基于SSR的廣西同色兜蘭和帶葉兜蘭遺傳多樣性分析*

朱顯亮,朱舒靖,2,鄒 蓉,唐健民,羅亞進,韋 霄**

(1.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所,廣西植物功能物質研究與資源持續利用重點實驗室,廣西桂林 541006;2.廣西師范大學生命科學學院,廣西桂林 541006;3.廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區管理中心,廣西百色 533209)

兜蘭是蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(Paphiopedilum)植物的統稱,以其花唇瓣呈兜狀聞名,又因酷似舊時歐洲女子拖鞋,亦被稱為“拖鞋蘭”和“仙履蘭”。兜蘭屬共包括109個物種,其中有27個分布在中國[1]。該屬花形奇特,并且在生長習性(地生型、石上附生型和樹上附生型)、開花時間(春季開花型、夏季開花型、秋冬季開花型和四季開花型等)和開花類型(單花、雙花或多花)等方面呈現豐富的多樣性[2]。因此,兜蘭是具有高觀賞價值和經濟價值的花卉植物。然而,由于過度采集和非法貿易,大多數野生兜蘭的棲息地人為破壞嚴重,因此其種群和個體數量都在不斷減少,瀕臨滅絕。

同色兜蘭(P.concolor)是兜蘭屬中罕見的四季開花型物種,曾自然分布于廣西、云南和貴州的部分地區[3],但近期的全國專項調查顯示僅在廣西西南地區一帶見其自然分布[4]。帶葉兜蘭(P.hirsutissimum)是春季開花型兜蘭,花期在4-5月,主要分布在廣西西部至北部、貴州西南部和云南東南部一帶[5]。在2021年版《國家重點保護野生植物名錄》中,同色兜蘭和帶葉兜蘭分別被列為國家一級和二級重點保護野生植物。對于瀕危植物而言,了解它們的遺傳多樣性、種群結構、種群遺傳分化等信息對物種保育具有重要意義[6-8]。為了有效保護和利用帶葉兜蘭,先前已經開展了一些保護遺傳學方面的研究:高麗霞等[9]基于SRAP標記評估了廣西木論國家級自然保護區40份野生帶葉兜蘭資源的遺傳多樣性;徐言等[10]基于SSR標記對中國西南地區190份帶葉兜蘭資源(其中13份來自廣西木論國家級自然保護區,39份來自廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區)進行了遺傳多樣性、種群結構和表型多樣性分析。廣西是蘭科植物的天然分布中心之一,擁有相對豐富的蘭科植物資源,然而先前對廣西帶葉兜蘭資源的遺傳多樣性評估都集中在自然保護區中的就地保護種群,可能難以反映存活在自然保護區之外的帶葉兜蘭野生種群的遺傳多樣性。迄今為止,還未有關于同色兜蘭遺傳多樣性和群體結構方面的報道。此外,對于這兩種不同開花習性的兜蘭屬物種的遺傳分化程度也缺少研究。

因此,本研究通過實地調查,廣泛收集了分布于廣西的231份同色兜蘭和帶葉兜蘭樣品,并利用SSR標記開展保護遺傳學研究,重點探究不同開花習性的同色兜蘭和帶葉兜蘭的遺傳多樣性水平、種群結構及其遺傳分化。

1 材料與方法

1.1 材料

在廣西采集了同色兜蘭5個自然種群的80個樣品以及帶葉兜蘭7個自然種群的151個樣品(表1)。為了探究同色兜蘭和帶葉兜蘭的系統發育關系,還采集了同屬的其他3個近緣種,分別為長瓣兜蘭(P.dianthum)、麻栗坡兜蘭(P.malipoense)和硬葉兜蘭(P.micranthum),每個近緣種各采集3個樣品。由于部分兜蘭屬物種具有叢生特點,為了避免采集到同一株植株,所有采集植株之間至少間隔10 m。使用變色硅膠分別采集各植株的新鮮葉片樣品。

表1 樣品采集信息

1.2 DNA提取和SSR分型

使用改良CTAB(Cetyltrimethylammonium Bromide)法[11]提取了240個樣品的DNA,并利用1.2%瓊脂糖電泳(120 V,20 min)進行質檢。使用NanoDROP 8000超微量分光光度計(賽默飛世爾科技公司)檢測DNA的濃度和純度(A260/A280=1.8-2.0,濃度≥30 ng/μL)。利用10對高多態性SSR引物(表2)對240個樣品進行分型。10對高多態性SSR引物篩選自Xu等[12]在亨利兜蘭(P.henryanum)中開發的34對EST-SSR引物,該研究已證明34對引物在7種兜蘭屬(包括同色兜蘭和帶葉兜蘭)植物中均有較好的擴增效果。PCR擴增體系:2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL,DNA 1.0 μL(～20 ng),上、下游引物各0.5 μL(濃度均為10 pmol/μL),ddH2O 3.0 μL。PCR擴增程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,62-52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,反應循環10次;95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,反應循環25次;72 ℃末端延伸20 min;4 ℃保溫。使用GeneMapper v4.1軟件在ABI 3730xl DNA分析儀上讀取SSR基因型。

