基于GC-MS的6種石斛花朵揮發性成分分析*

徐堅旺,江海都,陳泰國,熊忠臣,韋 霄,柴勝豐**

(1.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所,廣西植物功能物質與資源持續利用重點實驗室,廣西桂林 541006;2.桂林醫學院藥學院,廣西桂林 541004)

石斛屬(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)植物第二大屬。在中國,石斛屬植物種類超過80種,主要分布于云南、廣西、貴州、四川、廣東等省區[1]。石斛被譽為九大仙草之首,種類繁多,分布地區廣。不同種類的石斛花朵具有不同的外部形態、花朵結構、顏色以及揮發性氣味,且花期長,觀賞性強,深受國人喜愛[2]。部分石斛除了觀賞價值,還具有較高的藥用價值,有抗癌[3]、抗氧化[4]等功效。植物的花香具有提高觀賞價值、幫助繁育、抵御侵害等作用。研究人員從植物花朵中分析出的各種揮發性物質,促進了精油、護膚品等衍生產品的開發。呂素華等[5]采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結合氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術,從鐵皮石斛(D.officinale)花朵中共分析出的51個揮發性成分以萜烯類、脂肪族類和芳香族類為主。王元成等[6]采用HS-SPME結合GC-MS技術分析了細葉石斛(D.hancockii)和翅梗石斛(D.trigonopus)花朵的賦香成分,共發現揮發性成分87個,細葉石斛花朵中含有52個,翅梗石斛花朵中含有35個,且主要成分種類皆為萜烯類,二者共有的主要成分為羅勒烯和β-石竹烯。

傳統的植物揮發油成分提取方法主要有水蒸氣蒸餾法(SD)、索氏提取法等[7],傳統方法成本低,但耗材過多,提取效率低。固相微萃取法(SPME)是將取樣、濃縮、進樣一體化,可結合其他檢測儀器聯合使用,具有檢測快速、重現性好等特點[8,9]。宋小蒙等[10]分別采用SPME和SD兩種方法提取金釵石斛(D.nobile)花朵揮發性成分,發現兩種方法雖然共鑒定出69種化合物,但兩者相差較大,其中采用SPME方法分析出63種化合物,而采用SD法僅分析出24種化合物。因此,本研究使用SPME法結合GC-MS技術,測定并分析羅河石斛(D.lohohense)、球花石斛(D.thyrsiflorum)、喇叭唇石斛(D.lituiflorum)、紫瓣石斛(D.parishii)、黃石斛(D.catenatum)和始興石斛(D.shixingense)花朵的揮發性成分,擬為香型石斛的繁育及其精油、化妝品等衍生產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為栽培于廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所石斛種質資源圃的羅河石斛、球花石斛、喇叭唇石斛、紫瓣石斛、黃石斛和始興石斛。

1.2 儀器

手動固相微萃取進樣器(美國SUPELCO公司),50 mL棕色螺紋取樣瓶,氣相色譜-質譜儀GC-MS (6890N-5975B,美國Agilent公司),水浴鍋(上海精學科學儀器有限公司)。

1.3 GC-MS分析

根據不同石斛的花期,在2022年5月上旬10:00-12:00,摘取6種石斛正在盛開的花朵,平均每種采摘5朵,放入50 mL棕色螺紋取樣瓶中保存,插入提前處理好的50/30 μm PDMS/CAR/DVB 纖維頭,設置溫度為40 ℃,頂空萃取30 min。萃取結束,將纖維頭拿出,使用GC-MS進行分析。每種實驗重復3次。

色譜條件:HP-5MS石英毛細管色譜柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);流速1 mL·min-1;載氣為高純度氦氣(99.99%),不分流模式。程序升溫:進樣口溫度250 ℃,起始柱溫35 ℃保持2 min,先以5 ℃·min-1升至80 ℃,再以8 ℃·min-1升至180 ℃,最后以8 ℃·min-1升至250 ℃。

質譜條件:進樣口溫度維持在250 ℃,離子源溫度為230 ℃,電離方式為EI,電子能量70 eV,GC-MS傳輸線溫度為250 ℃,掃描范圍為30-500 amu。

1.4 鑒定方法

通過SPME法結合GC-MS技術得到6種石斛花朵的總離子流色譜圖,將色譜圖中各個波峰進行解析,得到相應的質譜圖,最后使用軟件Xcalibur1.2和美國國家標準與技術研究院(NIST98)中的標準物質譜圖庫及相關文獻中的物質數據進行比對,用離子流峰面積歸一化法計算所檢測出的揮發性成分的相對含量總占比。

