2DM組血漿miR-9-3p的表達水平顯著升高（P<0.001）；ROC曲線顯示miR-9-3p對于T2DM的診斷價值，AUC=0.742（95%CI：0.628～0.857，P=0.0005）；以血漿miR-9-3p表達水平（2-?CT轉換后）>0.00985為診斷T2DM的標準，診斷結果顯示，靈敏度=68.085%，特異度=100.000%，具有較高的真實性，并且Kappa=0.614，診斷結果與實際結果高度一致，具有臨床應用價值。結論? T2DM患者血漿miR-9-3p的表達水平顯著升高，miR-9-3p對于T2DM精準診斷有一定診斷價值。

【關鍵詞】? ?microRNA-9-3p；2型糖尿??；ROC曲線

中圖分類號? R587.1? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）05--04

糖尿病分為4種類型，包括1型糖尿病、2型糖尿?。═2DM）、特殊類型糖尿病以及妊娠期糖尿病，其中T2DM患病率最高，以代謝紊亂為主要表現的終身性疾病。在T2DM病程中，患者體內的糖、脂代謝紊亂，并且其相關調節因子的表達水平也發生變化[1-3]。在人體代謝調節的眾多因子中，microRNA是重要的組成之一，它廣泛存在于體液、血液等人體循環系統中。研究表明miR-9-3p與體內糖代謝、脂類物質代謝調節相關，在胰島組織中的β細胞內，miR-9-3p高表達，發揮抑制胰島素分泌的作用[4-5]。還有報道顯示，miR-9-3p通過細胞內膽固醇調節因子，影響體內膽固醇等血脂的代謝。T2DM發病機制為胰島素抵抗及胰島素分泌絕對減少，miR-9-3p在這兩個過程中均有重要作用[6-7]。但國內外關于T2DM患者血漿中miR-9-3p表達水平的研究較少。本研究探討血漿miR-9-3p的表達水平與T2DM的關系及對T2DM的診斷價值。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

研究選取2017年1月至2019年6月醫院收治的T2DM患者47例為病例組（T2DM組）。糖尿病診斷標準：葡萄糖耐量試驗：15min內緩慢口服溶于300ml溫水內的無水葡萄糖粉75g，檢測空腹靜脈血糖≥7.0mmol/L，糖水負荷后2h靜脈血糖≥11.1mmol/L，即可診斷糖尿病。T2DM患者納入標準：①根據OGTT實驗，符合糖尿病診斷的患者；②體質量指數（BMI）為18.5～30.0；③無影響血糖代謝的相關疾病。排除標準：①檢出糖尿病自身抗體的患者，如已確診1型糖尿病的患者；②驗室檢查提示C肽水平極低甚至缺乏的患者；③藥物難治性血壓患者；④肝轉氨酶水平升高，如谷草轉氨酶≥正常值范圍上限的2.5倍；⑤慢性腎衰竭3級以上；⑥糖尿病急性并發癥如高深昏迷及酮癥酸中毒；⑦手術、外傷、感染及其它應激狀態為近3個月內發生；⑧有嚴重的其他系統性疾??；⑨正處于妊娠期、哺乳期的患者。同期選取年齡、性別等與T2DM組相匹配的健康人員28例為對照組。本研究由唐山工人醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2? 資料收集

內容包括研究對象的人口學資料、現病史、既往史、個人史、體檢及實驗室檢測資料等。

1.3? 實驗室檢測

1.3.1? 血漿中總RNA的提取? 本部分實驗使用mirVana Paris Kit試劑盒，根據試劑盒的說明書提取總RNA，并且本部分操作完成后，將標本存放于-80℃冰箱凍存。

1.3.2? cDNA的合成? 首先配置RT-PCR的反應體系，體系包括：10×緩沖液0.8μl、dNTP0.2μl、抑制劑0.1μl、RNA 4.5μl、無酶水體積為0.4μl、RNA 引物為1.5μl、RTase0.5μl（總反應體系為8μl），本部分實驗全過程于冰浴中完成。進一步設定反應的條件：16℃進行孵育60min、42℃孵育60min、85℃孵育5min、4℃無限循環保存。

1.3.3? qRT-PCR實驗? 首先配置qRT-PCR 反應體系，體系包括：2×TaqMAN universal PCR Master 混合物10μl、cDNA為4μl、無酶水5μl、TaqMAN probe1 μl（總反應體系為20μl）。設定反應條件為：95℃10min起始模板預變性，95℃15s中模板變性、60℃60s退火循環40次；本實驗每個樣本均做副管，并且進行重復3次，實驗結束后記錄實驗CT值，取平均值，后經2-?CT轉換后進行統計學分析。

1.4? 數據分析方法

采用SPSS 17.0以及GraphPAD Prism 5.0 統計軟件進行數據統計分析及作圖。計數資料計算百分率，兩組間率比較采用卡方檢驗；正態分布的計量資料使用“±s”表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料用M（P25，P75）來表示，兩組間中位數比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。應用ROC曲線評估血漿miR-9-3p的表達水平對T2DM的診斷效能，并篩選臨界值。計算靈敏度、特異度、Kappa值評價血漿miR-9-3p的表達水平對T2DM的診斷效果。P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? T2DM組與對照組基本特征比較

