瑪咖脂溶性成分的GC-MS指紋圖譜的構建及溯源*

李明， 王濤， 陳芮

(云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500)

瑪咖(LepidiummeyeniiWalp.)為十字花科(Brassicaceae)獨行菜屬植物瑪咖的干燥根莖[1]，始產于秘魯，有“秘魯人參”之佳譽.最早瑪咖用于解決人和牲畜的不孕不育問題，同時能增強人的免疫力，消除疲勞[2].

瑪咖的活性成分主要為瑪咖烯、瑪咖酰胺、生物堿、芥子油苷、異硫氰酸芐酯、甾醇及多酚等[3-4].這些活性成分使瑪咖具有調節內分泌[5]、預防前列腺肥大[6]及抗腫瘤[7]等作用.研究表明：瑪咖中特有的瑪咖烯和瑪咖酰胺具有改善性功能的作用[8].Uchiyam等[9]首次證實了瑪咖酰胺能夠提高性激素,為瑪咖能夠改善性欲的傳統說法提供了理論支持.劉淼等[10]發現黑瑪咖中的N-芐基十六酰胺和N-十八烷酰胺為瑪咖抗疲勞的有效成分.周嚴嚴等[11]采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導斑馬魚受損的神經模型，研究了瑪咖總提取物對神經的作用，并采用乙酰膽堿酶和丁酰膽堿酶進行體外實驗，結果表明：瑪咖中對體內和體外神經皆具有保護作用的有效成分為N-芐基十六烷酰胺.Liu等[12]發現N-芐基十六烷酰胺是瑪咖抗骨質疏松的有效成分.孟倩倩和楊敏等[13-14]研究表明瑪咖中脂溶性成分以苯乙腈和N-芐基十六烷酰胺為主.

由于瑪咖具有多種生物活性，近年來瑪咖的市場需求迅速增加，云南、四川和西藏等地競相引種瑪咖[15]，但是由于環境的不同，引種瑪咖的化學成分與含量差異較大，因此研究產地對瑪咖成分及含量的影響顯得尤為重要.

研究采用超聲輔助提取法對瑪咖中脂溶性成分進行提取，結合氣相色譜-質譜聯用法對這些成分進行鑒定.通過對所獲得的數據進行比對分析，構建了瑪咖的指紋圖譜.在此基礎上，結合相似度評價(夾角余弦法)及化學模式識別(主成分分析，PCA)對瑪咖脂溶性成分進行綜合評價以期為瑪咖快速溯源提供參考.

1 儀器與材料

1.1 儀器

SY-360型超聲波清洗器(廣東固態特超聲股份有限公司)；RE-2000A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；ThermoFisher TSQ 9000型氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)(美國Thermofisher Scientific公司).

1.2 材料

實驗所用中國云南香格里拉、中國云南麗江、中國云南曲靖、中國云南昆明、中國四川樂山、中國西藏林芝及秘魯胡寧等7個產地的瑪咖均購于云南省昆明市豐熙茶行；所用石油醚為分析純，購于云南省景銳科技有限公司；所用正己烷為分析純，購于天津市風船化學試劑科技有限公司.

2 實驗方法

2.1 脂溶性成分的提取

稱取10.0 g瑪咖粉，加入石油醚(60～90 ℃)100 mL，超聲提取(功率360 W、頻率40 KHz)3次，每次1 h，過濾，減壓濃縮，揮干.用正己烷溶解，過0.22 μm微孔濾膜，供后續GC-MS分析用.

2.2 GC-MS分析條件

色譜條件：進樣口溫度270 ℃；載氣為高純度氦氣，柱前壓9.785 3 psi，載氣流速為1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流，分流比100∶1，分流流量120 mL/min.采用程序升溫的方式分離脂溶性成分.初始溫度50 ℃，以10 ℃/min速率升溫至150 ℃；以1 ℃/min速率升溫至180 ℃，保持3 min；以1 ℃/min速率升溫至200 ℃；再以3 ℃/min速率升溫至270 ℃，保持5 min.

質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；溶劑延遲4 min；m/z范圍40～550 amu.

3 結果與討論

3.1 瑪咖樣品共有峰的確認及指紋圖譜的確定

采用GC-MS得到7個產地的瑪咖樣品的數據，通過分析基峰和m/z，參考NIST MS Search 2.3質譜數據庫檢索結果及分析匹配度，對瑪咖中的脂溶性成分進行定性分析；對GC-MS數據進行積分，結合峰面積歸一化法計算共有成分的相對含量[16-17].