表2 SSR引物信息以及多態性分析

1.3 方法

1.3.1 遺傳多樣性和瓶頸效應分析

使用GenAlEx v6.5.1[13]計算位點和群體的遺傳多樣性指標,包括觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、香農信息指數(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和固定系數(F)等。利用R語言對同色兜蘭和帶葉兜蘭間各群體的遺傳多樣性指標差異進行t檢驗。利用分子方差分析(AMOVA)評估種群間、個體間和個體內的總遺傳變異。采用BOTTLENECK v1.2.02[14]軟件對各種群進行瓶頸效應分析。根據Piry等[14]的建議使用更適合SSR標記的兩相混合模型(TPM)進行檢驗,并設置方差(Variance)為12,步移式突變(SMM)占模型檢測的比例為95%,以及迭代次數為1 000。由于同色兜蘭TS-PR種群的采樣數量低于Bottleneck軟件的最低使用標準,因此在瓶頸效應檢驗中排除該種群。

1.3.2 系統發育關系和遺傳結構分析

為了更準確評估同色兜蘭和帶葉兜蘭間的系統發育關系,在分析中加入了長瓣兜蘭、麻栗坡兜蘭和硬葉兜蘭共9個樣品的數據,然后利用MEGA v6.0[15]的非加權平均(UPGMA)法和鄰接(NJ)法分別構建群體水平和個體水平的系統發育樹。

采用不同分析方法檢測群體間的遺傳結構。首先,通過GeneAlEx v6.5.1計算個體間Nei氏遺傳距離矩陣,隨后使用主坐標分析(PCoA)來計算樣品主坐標成分,并通過主坐標成分來說明個體間遺傳聚類。使用STRUCTURE[16]對全部個體進行貝葉斯聚類分析,設置假定分群數(K)為1-10,Burn-in周期為10 000,MCMC(Markov Chain Monte Carlo)設為100 000,每個K值重復運行10次,再利用在線工具Structure Harvester,根據DeltaK的最大值確定最佳分群數[17]。

1.3.3 遺傳分化、距離隔離(IBD)和環境隔離(IBE)分析

利用Arlequin v3.5.2.2[18]計算同色兜蘭和帶葉兜蘭群體間的遺傳分化系數(FST)。根據12個種群的地理坐標信息,利用R語言計算種群間的地理距離,并在WorldClim數據庫(http://worldclim.org/)中下載了19個氣候變量信息,在國家青藏高原數據中心(https://data.tpdc.ac.cn/)的Harmonized World Soil Database v1.1中下載了16個表土理化特性信息作為土壤變量。通過計算35個變量間的Spearman相關性系數(R)來去除冗余變量,當兩兩變量間的相關性絕對值大于0.8時,僅保留其中1個變量,最終確定了12個代表性環境變量:年平均氣溫(BIO1)、晝夜溫差月均值(BIO2)、等溫性(BIO3)、溫度季節性變化標準差(BIO4)、最干月降水量(BIO14)、降水量變異系數(BIO15)、表土含礫量(T_GRAVEL)、表土黏土分數(T_CLAY)、表土USDA質地分類(T_USDA_TEX)、表土水pH值(T_PH_H2O)、表土陽離子交換量(T_CEC_CLAY)、表土鹽度(T_ECE)。最后,分別對遺傳分化系數、地理距離以及12個代表性環境變量進行Mantel檢驗,計算Spearman相關性系數,并進行9 999次置換檢驗顯著性。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性和種群瓶頸

在231個同色兜蘭和帶葉兜蘭樣品中,10個SSR位點檢測的平均Na為2.4,平均Ne為1.6。其中,I最高的是位點DL21(1.093),最低的是DL23(0.147)。Ho和He分別為0.029-0.629和0.081-0.571。各位點的平均F值為0.081 (表2)。

通過比較物種間的平均遺傳多樣性水平發現,帶葉兜蘭的I(0.619)約為同色兜蘭(0.290)的2倍,并且其Ho(0.335)和He(0.354)均極顯著(P<0.001)高于同色兜蘭(Ho=0.136,He=0.159)。在所有種群中,檢測到的平均Na和Ne分別為0.9-3.2和0.8-2.0。從固定系數上看,除DY-XKR和TS-JH種群外,其余種群均表現出雜合缺失(F>0)。此外,瓶頸效應結果顯示,同色兜蘭的TS-HG和TS-MQ種群存在顯著瓶頸效應(P<0.05),而帶葉兜蘭所有種群均不存在顯著瓶頸效應(P>0.05,表3)。

