前交叉韌帶重建術后移植物愈合的研究進展

王云鷺，李錫勇，劉倫，張鵬，韓鵬飛，李曉東*

(1.長治醫學院研究生院，山西 長治 046000；2.長治市第二人民醫院骨科，山西 長治 046000；3.長治醫學院附屬和平醫院骨科，山西 長治 046000)

據流行病學統計[1]，前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)損傷的發病率約為每年20萬例，若未及時治療，患側膝關節易反復扭傷，進而引起關節軟骨和半月板等解剖結構的損傷和退變，導致創傷性膝關節骨關節炎的發生。根據形態學的特點可將ACL損傷分為3級，1級：韌帶的完整性良好；2級：韌帶的連續性部分中斷；3級：韌帶的連續性完全中斷。其中3級ACL損傷可導致膝關節嚴重不穩定，需要及早一期重建和恢復膝關節穩定性，而前交叉韌帶重建術(anterior cruciate ligament reconstruction，ACLR)是目前ACL損傷或完全斷裂的最佳術式之一。目前，每年進行ACLR手術患者例數為6～10萬例，其中，大多數研究報道目前ACL移植術后的移植失敗率在0.7%～14%之間[2]。有證據表明，愈合不良可能是ACLR失敗的主要影響因素之一。van Eck等[3]的一項研究表明，在單束ACLR術后行翻修手術時最常見的ACL斷裂部位是在近端，其次是中段，并且將ACL移植失敗的原因歸結為手術技術、再發創傷以及移植物不愈合[4]。Group等[5]一個多中心前瞻性研究，也得到了類似的結論。由于手術技術[6]和康復方法的進步[7]，當ACLR術后沒有再發創傷性事件卻依然發生移植物失敗時，應考慮移植物愈合的問題。因此，需要更好地理解ACLR生物愈合的過程。

ACLR術后移植物愈合過程通常被分為3個階段，即早期愈合、浸潤增殖和基質重塑[8]。移植物早期愈合階段以移植物壞死和細胞缺乏為特征，沒有任何明顯的血運重建，隨后是細胞浸潤最密集的增殖階段，最后是緩慢的基質重塑階段。理想化的ACLR肌腱移植在骨隧道內牢固愈合的同時，需要術后盡快在關節內區域達到完全“韌帶化”，從而促進早期功能鍛煉和快速康復。因此，如何增強肌腱移植物的愈合對于ACLR成功與否至關重要[9]。然而，盡管多年來，不同的研究嘗試通過多種生物調節方式，以改善移植物的愈合，但是僅觀察到Sharpey纖維通過纖維軟骨區，并未獲得真正骨隧道完全閉合和骨化，以及移植物關節內區域的“韌帶化”等臨床結果。

1 移植物的愈合過程

移植物愈合過程是炎癥反應、移植物壞死、血運重建、細胞再生、骨長入、膠原重塑和韌帶化等多種生物事件的組合，并可被大致分為三個不同的階段：即早期愈合、浸潤增殖和基質重塑階段。

1.1 早期愈合階段 有研究表明，ACLR術后早期細胞反應涉及宿主炎癥細胞(中性粒細胞和巨噬細胞)的招募和炎癥因子(如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β)的釋放。移植物植入后不久，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-13水平升高，在消化膠原蛋白的同時幫助再生的細胞浸潤。同時，研究人員一致認為ACLR移植物早期愈合階段中心部分易發生缺血性壞死，導致一些細胞因子被釋放并啟動生長因子的級聯。與隧道內部分不同，移植物關節內部分暴露在滑液中，而滑液中含有大量的催化酶、細胞因子和生長因子抑制劑，會進一步干擾愈合過程。這些變化可能導致早期愈合階段缺血壞死、膠原紊亂(崩解或碎裂)、黏液樣變性，如果持續下去，可能導致移植物愈合失敗。因此，充分了解ACLR術后早期愈合階段的細胞和生化反應是很重要的。目前，臨床上大多在ACLR術后立即給予患者環氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2抑制劑或非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID)，在減少術后的疼痛和腫脹癥狀的同時，避免移植物早期愈合階段不良因素的影響[10]。