2 結果與分析

2.1 6種石斛花朵中揮發性成分類別比較

根據6種石斛花朵中揮發性成分檢測結果,共鑒別出106種揮發性物質,其主要成分的種類為萜烯類、烷烴類、芳香族化合物、酯類、含氮化合物、酮類、醇類(表1)。由表1可知,不同種類石斛花朵揮發性成分的類別均不相同,6種石斛花朵的揮發性成分均含有萜烯類和烷烴類,羅河石斛和喇叭唇石斛萜烯類成分的相對含量較高,分別是88.68%和87.64%。球花石斛和黃石斛烷烴類成分的相對含量較高,分別為72.38%和40.47%。紫瓣石斛和黃石斛的烷烴類和酯類成分相對含量較高,紫瓣石斛的含量分別為31.42%、41.73%,黃石斛的含量分別為40.47%、39.19%。始興石斛與其他5種石斛不同,其組分中的醇類與烷烴類成分相對含量較高,分別為44.61%、32.57%。

表1 6種石斛的揮發性成分類別

球花石斛花朵的揮發性成分含有20種物質,其中有14種烷烴類成分,3種萜烯類成分,1種酮類,2種醇類,除烷烴類成分外,萜烯類、酮類、醇類的相對含量分別為17.45%、5.36%、4.83%。羅河石斛的揮發性成分含有18種物質,其中有11種萜烯類成分,4種烷烴類成分,1種芳香族化合物,1種酯類成分,1種含氮化合物,除萜烯類成分外,其余揮發性成分種類相對含量分別為7.48%、1.67%、1.29%、0.88%。喇叭唇石斛的揮發性成分所含物質最多,有45種,其中有20種萜烯類成分,10種烷烴類成分,7種芳香族化合物,4種酯類成分,3種酮類,1種醇類,除萜烯類成分外,其余揮發性成分種類相對含量相對較少,分別為3.47%、3.98%、4.42%、0.36%、0.13%。紫瓣石斛含有13種組分,其中2種酯類和2種烷烴類成分相對含量較高,分別為41.73%和31.42%,其余種類成分相對含量較低,1種萜烯類成分,3種芳香族化合物,3種含氮化合物,2種酮類,分別為3.21%、4.39%、4.90%、14.34%。黃石斛含有21種組分,其中5種烷烴類和2種酯類成分相對含量較高,分別為40.47%和39.19%,其余種類相對含量較低,3種萜烯類成分,1種芳香族化合物,6種含氮化合物,2種酮類,1種醇類,分別為5.17%、1.32%、11.13%、1.64%、1.10%。始興石斛的揮發性成分含有11種物質,其中3種烷烴類和3種醇類成分相對含量較高,分別為32.57%和44.61%,其余種類相對含量較低,4種萜烯類成分,1種酮類成分,相對含量分別為15.35%、7.48%。結果表明,不同種類的石斛花朵中揮發性成分類別和相對含量均存在差異,所含類別數量和相對含量并無明顯的關系。

2.2 6種石斛花朵揮發性成分分析

表2統計了采用SPME結合GC-MS技術從6種石斛花朵中所檢測出化合物匹配度≥80的揮發性成分。由表2可知,在6種石斛花朵中共檢測出106種揮發性物質。6種石斛花朵中均含有十甲基環戊硅氧烷,其在羅河石斛、喇叭唇石斛中相對含量較低,分別為1.35%、0.96%;在球花石斛、紫瓣石斛、黃石斛、始興石斛中相對含量均較高,分別為22.04%、25.86%、20.58%、21.66%,十甲基環戊硅氧烷是球花石斛、紫瓣石斛、黃石斛、始興石斛的主要揮發性成分之一。羅河石斛與喇叭唇石斛的揮發性成分以萜烯類為主,α-蒎烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯在羅河石斛中相對含量較高,分別為26.66%、22.96%、13.77%、9.31%、6.06%;喇叭唇石斛有45個揮發性成分,羅勒烯和佛術烯是其主要成分,二者的相對含量分別為73.98%和5.66%。紫瓣石斛和黃石斛揮發性成分的主要成分為酯類和烷烴類,{雙[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯為紫瓣石斛揮發性成分的主要成分,相對含量為41.40%;對甲苯甲酸十八烷基酯為黃石斛揮發性成分的主要部分,相對含量為37.96%。始興石斛較其他5種石斛不同,3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇為始興石斛揮發性成分的主要組成部分,其相對含量為39.86%。八甲基環四硅氧烷在球花石斛、黃石斛中均被檢測到,但相對含量較少,分別為1.72%、2.26%;石竹烯在球花石斛和喇叭唇石斛中均有被檢測到,相對含量分別為6.59%、2.61%;α-蓽澄茄油烯在紫瓣石斛和黃石斛中均被檢測到,相對含量較少,分別為3.21%和1.37%;桉樹醇在黃石斛和始興石斛中均被檢測到,相對含量較少,分別為1.10%和2.56%;(1R)-(+)-α-蒎烯在球花石斛和羅河石斛中均有存在,但在球花石斛中相對含量較多,為9.12%,羅河石斛中相對含量較少,為0.93%;羅勒烯在喇叭唇石斛為主要成分,但在黃石斛中相對含量較少,僅為1.46%;α-蒎烯在羅河石斛和始興石斛均有存在,但在羅河石斛中含量較高,在始興石斛中含量較低,僅為6.52%;β-月桂烯和D-檸檬烯在羅河石斛和喇叭唇石斛中均被檢測到,但其在羅河石斛中含量相對較高,分別為9.31%和13.77%,在喇叭唇石斛中僅分別為0.21%、0.10%。

