TBOEP和nano-TiO2聯合暴露誘導對土著鯽魚的復合繁殖毒性效應

趙雪松,黃嘉誠,王琬玥,武 韜,任 新

(吉林師范大學 工程學院, 吉林 四平 136000)

磷酸三-(2-丁氧基)乙酯(TBOEP)一種典型有機磷阻燃劑(OPFRs),在使用過程中TBOEP是以簡單的物理方式進行添加,使其極易釋放到周圍環境中[1,2]。北京地表水TBOEP的濃度為116 ng/L(

吉林省是中國重要的工業基地,加工制造業比較發達,工業門類特色鮮明。在汽車制造、客車制造、電子產業以及石化企業四大支柱產業生產加工中,阻燃劑與納米材料均占據舉足輕重的地位,TBOEP與nano-TiO2在吉林省大量應用勢必會造成環境殘留,二者在水環境中具有共存的可能性極高。本實驗以土著鯽魚為受試生物來研究通過分析TBOEP單獨暴露以及與nano-TiO2聯合暴露后幼魚性激素含量以及下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)基因表達的變化,建立鯽魚暴露評價污染物繁殖毒性干擾效應模型,揭示nano-TiO2對TBOEP繁殖毒性影響的機制。本研究具有較高的現實意義,其研究結果將為我省四大支柱產業的生態安全評估與產業的合理布局提供必要的理論依據,同時為完善持久性有毒物質的生物毒理數據庫貢獻一份力量。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

99 %的TBOEP購自Sigma-Aldrich公司,99 %二甲基亞楓(DMSO)購自安耐吉公司,鯽魚幼苗養殖的培養液用NaHCO3, KCl, MgSO4·7H2O,以及CaCl2·2H2O進行配置,并將10 mg/mL的TBOEP儲備液用培養液稀釋至0.05 μg/L與0.5 μg/L。90 %的nano-TiO2購自深圳納米巷有限公司,并用培養液稀釋至5 μg/L。

1.2 暴露實驗

試驗用的鯽魚幼苗購自長春市水產養殖基地,幼苗的體長平均為(12.14±0.87) cm,體質量約為(21.35±3.05) g。實驗開始前,將魚苗馴養一周以上,每天三次投放餌料,養殖液的溶解氧為(5.0±0.98) mg/L,水溫控制在(25±5) ℃。暴露實驗進行如下:在空白對照組、0.05 μg/L與0.5 μg/L TBOEP暴露組、0.5 mg/L nano-TiO2暴露組以及TBOEP 0.05 μg/L+nano-TiO20.5 mg/L、TBOEP 0.5 μg/L+nano-TiO20.5 mg/L復合暴露組中,每個暴露濃度放置10尾健康活潑的魚苗,實驗設置3組平行實驗。暴露實驗持續7 d,每天正常投喂三次,更換50 %暴露溶液,并詳細記錄魚苗的體態、形態學異常。

1.3 魚體組織中TBOEP含量的測定

鯽魚和腦、肝臟以及性腺等組織稱重后摻入100 ng的d27-TBP作為TBOEP的內標,萃取劑為乙腈。暴露結束后,迅速提取組織樣品,勻漿后離心收集上清。反復提取2次后,收集上清液,經氮氣吹脫濃縮到1 mL。后經固相萃取,乙腈與甲醇洗脫后,利用液相色譜與質譜連用儀進行定量分析,運行參數詳見文獻[11]。

1.4 血清中性激素含量的測定

鯽魚血清中性激素睪酮與雌二醇含量采用放射性免疫測定(RIA)方法以γ測定儀進行測定。暴露實驗結束后,按照Andrew F. R方法,收集尾靜脈的血液樣本用于性激素的測定。血清在測定前,需要用二氯甲烷進行萃取(血清與二氯甲烷的體積比為1∶5),結束后將二氯甲烷相取出,揮發去除二氯甲烷后用無水乙醇定容至200 μL。

1.5 基因表達

樣品RNA的提取,cDNA合成,熒光定量PCR的方法參見參考文獻[12],本實驗選定下丘腦、垂體激素相關基因Gnrh2, Gnrh3, Fshβ與Lhβ進行測定,引物序列見表1。