1.2 浸潤增殖階段 由于ACL移植物在植入后會發生壞死，因此充分的血運重建對移植物愈合過程中細胞再生和隨后的基質重塑至關重要。研究人員已經證實了自體移植物的血供和血管重建在維持移植物活力方面的重要性[11]。而血管重建早在植入后3周就完成了，甚至浸潤到自體移植物的中心部位[11]。這提示新生的血管可能是從滑膜和髕下脂肪墊發育而來，因此在手術中保留這些組織是非常必要的。也有證據表明[12]，與標準ACLR相比，術中保留原有ACL殘端，術后患者膝關節穩定性更好，臨床結果也更好。本體感受信息通過肌肉、肌腱和關節中的感受器記錄，本體感覺提供有關身體部位、身體在空間中的位置和運動情況以及運動條件變化的信息。ACL本身不僅具有其生物力學功能，而且還具有一定的本體感覺功能。與不保留殘端的ACLR相比，保留殘端可最大化保留ACL組織，使殘端包裹移植物的同時，加快移植物的血運重建，更好地封閉骨隧道，減少滑液進入導致的骨隧道擴大，從而促進移植物肌腱-骨之間的愈合，更利于本體感覺和術后膝關節功能的恢復。另外，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達與重建后血管密度的高低有關，而在體內觀察到VEGF的產生可能是由肌腱移植物的炎癥反應引起的[13]。

1.3 基質重塑階段 骨隧道的微環境類似于骨折的環境，而骨隧道壁的變化也與軟骨內成骨的過程相似。有研究表明，骨長入在移植物骨愈合過程中起著重要的作用，骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP；BMP-2、BMP-7)特異性地參與了導致骨長入和骨整合的基質重塑過程[14]。一些研究已經證實，除BMP-2、BMP-7以外，骨傳導劑如鈣-磷酸鹽骨水泥以及破骨細胞抑制劑也已被認為可用于改善肌腱移植周圍骨生長的潛在應用[15]。

在上述整個愈合過程中，Smith等[16]通過進行前抽屜試驗，隨訪觀察ACLR使用同種異體脛前肌肌腱移植術后12個月中每月膝關節松弛度的增加情況。結果顯示，術后6個月時膝關節松弛度增量最大，這與移植物骨愈合過程的時間軸(早期愈合階段結束和浸潤增殖階段開始之間)吻合。而在浸潤增殖后期和隨后的基質重塑期，膝關節松弛度并沒有再增加。因此，根據3個不同的階段(早期愈合、浸潤增殖和重塑成熟)和2個不同部位(關節內部分和骨隧道部分)出現不同的宿主和移植物反應，從反應發生的時間和地點上更好地理解和區分移植物愈合過程，對于理解和促進ACLR移植物愈合等相關研究大有裨益。

在早期愈合階段，宿主的炎癥反應和移植物的細胞壞死在ACLR術后立即發生。在下一階段浸潤增殖的過程中，根據移植物周圍的環境，不同類型的細胞被招募到骨隧道內(成骨細胞)和關節內(成纖維細胞)。這些細胞通過新生血管重新浸潤填充壞死的移植物組織以獲得營養供應。隨后的重塑成熟階段，這些再生細胞在機械負荷和生物化學的影響下，介導移植物不同區域(骨隧道內的肌腱-骨界面愈合和關節內區域的韌帶化)內的基質重塑過程。

與ACLR術后移植物愈合的傳統概念相反，作者強調移植物周圍環境的區域性差異影響了基質重塑過程。因此生物調節也應針對有利于細胞再生或基質重塑方面進行研究，以盡可能恢復ACL的原始生物學功能。