表2 6種石斛花揮發性成分分析

除各石斛揮發性成分的共同組分之外,還存在個別的特殊揮發性成分。1,3,5,7,9-五乙基環戊硅氧烷僅在喇叭唇石斛中被檢測到,其相對含量較少,為0.17%;3,3-二甲基己烷僅在球花石斛中被檢測到相對含量為9.07%;β-水芹烯僅在羅河石斛中被檢測到,且相對含量較高,為22.96%。2-十三酮僅在紫瓣石斛中被檢測到,相對含量為10.78%;1,3,5,7,9-五乙基環五硅氧烷僅在黃石斛中被檢測到,相對含量為11.13%。

3 討論

3.1 6種石斛花朵中主要賦香成分

花香是由花朵自然產生的一種芳香物質,屬于植物釋放的次級代謝產物。不同的花香含有不同的揮發性物質,其中相對含量較高且香氣值(釋放濃度/嗅感閾值)較大的揮發性物質,可推測其為香味的主要賦香成分[11,12]。研究報道,十甲基環戊硅氧烷以及硅氧烷化合物被廣泛用于化妝品、精油等個人洗護產品中的芳香劑、除臭劑等[13-15]。α-蒎烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯、石竹烯、羅勒烯、佛術烯等物質為香味的主要賦香成分,可提供豐富的香氣[16,17]。羅勒烯具有植物香味并伴有橙花油氣息,甜香味強烈,常被作為各種精油產品的香味添加劑[18];D-檸檬烯為單環單萜烯,似甜橙清新香味,有抗炎、抗菌等藥理作用[19,20],香氣閾值為10 g/m3[21];月桂烯具有清淡的香脂氣味,有抗炎、抗氧化等藥理作用[22,23],香氣閾值為13-15 g/m3[21];石竹烯為辛香、木香和溫和的丁香香味,讓人心曠神怡,具有平喘、消痰等藥理作用[24-27]。各種酯類物質也是花香的重要組成部分,例如苯甲酸甲酯具有清新的甜香味[28],水楊酸甲酯具有特殊草藥氣味,且有消炎、止痛等藥理作用[29]。

α-蒎烯、β-水芹烯、D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯在羅河石斛中相對含量較高,分別為26.66%、22.96%、13.77%、9.31%、6.06%,α-蒎烯、β-水芹烯可能是羅河石斛的主要賦香成分,D-檸檬烯、β-月桂烯、α-水芹烯為次要賦香成分。十甲基環戊硅氧烷、(1R)-(+)-α-蒎烯、石竹烯在球花石斛中相對含量較高,分別為22.04%、9.12%、6.59%,其中十甲基環戊硅氧烷可能是球花石斛的主要賦香成分之一,(1R)-(+)-α-蒎烯、石竹烯可能是其次要賦香成分。羅勒烯在喇叭唇石斛中的相對含量高達73.98%,這一成分可能是其獨特的賦香成分。紫瓣石斛、黃石斛和始興石斛均被檢測出獨特的揮發性成分,{雙[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯在紫瓣石斛中相對含量為41.40%,可能是其特征香氣成分;黃石斛中對甲苯甲酸十八烷基酯的相對含量為37.96%,可能是其主要獨特的香氣成分;3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇是始興石斛中的特征性成分,相對含量為39.86%,可能是其主要賦香成分之一。