表1 測定基因的引物序列

2 結果與討論

2.1 Nano-TiO2對TBOEP生物累積的影響

如圖1(a)和(b)可見,TBOEP在鯽魚體內的累積具有組織差異性,肝臟、腦和性腺器官的蓄積含量逐漸降低。同時,TBOEP的單一暴露組與復合暴露組中,TBOEP在魚體中累積均存在濃度依賴關系,并且在復合暴露組中TBOEP的累積濃度顯著高于單一暴露組,同時雌魚體內的TBOEP的累積濃度高于雄魚,其中的原因有可能是由于攝取、代謝、分布 以及清除的能力不同,也可能是由于不同性別對營養需求,攝食行為以及各種生理活動的差異,從而影響了污染物的積累。同時,考慮的TBOEP的相對疏水性,雌性和雄性攝取的差異也可能是由于不同脂質含量引起的。

圖1 TBOEP在鯽魚內累積的組織差異性 (a) 雌魚;(b) 雄魚

2.2 Nano-TiO2與TBOEP 對鯽魚性激素水平的影響

如表2所示,與空白對照組相比,所有暴露組暴露7 d后的睪酮與雌二醇均高于相同暴露濃度的對照組。 Nano-TiO2暴露組血清中睪酮與雌二醇的含量與對照組沒有顯著的差別。在TBOEP單獨暴露組中,隨著TBOEP的暴露濃度從0.05 μg/L增加到0.5 μg/L,睪酮與雌二醇的含量雖然有所增加,但是與對照組相比沒有顯著的差異。7 d后,在復合暴露組中,0.5 μg/L T+N暴露組睪酮的水平從單一暴露組的0.54±0.03 μg/mL 顯著增加至0.61±0.03 μg/mL;0.05 μg/L T+N暴露組雌二醇的水平從單一暴露組的對照組的0.23±0.005 μg/mL顯著增加至0.24±0.01 μg/mL,0.5 μg/L T+N暴露組雌二醇的水平從單一暴露組的對照組的0.22±0.03 μg/mL顯著增加至0.29±0.01 μg/mL,說明nano-TiO2能夠顯著增強TBOEP對于鯽魚性激素的干擾作用,進而加劇TBOEP的生殖毒性。

表2 不同暴露組對鯽魚性激素水平的影響

2.3 Nano-TiO2與TBOEP對鯽魚HPG軸基因表達的影響

本實驗測定了HPG關鍵基因促性腺激素釋放激素(Gnrh2和Gnrh3)、卵泡刺激素(Fshβ)以及促黃體激素(Lhβ)相對定量表達。結果如圖2所示,0.05 μg/L TBOEP單獨暴露組以及0.5 μg/L T+N復合暴露組Gnrh2與Fshβ基因的表達較對照組顯著增加;所有暴露組Gnrh3表達雖然較對照組有所增加,但是沒有顯著差異;Lhβ基因只有在0.05 μg/L T+N以及0.5 μg/L T+N復合暴露組與對照組存在顯著差異。復合暴露組Gnrh2、Fshβ與Lhβ基因表達高于單一暴露組。性激素是決定魚體生殖抑制的重要生物標志物,因為性別激素濃度的變化可能在隨后的受精階段導致生殖功能障礙。促性腺激素釋放激素Gnrh2的異常表達必定感染性激素的釋放[13]。

同時,在魚類中,FSH和LH從腦垂體分泌并與其受體結合以刺激類固醇的產生和配子發生。FSH主要控制生長階段(卵黃發生/精子發生),LH主要控制卵母細胞成熟/精子期[13]。因此,復合暴露組Fshβ與Lhβ異常表達表明,與單一暴露相比,nano-TiO2暴露可能影響卵黃發生和配子發生的進展,導致成年鯽魚的配子發生和配子成熟功能障礙的惡化。

*p<0.05與**p<0.01表示暴露組與對照組相比差異顯著圖2 鯽魚HPG軸基因表達

3 結 論

本研究以土著鯽魚為受試生物,系統地研究nano-TiO2與TBOEPP復合暴露對鯽魚生殖系統的影響,研究結果發現TBOEP在鯽魚體內的累積具有組織差異性,肝臟、腦和性腺器官的蓄積含量逐漸降低,且雌魚體內的TBOEP的累積濃度高于雄魚。同時,Nano-TiO2能夠顯著增強TBOEP對于鯽魚性激素的擾亂作用,干擾卵黃發生和配子發生,加劇TBOEP的繁殖毒性。