7個不同產地瑪咖的脂溶性成分的GC-MS圖譜如圖1所示.通過譜庫檢索及圖譜對照發現，在55 min處出現了面積較大的色譜峰，由于峰裂分較嚴重，經檢索匹配度較低，因此并未對此峰進行積分分析.通過GC-MS在瑪咖樣品中共檢測出91種揮發性成分，其中酰胺類和酯類在揮發性成分中含量最高，其次為酸類.結果顯示：西藏林芝瑪咖中脂溶性成分的峰面積較大，與其他6個產地的瑪咖之間存在顯著的差異.

圖1 7個產地瑪咖的脂溶性成分的GC-MS指紋圖譜

選取了保留時間相差很小的15個共有峰作為研究對象，經NIST MS Search 2.3質譜數據庫檢索，都為相同脂溶性成分.7個產地瑪咖的15個脂溶性成分的峰面積之和占總峰面積的百分比介于73.37%～88.86%之間.

由于保留時間為8.237 min的苯乙腈的峰面積較大且積分相對穩定，具有良好的參照效果，因此選擇苯乙腈的色譜峰作為15個共有特征峰的參照峰，將苯乙腈的保留時間和相對峰面積都設定為1，在此基礎上計算其他所有共有特征峰的保留時間和峰面積的相對保留值(見表1).從表1可知，7個產地的瑪咖的15種脂溶性成分在GC-MS上的保留時間具有相對穩定性但峰面積相差較大.

表1 15種脂溶性成分色譜峰的相對保留面積

3.2 瑪咖脂溶性成分的數字化特征指紋圖譜

所構建的瑪咖脂溶性成分的數字化特征指紋圖譜如表2所示.從表2可知，脂溶性成分的指紋圖色譜峰相對保留時間主要集中在0.954～10.531之間.表中結果說明,不同產地瑪咖的同一種成分的保留時間差異較小，出峰穩定，相對含量具有一定差異，可以進行指紋圖譜的構建及瑪咖溯源.

表2 瑪咖脂溶性成分的數字化指紋圖譜

3.3 瑪咖指紋圖譜的相似度分析

采用夾角余弦法對7個產地瑪咖樣品的脂溶性成分的GC-MS 指紋圖譜進行相似度分析.結果表明：15種脂溶性成分的色譜峰夾角余弦的相關系數在 0.900 1～0.989 4 之間，說明不同產地的瑪咖樣品具有較好的相似度，可用于建立新型的瑪咖GC-MS指紋圖譜.

3.4 主成分分析

由于7個產地的瑪咖脂溶性成分共有特征峰具有一定的相似性，但脂溶性成分的相對含量不同，因此可采用PCA法對不同來源瑪咖進行分析.其KMO為0.788，P為0.000，進一步表明這些數據適用于PCA法分析.

利用SPSS軟件從表2的數據中提取3個主成分.表3給出了15個瑪咖脂溶性成分的3個主要組成部分的特征.PC1為3-甲氧基苯乙腈，PC1的特征值和累積百分比分別為6.946和46.309%；PC2為亞油酸甲酯，PC2的特征值和累積百分比分別為4.121和27.474%；PC3為N-芐基十六烷酰胺，PC3的特征值和累積百分比為2.275和15.163%；總累計百分比為88.947%.

用等級來評估不同來源瑪咖的質量，結果如表3所示.麗江瑪咖得分為0.304，在這些樣本中排名最高；而昆明瑪咖得分為-0.095，在這些樣本中得分最低.

表3 不同溯源瑪咖樣品中脂溶性成分的綜合得分和排名

圖2給出了采用PCA方法對這些樣本進行進一步區分的直觀圖.從圖中可以看出PCA法能夠根據瑪咖中3種主要的脂溶性成分的相對含量清晰的區分不同產地的瑪咖.

PC1、PC2和PC3預測產地和主成分的相關性.

4 結語

運用GC-MS 對7個產地瑪咖中的脂溶性成分進行了分析，采用峰面積歸一化法計算了各成分的相對含量.檢測到了15種主要的共有脂溶性成分，其中3-甲氧基苯乙腈、亞油酸甲酯及N-芐基十六烷酰胺等3種脂溶性成分的相對含量較高.

結合夾角余弦法及PCA法以相對含量穩定的 15 種脂溶性成分的特征值為指紋峰，建立了瑪咖脂溶性成分的 GC-MS指紋圖譜.特征峰的相似度均達到了 0.900 1以上，說明標準指紋圖譜可以作為分析與鑒別瑪咖的依據.分析表明，不同產地瑪咖的脂溶性成分相對含量具有顯著的差異；PCA法能夠根據相對含量有效地對不同產地的瑪咖進行鑒別.該方法為瑪咖快速溯源提供了參考，也為瑪咖質量分析與鑒定提供了依據.