T2DM組及對照組性別、年齡、BMI、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇比較，差異無統計學意義（P>0.05）。T2DM組空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血紅蛋白水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.001），見表1。

2.2? 兩組血漿中miR-9-3p（2-?CT轉換）表達水平

血漿miR-9-3p在T2DM組的表達水平為0.050（0.005，0.500），對照組表達水平為0.007（0.005，0.009），T2DM組血漿miR-9-3p的表達水平顯著高于對照組，組間差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3? 血漿中miR-9-3p表達水平與T2DM關系的多因素分析

以是否T2DM為因變量（是=1，否=0），以血漿miR-9-3p表達水平是否升高（是=1，否=0）及上述分析中具有統計學意義的因素是否達標設定空腹血糖（<6.1mmol/L=0，>6.1mmol/L=1）；餐后2h血糖（<7.8mmol/L=0，>7.8mmol/L=1）和糖化血紅蛋白（<6.0%=0，>6.0%=1）為自變量，進行多因素Logistic回歸分析結果見表2。結果顯示，血漿miR-124表達水平與冠心病仍然存在關系（P<0.05），血漿miR-9-3p水平升高發生糖尿病的風險顯著升高，見表2。

2.4? ROC曲線分析血漿miR-9-3p對于T2DM的診斷價值

以健康人群為對照組，評價miR-9-3p對于T2DM的診斷價值，AUC=0.742，說明miR-9-3p對于T2DM診斷有一定準確性（95%CI：0.628～0.857，P=0.0005），見圖1，根據約登指數最大篩選臨界值為0.00985。

2.5? 血漿miR-9-3p用于T2DM的診斷結果

以血漿miR-9-3p表達水平（2-?CT轉換后）大于0.00985為診斷T2DM的標準，診斷結果見表3。結果顯示，血漿miR-9-3p診斷T2DM靈敏度68.085%，特異度100.000%，具有較高的真實性，并且Kappa值為0.614，診斷結果與實際結果中高度一致，具有臨床應用價值。

3? 討論

miRNA是一類由非編碼的單鏈小RNA分子組成的因子，功能是調節體內多種蛋白質類物質的表達。miRNA因子廣泛的存在于機體細胞內以及全身的循環系統之中。機體處于相對穩定狀態時，個體之間細胞及循環中的miRNA表達量是大致相同的，在機體出現某些特定的狀態下，如生長發育、疾病，細胞中miRNA表達水平會發生變化，調節細胞功能，或細胞崩解加劇，大量miRNA釋放如血漿，可以檢測到血漿中miRNA量發生變化。miRNA調節蛋白質表達，血漿中miRNA的變化是要早于蛋白類標記物[8]，檢測血漿miRNA表達水平能夠預測疾病的發生。

miR-9-3p基因定位于15號染色體，是miRNA家族中的組成之一，首次的功能研究被認為是一種腦源性相關的miRNA，在血管性癡呆中研究顯示，海馬中miR-9-3p表達水平顯著下調，突觸相關蛋白97（SAP97）是一種眾所周知的與突觸功能相關的基因，在海馬神經元上進行的體外實驗表明，miR-9-3p負調節SAP97的表達。然而目前國外研究表明，miR-9-3p還具有調節胰島素分泌、促進胰島素抵抗的作用，因此miR-9-3p在糖尿病相關的研究較受關注[9-10]。miR-9-3p在調節胰島素分泌過程中起到重要作用，如研究證實：當胰島β細胞中miR-9-3p表達量升高時，加強其抑制胰島素分泌的功能，機制可能是通過轉錄后的翻譯抑制過程[11]。還有研究證實：在高糖模型中，如高血糖刺激，可以檢測到胰島β細胞中miR-9-3p顯著升高，之后調控凋亡蛋白表達降低[12]。還有學者發現，相較于正常人在糖尿病患者外周血細胞中miR-9-3p表達水平也是升高的，并且糖尿病患者還存在脂代謝紊亂[13]。本研究顯示與健康對照組相比，T2DM組血漿中miR-9-3p表達水平顯著升高，并進一步通過ROC曲線分析血漿miR-9-3p對于T2DM的診斷價值，結果顯示：以體檢健康人群為對照組，miR-9-3p對于T2DM精準診斷有一定準確性。以上結果說明血漿miR-9-3p有望成為T2DM精準診斷的潛在分子標記物。

本研究證實T2DM患者血漿miR-9-3p表達水平較健康人群產生顯著差異。代謝相關microRNA，miR-9-3p在病理生理過程中可能發揮促進T2DM進展的作用，本實驗為T2DM精準診治提供新型分子標記物。

4? 參考文獻

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[2023-01-09收稿]