中國水仙離體快繁技術研究進展

劉曉紅,馮雅妹

(太原學院 藝術設計系,山西 太原 030032)

中國水仙(Narcissustazettavar.chinensis)是石蒜科水仙屬的一種多年生草本植物。作為歐洲水仙(N.tazetta)的一個變種,中國水仙在唐朝初期由地中海引進到中國,因其耐寒性差,主要分布于東南沿海溫度濕潤地區,北方地區主要用于室內水養觀賞[1]。中國水仙花姿雅致,花色淡雅,芳香,是早春重要的園林花卉,可用于片植、花壇、花境等,還可作切花以及盆栽。

由于是同源三倍體植物,中國水仙很難通過雜交的方式來獲得后代,所以自然條件下多用分球繁殖。但這種繁殖方式不僅繁殖系數低,周期長,而且病毒積累也較為嚴重。離體快繁不僅可以進行脫毒苗的培養,而且短時間內可以得到大量的優良植株,因此離體快繁技術對于中國水仙的繁育有著重要意義。

植物組織培養技術始于19世紀末,20世紀后期迅速發展成熟[2]。20世紀70年代初首例水仙花(Narcissustazettacv. Grand Soleil d’Or)離體植株再生獲得成功[3]。雖然中國水仙在我國已有近千年的栽培歷史[4],但對它離體培養開始得并不早,始于20世紀80年代。福建省由于得天獨厚的水仙資源條件在中國水仙組織培養方面的研究位于全國前列。1980年丁雪英等[5]以漳州水仙鱗片、莖錐、嫩葉等為外植體,由愈傷組織獲得鱗莖和綠株,并繼續分生得到了帶根的水仙鱗莖。陳振光[6]用中國水仙鱗莖外植體通過一年切塊繁殖,可獲得以萬計的小鱗莖,大大提高了水仙的繁殖系數。在之后的40多年間,中國水仙的離體快繁技術取得了一些進展。

1 低溫預處理

低溫預處理可以提高中國水仙組織培養的成活率和誘導率。完全沒有經過低溫預處理的漳州水仙鱗莖組織切塊會發黃發褐,成活率很低。經過4～10 ℃低溫預處理4～9周后,誘導率會大幅提高[7]。低溫預處理可以保持外植體原有的顏色和活力,減少褐化,提高誘導能力[8-9]。冷處理后的鱗莖盤分化時間縮短,分化能力明顯增強[10]。楊柳燕等[11]發現冷處理9周水仙鱗莖誘導率為100%。鄭春明[8]將2～3 a生鱗莖球存放在4 ℃左右的冷藏箱中,發現低溫處理3周可明顯提高外植體的成活率、生長速度和誘導率。

2 消毒劑的研究

2.1 升汞處理

莊曉英[10]對8種不同升汞濃度和熱水處理時間組合研究表明:用0.1%的升汞處理20 min,55～60 ℃的無菌熱水處理2 min,0.1%的升汞處理5 min,中國水仙外植體污染率最低、增殖系數最高。蔡月琴等[12]發現0.1%升汞處理組滅菌效果比2%次氯酸鈉處理組好。水仙鱗莖用0.1%的升汞處理12 min內層鱗片的污染率最低,存活率最高,達到73.3%。劉炤[13]對不同的消毒滅菌方式進行比較發現采用多步混合消毒方式可以有效降低中國水仙鱗莖污染率。

2.2 次氯酸鈉處理

對中國水仙花苞來說,相對于0.1%的升汞,滅菌溫和的2%的次氯酸鈉浸泡處理20 min效果最好[12]。對水仙花苞和主球進行消毒處理,25%次氯酸鈉處理20 min污染率達100%,用30%次氯酸鈉消毒側球30 min污染率則降到39.1%[14]。25%次氯酸鈉浸泡“云香水仙”鱗莖30 min的消毒效果最佳,在次氯酸鈉濃度相同的情況下,消毒時間越長,污染率越低[15]。

綜上可知,消毒劑的使用除自身濃度和處理時間外,必要時還需要與其他方式,如熱水處理等相配合,才能達到最佳的消毒效果。

3 外植體部位及大小

3.1 外植體部位的選擇

3.1.1鱗莖和鱗片

中國水仙離體培養最常用的外植體是帶鱗莖盤的雙鱗片、雙鱗片或鱗片[16]。不帶鱗莖盤的鱗片培養誘導率較低,鱗莖最內層鱗片培養效果較好[7-8]。章萍萍等[17]則認為漳州水仙鱗莖誘導中層最好,外層則容易產生褐化。雙鱗繁殖被認為是水仙組織快繁的有效方法[18]。