表3 同色兜蘭和帶葉兜蘭種群的遺傳多樣性和瓶頸效應

AMOVA分析(表4)顯示,帶葉兜蘭的遺傳變異主要來自個體內(77.5%),同色兜蘭個體間(45.9%)和個體內(40.5%)的遺傳變異相當,兩個物種來自種群間的變異都較少,帶葉兜蘭僅7.4%,同色兜蘭僅13.6%。

表4 同色兜蘭和帶葉兜蘭的AMOVA分析

2.2 系統發育關系及遺傳結構

群體水平的UPGMA樹和個體水平的NJ樹均顯示同色兜蘭和帶葉兜蘭各自聚為1支[圖1(a)、(b)],但相比于長瓣兜蘭、麻栗坡兜蘭和硬葉兜蘭,帶葉兜蘭與同色兜蘭的系統發育關系更為接近。在UPGMA樹中發現,同色兜蘭的TS-JH和TS-WP遺傳距離最近,而帶葉兜蘭中DY-JX和DY-PJ,以及DY-XKR和DY-TL的遺傳距離都較近[圖1(a)]。PCoA的結果與NJ樹分析的結果基本一致,可以較好地區分帶葉兜蘭與同色兜蘭個體,其中,第1和第2主坐標成分對總變量的解釋率分別為54.8%和12.2% [圖1(c)]。

圖1 系統發育分析和主坐標分析

對兩個物種的Structure分析顯示K=2的分群結果最佳,此時兩個物種的個體被明顯分開[圖2(a)、(b)]。同色兜蘭和帶葉兜蘭的獨立Structure分析顯示,兩個物種都進一步檢測到兩種不同的遺傳成分[圖2(c)、(d)]。

2.3 遺傳分化、IBD和IBE的檢驗

遺傳分化分析結果[圖3(a)]顯示,帶葉兜蘭兩兩種群間的平均FST為0.077,同色兜蘭兩兩種群間的平均FST為0.237,而兩個物種的種群間的平均FST為0.572,達到了較高的分化水平。為探究遺傳分化的驅動因子,分別進行IBD檢驗[圖3(b)]和IBE檢驗[圖3(c)]。其中,IBD檢驗顯示12個種群間的地理距離與遺傳距離呈現顯著正相關(R=0.300,P<0.05),表明地理隔離可能促進兩個物種間的遺傳分化。然而,FST與12個代表性環境因子間的Mantle檢驗均不顯著,表明IBE模式在驅動帶葉兜蘭和同色兜蘭的種群分化過程中的作用可能不太明顯。

NS,*,**,and *** represent the significance of P>0.05,P<0.05,P<0.01,respectively.

3 討論

本研究利用10個多態性EST-SSR位點比較了四季開花型同色兜蘭和春季開花型帶葉兜蘭的遺傳多樣性水平,并發現前者的遺傳多樣性水平顯著低于后者。物種的遺傳多樣性可能受到分布范圍的影響,許多狹窄分布的瀕危物種的遺傳多樣性水平都較低[19,20]。張央等[4]對全國蘭科兜蘭屬寬瓣亞屬(PaphiopediumSubgen.Brachypelalum)植物的一項專項調查研究結果顯示,目前野生同色兜蘭的自然分布區域已經縮小到廣西西南地區,因此更狹窄的自然分布范圍和更小的有效種群數量可能解釋了同色兜蘭更低的遺傳多樣性。帶葉兜蘭的高遺傳多樣性可能與其個體間豐富的遺傳變異有關,AMOVA結果顯示,帶葉兜蘭中來自個體內的遺傳變異達77.5%,這與徐言等[10]的研究結果類似;而同色兜蘭中來自個體內的遺傳變異僅為40.5%。此外,物種的遺傳多樣性水平還可能受到多樣化的種群進化歷史的影響[21-23]。例如,孫藝琦等[21]發現單葉蔓荊(Vitexrotundifolia)與蔓荊(V.trifolia)的種群曾經歷過瓶頸效應,并導致了兩者較低的遺傳多樣性。種群瓶頸的原因主要包括兩方面:一是人工選擇壓力,二是奠基者效應[24]。通常,野生植物種群的瓶頸效應主要是由奠基者效應引起的。本研究在同色兜蘭的部分種群中檢測到了顯著的瓶頸效應,但在帶葉兜蘭中未檢測到,表明在種群形成歷史中曾遭遇的瓶頸效應可能導致同色兜蘭喪失部分的遺傳多樣性。