2 移植物愈合的生物調節

2.1 自/異體移植物的愈合差異 自體肌腱具有優異的生物力學特性，其結構更接近于健康ACL的解剖結構，具有較強的固定強度。隨著肌腱-骨愈合過程的進行，骨在骨隧道內逐漸與移植肌腱相結合，同時在肌腱與骨之間形成膠原纖維，這些纖維類似于正常固定在肌腱-骨之間的Sharpey纖維，使肌腱牢固固定于骨上。肌腱-骨經過24周后組織上顯示正常的過渡帶，提示移植物愈合[17]。肌腱-骨連接處的力學實驗表明，12周內兩者之間的結合強度逐漸增加，此后肌腱-骨連接處的強度停止增加[17]。

由于ACL具有特殊的膠原纖維排列及卷曲結構、獨特的起止點幾何外形及韌帶-骨移行區，異體肌腱移植后只能部分恢復ACL的功能。異體肌腱在移植后4～6周內發生滑膜樣變過程，其中移植物內的缺血帶發生缺血壞死，而新生血管化的滑膜組織則包裹著移植物[18]。在缺血壞死和血運重建階段，移植物膜樣組織為其血運重建提供來源，從髕下脂肪墊和滑膜穿出的骨血管為其血運重建提供支架，異體肌腱在骨隧道內經歷韌帶化過程，通過致密結締組織固定在骨隧道壁上，最終移植物愈合[17]。盡管異體肌腱的血運重建過程需要20周，但由于異體肌腱具有免疫原性，與自體肌腱相比具有相應較長的炎癥期過程，其重塑過程則需要更長時間(大于自體肌腱移植物愈合的24周)[18]。

2.2 生物調節部位 間充質干細胞、生長因子、生物材料和物理干預等這些生物調節方式或物質已被多項研究報道，應用于改善ACLR術后移植物的愈合結果，且絕大部分靶向作用于骨隧道區域內的肌腱-骨界面愈合[19]。然而據臨床報道，ACLR移植物斷裂最常發生部位在股骨插入處，其次是關節內中間區域[3]。動物研究也顯示出同樣的結果[20]。ACL重建成功與否取決于移植物和骨隧道之間的愈合過程。早期愈合過程中的薄弱環節是骨和肌腱之間的附著部位(肌腱-骨界面)，纖維血管組織在移植物和骨隧道內壁之間的界面處形成，膠原纖維隨后附著在肌腱-骨界面處，肌腱和骨骼通過特征錨定纖維(Sharpey樣纖維)直接連接。移植物的缺氧狀態可能導致潛在的骨隧道增寬和移植物松弛，限制康復和恢復活動。肌腱-骨愈合在ACL重建中界面的整合過程中起著至關重要的作用。因此，需要更多關注如何通過調節生物事件來改善移植物關節內中間部分的愈合效果。

2.3 生物調節的理想化目標 移植物模擬天然ACL的力學強度作為影響ACLR手術最重要的結果之一，學者們總是在努力但從未達到過理想化目標。McFarland等[21]建立的犬ACLR模型，術后4個月的移植物強度僅為天然對照組的40%。Ng等[22]檢測了山羊ACLR術后3年的生物力學數據，結果顯示移植物的強度和剛度分別僅為天然ACL的44%和49%。Clancy等[23]對恒河猴ACLR模型的研究顯示，肌腱移植物的抗拉強度約為轉移前的80%。而Fu等[20]在大鼠、Blickenstaff等[24]在新西蘭白兔等動物模型中發現，與天然ACL相比，ACLR移植物的強度僅為20%左右。