莊曉英[10]發現鱗莖盤、鱗莖、試管小鱗莖葉都可以分化出愈傷組織,其中鱗莖盤是最佳的外植體,分化率可達100%。熊莉君等[19]也發現帶鱗莖盤的中國水仙鱗莖外植體的脫分化和再分化能力都很強。因此認為,在選擇外植體的過程中,選擇形態學下端的外植體較好。

3.1.2花葶

欒愛業[20]選擇3種不同生長階段的花葶,發現生長一段時間后,花苞還沒有抽出鱗莖時的花葶誘導率最高,幼嫩的花葶外植體容易褐變,但當材料逐漸成熟時褐變會消失。王文婷[14]用花葶直接誘導不定芽,發現花葶雖然可以成功地誘導出不定芽,但是誘導出來的芽普遍較小,綠葉的抽出也相對困難,并且誘導苗后期培養中非常容易死亡。

3.1.3子房

將中國水仙子房外植體做成切片培養,可以產生大量的不定芽[6]。子房的愈傷組織的誘導率較高,質量也好。由子房誘導出來的愈傷組織分化培養,也表現良好[14]。崔瑞峰等[21]卻發現子房外植體對誘導愈傷組織能力比鱗莖、花梗和葉片差。蔡月琴等[12]發現消毒后子房接種后可迅速脫分化,但進行繼代培養時就變得很困難,最終會褐化并死亡。漳州水仙子房在不同時間取材,愈傷組織的誘導結果也不同。幼嫩子房的誘導率并不高,誘導程度會隨著子房成熟度提高[20]。

3.2 外植體的大小

外植體切法與大小影響小鱗莖的質量和增殖率。何瑋毅等[22]發現8 mm×5 mm左右的中國水仙帶鱗片的鱗莖盤在增殖率和小鱗莖的質量等方面優于4 mm×3 mm的外植體。但是外植體的體積越小,經過流水處理后的外植體的污染率越低[8]。

3.3 外植體的年齡及月份

陳振光等[23]對中國水仙外植體的年齡及月份的研究發現1 a生的中國水仙鱗莖分化和誘導小鱗莖能力都很強。對于不同月份來說,九月份外植體誘導率最高。莊曉英[10]對1～3 a生的經過冷處理鱗莖的鱗莖盤和鱗莖葉做了對比研究卻認為從分化率和增殖率來看,2 a生的鱗莖盤最佳。

綜上所述,中國水仙適合的外植體部位有鱗莖盤、雙鱗片、花葶、子房、花藥[24-25],花序軸[26]等,但帶鱗片的鱗莖盤是最常用和分化效果最好的外植體。對于鱗莖的年齡來說,選擇1 a生中國水仙最好,冷處理的鱗莖盤則選擇2 a生的最好;接種時間選擇九月份最佳。流水沖洗的時間相同,外植體的越小,污染率越低。

4 培養基

4.1 基本培養基

早期進行中國水仙外植體培養時,學者們大多數都選擇MS培養基作為基本培養基,因為這個培養基養分數量和比例合適且適用范圍廣。如李招文等[7]對中國水仙在MS和N6兩種培養基培養的對比試驗表明MS培養基培養的水仙鱗莖成球率和誘導率都比在N6培養基里的高。欒愛業[20]選用MS,N6和MS(1/2NH4NO3)3種培養基誘導中國水仙的子房和花葶的愈傷組織,其中MS培養基誘導率最高。陸春芳等[9]對相同激素的MS培養基和N6培養基進行對比,認為MS培養基是崇明水仙組培的最佳培養基。陳振光等[23]發現中華培養基是誘導小鱗莖最佳的培養基,誘導率在初代培養中高達54.5%,在增殖繼代培養中高達108.3%;其次是N6培養基;Morel培養基效果最差。

4.2 激素配比的研究

在組培過程中激素對于外植體的生長有重要作用,激素可以提高外植體的初代培養、增殖培養、生根培養的速度,縮短外植體培養的時間,提高效率,因此激素的選擇對中國水仙工廠化發展具有重要意義。

中國水仙愈傷組織的誘導大多使用的激素是萘乙酸(NAA),2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-芐氨基嘌呤(6-BA)。崔瑞峰等[21]認為只采用2,4-D進行培養效果就很好。而丁雪英等[5]認為培養基中加入NAA 3 mg/L,2,4-D 1 mg/L誘導愈傷組織的效果好。楊柳燕[11]、王文婷[14]、熊莉君[19]、楊會苗[27]、顧亨森[28]、方琪等[29]則發現6-BA和2,4-D的組合效果最佳。對于6-BA+NAA的組合,無論什么濃度下的培養基都無法誘導出來愈傷組織,它只對分裂有用,對于分化來說用處不大[29]。還有研究發現3種激素組合使用效果也好[30]。