本研究中帶葉兜蘭的DY-YC種群和DY-XKR種群分別與徐言等[10]研究中的GYC和GML種群來源一致,但本研究評估的兩個就地保護種群的遺傳多樣性略低于徐言等[10]的評估結果。本研究使用了兼顧兩個物種(帶葉兜蘭和同色兜蘭)多態性的SSR位點,因此這些位點在單一物種中的變異可能相對保守,從而低估了種群雜合度。此外,不同的采樣個體和采樣數量也可能影響對種群雜合度的評估。對自然保護區內外的帶葉兜蘭種群的遺傳多樣性的比較結果表明,3個自然保護區內的就地保護種群的多態性指數(DY-XKR,I=0.597;DY-YC,I=0.578;DY-LX,I=0.634)符合野生種群的標準(I=0.555-0.722),就地保護可以較好地保護野生帶葉兜蘭的遺傳多樣性。然而,位于廣西崇左白頭葉猴國家級自然保護區的同色兜蘭種群(TS-PR,I=0.109)遺傳多樣性則低于其他4個野生同色兜蘭種群。因此,為了更好地保護同色兜蘭的野生資源,建議進一步擴大自然保護區的范圍或者結合遷地保護措施。

AMOVA和遺傳分化分析的結果均顯示,同色兜蘭種群的分化程度要高于帶葉兜蘭種群。較高的遺傳分化通常意味著基因流受限[25,26]。兜蘭屬物種大多采用欺詐性授粉的策略[27],這種傳粉策略風險很高,通常嚴重依賴專一的傳粉者;并且自然環境中的兜蘭屬物種還普遍存在種子萌發困難[28]的現象,這些都可能導致由花粉或者種子介導的基因流受限。與同色兜蘭不同,帶葉兜蘭具有非常強的營養繁殖能力,還可以通過走莖進行營養繁殖[5],這種繁殖方式可以有效促進種群規模的擴大,并有可能增加種群間基因流的機會。

基因流受限可能是由地理隔離或者環境隔離導致的,這與許多瀕?；蛱赜兄参锏奶幘愁愃?如地中海高山植物Sileneciliate[29]、中國北方瀕危的野薔薇(Rosarugosa)[30]、中國南方特有的篦子三尖杉(Cephalotaxusoliveri)[31]等。IBD和IBE的結果表明,地理隔離是影響同色兜蘭和帶葉兜蘭種群遺傳分化的主要因素,而環境隔離的影響較小。盡管此前一些研究模擬和分析了中國境內兜蘭屬植物的地理分布格局,發現一些環境變量如晝夜溫差、年平均氣溫變化范圍、最暖季度平均氣溫、太陽輻射、水蒸氣壓等對兜蘭屬植物的自然地理分布格局具有重要影響[4,32],但是本研究并未發現環境變量對同色兜蘭和帶葉兜蘭種群分化具有顯著影響。一方面,人為因素的存在可能會削弱IBE的影響,特別是考慮到帶葉兜蘭和同色兜蘭野生植株經常遭受非法采摘;另一方面,由于本研究的采樣范圍局限于廣西,在相對小的尺度下IBE的作用可能并不明顯。因此,對IBE模式在兜蘭屬物種種群分化過程中的作用的進一步探究需要結合更大范圍的采樣。

同色兜蘭是兜蘭屬中罕見的四季開花型物種,但分布較狹窄。與同色兜蘭相比,盡管帶葉兜蘭花期短,但是其自然分布面積較廣,適生區范圍較大。因此,通過開展兩個物種之間的雜交有望從中選育出一些花期長且適應性強的優良品種,以滿足日益增長的市場需求,并且能更好地保護野生兜蘭資源。此前對兜蘭屬物種的雜交研究發現,在帶葉兜蘭、杏黃兜蘭(P.armeniacum)、硬葉兜蘭和同色兜蘭的16種雜交及自交組合類型中,同色兜蘭×帶葉兜蘭的雜交結實率最高,達93.1%[33]。一般而言,蘭科物種間的親緣關系越近則雜交親和性越高[34]。而本研究的NJ樹和UPGMA樹的結果顯示,在5個兜蘭屬物種中,同色兜蘭與帶葉兜蘭間的系統發育關系最近,因此,該結果為同色兜蘭和帶葉兜蘭間的高雜交率提供了有力的系統發育學證據支持。此外,這些系統發育關系信息還可以用于指導今后兜蘭屬的優良品種選育,例如,在UPGMA樹中發現同色兜蘭的TS-JH和TS-WP種群與帶葉兜蘭的DY-HJ種群的遺傳距離均較為接近,因此,這些種群可以優先作為開展雜交試驗的材料。然而鑒于SSR位點提供的遺傳信息有限,對于兜蘭屬物種間系統發育關系的進一步闡明還需要借助更全面的基因組信息,如簡化基因組或全基因組數據。