3.2 6種石斛花朵中揮發性成分差異分析

本研究主要采用SPME法結合GC-MS技術分析了6種石斛花朵的揮發性成分種類及其相對含量,共鑒別出106種揮發性物質,主要成分種類為萜烯類、烷烴類、芳香族化合物、酯類、含氮化合物、酮類、醇類。6種石斛花朵中揮發性成分檢測數量為11-45種,個別石斛存在較大差異。始興石斛鑒別出11種成分,含有獨特的揮發性成分,其主要成分為醇類,而這類物質在其他5種石斛中含量極小或者未被檢測出來。喇叭唇石斛揮發性成分較其他石斛復雜,具體體現在揮發性成分數量較多,共鑒定出45種香氣成分,同時含有6類揮發性成分,其主要成分為萜烯類。黃石斛所含揮發性成分類別最多,有7類揮發性成分,但其香氣成分只有21種,其主要成分為烷烴類和酯類。球花石斛主要的揮發性成分為烷烴類,羅河石斛和喇叭唇石斛較為相近,主要的揮發性成分為萜烯類。紫瓣石斛和黃石斛均以烷烴類和酯類為主。6種石斛的揮發性成分差異較大,僅十甲基環戊硅氧烷為其共有成分,且每種石斛主要香氣成分皆不相同。十甲基環戊硅氧烷在球花石斛、紫瓣石斛、黃石斛、始興石斛中含量均較高,但在羅河石斛和喇叭唇石斛中含量極小。曹樺等[30]對4種香花型石斛盛花期花朵的揮發性成分進行測定和分析,共鑒定出揮發性成分80種,其中共有揮發性成分僅有2種,4種香花型石斛的揮發性成分及相對含量具有明顯差異,均含有其特征香氣成分。王元成等[31]采用SPME法結合GC-MS技術研究5種石斛花朵的揮發性成分,共鑒定出110個成分,花香成分以萜烯類化合物為主,其中羅勒烯、D-檸檬烯、芳樟醇相對含量較高;檢測的棒節石斛(D.findlayanum)的獨有成分有14個,5種石斛花朵之間的揮發性成分存在明顯差異。顏沛沛等[32]研究1 d內6個不同時間點報春石斛(D.polyanthum)花朵中揮發性成分的相對含量變化,發現乙酸乙酯在下午時間段的相對含量較高,但是王元成等[31]在上午采樣中,并未發現此成分,其余主要成分大致相同。李崇暉等[33]研究鼓槌石斛(D.chrysotoxum)和細葉石斛(D.hancockii)花朵中3-蒈烯的相對含量均最高,均未檢測到順式-β-羅勒烯,(1R)-(+)-α-蒎烯在鼓槌石斛中含量極低,石竹烯在細葉石斛中未被檢測出。夏科等[34]檢測到的鼓槌石斛中順式-β-羅勒烯和(1R)-(+)-α-蒎烯含量較高,但并未檢測到3-蒈烯,細葉石斛中順式-β-羅勒烯和石竹烯相對含量較高。李崇暉等[33]與夏科等[34]對相同種的石斛的香氣成分檢測結果存在差異。

這些研究結果表明,石斛屬不同種之間的花朵揮發性成分數量和含量均存在差異,甚至相同種石斛揮發性成分檢測也可能存在差異,原因可能是石斛種植地域和生長環境因子的不同,也可能是對石斛花朵揮發性成分提取的方法不同,還可能是石斛花朵中揮發性成分以及含量會隨著開花時間的變化而變化,不同的采樣時間也會導致揮發性成分存在差異。

4 結論

本研究采用SPME法結合GC-MS技術,分析了6種石斛花朵的揮發性成分種類及其相對含量。共鑒別出106種揮發性物質,主要成分種類為萜烯類、烷烴類、芳香族化合物、酯類、含氮化合物、酮類、醇類。6種石斛花朵的揮發性成分均含有萜烯類和烷烴類,并且這兩類成分均為6種石斛花朵的主要揮發性成分。6種石斛均含有十甲基環戊硅氧烷,但相對含量存在差異。球花石斛主要賦香成分為十甲基環戊硅氧烷;羅河石斛主要特征香氣成分為α-蒎烯、β-水芹烯;喇叭唇石斛的獨特香氣成分為羅勒烯;紫瓣石斛的主要賦香成分為{雙[(三甲基硅基)氧基]膦基}乙酸三甲基硅酯和十甲基環戊硅氧烷;黃石斛的主要特征香氣成分為對甲苯甲酸十八烷基酯和十甲基環戊硅氧烷;始興石斛的獨特香氣成分為3,6-二甲氧基-9-(2-苯基乙炔基)芴-9-醇和十甲基環戊硅氧烷。不同種類的石斛花朵揮發性成分不同,主要成分的組成和相對含量存在較大差異,研究結果對香型石斛種類的選育及其衍生產品的開發具有重要參考價值。