不同激素濃度組合還會影響誘導小鱗莖的效果。如李招文等[7]在利用水仙鱗莖進行初代培養時,培養基中加入2 mg/L的NAA對小珠球的形成效果較好;附加6-BA,成球率略有下降。劉炤[13]采用鱗莖作為外植體發現激素組合為NAA 1 mg/L+6-BA 5 mg/L時分化小鱗莖效果最好,楊柳燕[31]也發現NAA和6-BA組合的效果最佳。繼代培養中小鱗莖的發生與生長素有著密切關系,有學者認為只用NAA繼代培養效果最好[7]。而有些學者則認為幾種生長素組合的培養效果較好。如丁雪英等[6]發現誘導培養的最佳激素配比為2,4-D∶NAA=1 mg/L∶3 mg/L,并在培養基中添加10%的椰汁效果最好。另外也有研究發現生長素組合中加入6-BA的分化效果最好[13-14]。

NAA和6-BA對不定芽的誘導起到主要作用,如金雄霞等[32]對中國水仙鱗莖盤外植體和愈傷組織進行誘導,發現NAA 1.0 mg/L+6-BA 10 mg/L最好。林加根等[33]認為漳州水仙鱗莖誘導芽的最佳培養基是MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。王文婷[14]對花葶的誘導試驗,發現最佳培養基激素組合為6-BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

生根培養中研究最多的是NAA的濃度,如顧亨森等[28]用中國水仙的不定芽和中國水仙小鱗莖為外植體,發現NAA的濃度在0.01～0.30 mg/L時不定芽都可以生根;對于小鱗莖來說NAA濃度0.03 mg/L最合適。劉炤[13]對比發現只添加NAA的培養基生根效果比只添加IBA的好,最佳的生根培養基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L。而蔡月琴等[12]的生根培養過程中卻發現1/2MS+ IBA 1 mg/L的培養效果最好,證明IBA對生根誘導也有很好的促進作用。另外NAA和IBA組合使用對生根也有良好的效果[32-33]。

4.3 糖類及附加物

糖類可以為組織培養提供碳源,陳振光等[23]對不同種糖類試驗表明砂糖的誘導效果好于蔗糖。楊柳燕等[26]發現提高蔗糖濃度,有利于試管球的增殖和膨大,蔗糖濃度在40 g/L時試管球的增殖率最大,可達157.5%?；钚蕴匡@著降低試管球的增殖率,但對生根則有著促進作用。而鄭春明[8]發現硝酸銀的濃度在2.5 mg/L時水仙的誘導率高達91%,適量的硝酸銀對不定芽的形成有促進作用,愈傷組織再分化時不定芽不但生長速度較快,而且芽健壯整齊。但過量的硝酸銀則起到抑制作用,其生理生化機理不明。熊莉君等[19]將MS培養基中KH2PO4濃度加倍時小鱗莖增長速度較快,證明了P、K肥可以促使小鱗莖增大。

5 培養環境

光質和光照時間都會影響中國水仙的培養效果,水仙愈傷組織誘導黃光效果最好,紅光最差。綠光進行愈傷組織分化時的分化率最高[34]。MS培養基中KH2PO4濃度加倍與黑暗組合處理時,對水仙小鱗莖徑圍增大有顯著影響[19]。

6 煉苗和移栽

煉苗和移栽是植物離體快繁過程的最后一步,它關系著組培苗成活率的高低。鄭春明[8]對組培苗在4種不同處理介質中的移栽成活率進行研究,發現成活率都高于75%。楊柳燕等[11]將水仙組培苗室溫煉苗后直接栽入大田,可見水仙組培苗的適應能力比較強。

7 中國水仙離體快繁脫毒技術的應用

中國水仙離體快繁技術不僅可以大量快速地將具有優良性狀的植株繁育,在其他方面也有著重要作用。如在水仙脫毒方面有重要意義,利用DHT和高溫處理會降低病毒率;利用DHT和病毒唑各30 mg/L可有效降低NMAV病毒(水仙斑駁相關病毒),且不影響試管球存活;利用DHT和病毒唑各10 mg/L可將NDV(水仙退化病毒)和NCLV病毒(水仙普通潛隱)完全去除[31]。

8 存在問題與前景展望

與其他植物一樣,中國水仙的組織培養中也面臨著污染、褐化和玻璃化三大難題,此外病毒積累也是一個嚴重問題,因此利用微莖尖培養等技術生產中國水仙脫毒苗是非常必要的。

由于組織培養生產成本較高,有學者用液體培養基[32]進行水仙外植體震蕩培養,不添加凝膠成分也可以獲得較佳的成果。因此探討如何在保證培養效果的前提下降低生產成本,也是今后中國水仙組織培養的一個研究方向。

目前中國水仙組織培養相關的研究報道數量不多,可運用于生產的成熟的組織培養快繁體系尚未建立。未來需要更加重視水仙的組織培養相關研究,以推動水仙生物技術相關領域的技術突破。