2.4 生物調節措施 以細胞補充為例，移植物愈合的增殖階段是通過移植物中的細胞浸潤和再生來完成的。為了增強細胞再生，既往研究使用了間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)、脂肪源性干細胞(adipose derived stem cells，ADSC)、ACL源性細胞、滑膜細胞和骨膜祖細胞，并研究了它們對ACLR移植物愈合的影響[25]。其中，最常用的干細胞生物調節方法是直接在關節內區域和/或骨隧道內注射或包埋入纖維蛋白膠中[25]。而Hur等[26]的研究表明，與直接注射或纖維蛋白膠技術相比，細胞薄片技術是一種更優越的將干細胞輸送到ACLR移植物的操作技術。此外，為了實現愈合過程中生長因子的持久和穩定的表達，學者們還將基于干細胞的基因治療引入了ACLR愈合相關研究中[27]。VEGF是一種內皮有絲分裂原，可促進血管生成，增加血管通透性，并在ACLR術后早期促進肌腱-骨纖維整合。從間充質組織(即骨髓)獲得的MSC可以分化為再生不同組織(如骨、軟骨、肌腱、韌帶和脂肪)所需的各種細胞類型(即成骨細胞、成纖維細胞)。生長因子也顯示出能夠調節和改善細胞增殖、分化和基質沉積，并影響MSC分化為成纖維細胞以修復撕裂的韌帶。生長因子對改善ACL愈合所需的各種生物過程顯示出積極作用。通過自分泌或旁分泌作用靶向細胞的MSC的增殖，增強了骨誘導并最終促進了肌腱-骨愈合。

3 移植物愈合的監測技術

3.1 核磁共振(magnetic resonance imaging，MRI) 在臨床上，MRI是最常用的監測ACLR術后移植物愈合過程的影像學技術。Howell等[28]進行了一項前瞻性研究，連續觀察ACL自體移植物術后1年的MRI表現。結果顯示，MRI移植物信號增強具有時間依賴性，移植術后3個月形態良好，術后1年時MRI信號增強，且被認為與移植物水腫有關。另外，通過T1加權像下給藥Gd-DPTA造影劑后MRI增強掃描來評估移植物血運重建程度，結果顯示盡管韌帶周圍軟組織血管豐富，但ACL移植物在植入2年期間沒有明顯的血供[29]。然而，Li等[30]評估了ACL移植物的MRI信號/噪聲系數(signal/noise quotient，SNQ)，在術后3、6和12個月以及9年ACLR移植物SNQ值與術后時間呈顯著負相關。如上所述，由于廣泛異質性的存在，各項移植物愈合的MRI研究結果存在很大差異，未來需要進一步客觀定量研究移植物愈合過程的MRI生物標志物的出現。

3.2 計算機斷層掃描(computerized tomography，CT) 鑒于普通X線片通常難以可靠地識別和測量ACLR骨隧道的寬度，故CT已被推薦用于評估ACL移植物愈合過程中的骨隧道變化。Suzuki等[31]通過CT掃描對使用骨-髕腱-骨移植物進行的ACLR手術評估，發現術后8周移植物幾乎完全融入股骨矩形隧道。Fink等[32]使用CT連續監測ACLR術后2年內骨隧道的變化過程，發現術后6周隧道變化明顯高于其他時間，而1年后隧道寬度基本穩定。對于自體腘繩肌腱行ACLR，術后平均隨訪10個月，CT掃描顯示股骨隧道直徑增加3%，并可顯示硬化的隧道邊界。因此，隨著CT技術的不斷發展，其可以準確地評估ACLR術后骨組織和軟組織的變化。

3.3 膝關節鏡復檢與組織活檢 由于MRI和CT等非侵入性方法可以獲得的移植物愈合信息仍然有限，ACLR術后的膝關節鏡復檢成為較可靠的移植物愈合監測方式，能夠提供ACL移植物滑膜化和血管化等有價值的信息。Nakamae等[33]在ACLR術后18個月通過關節鏡復檢證實移植物的滑膜覆蓋范圍明顯改善?；せ谝浦参镉现衅鹬匾饔?，并被認為對移植物的存活有積極的影響。此外，關節鏡還可通過獲取活檢樣本進行組織學檢查來研究ACL移植物的愈合過程[34]。有研究表明[35]，ACLR術后6個月時移植物表面血流量明顯高于對照組，12個月時達到平穩期，并保持與正常ACL相當的水平。雖然膝關節鏡復檢與組織活檢可以顯示移植物愈合過程中滑膜、血管和其他組織水平的變化，但限于是一種侵入性技術，故不能作為常規手段對愈合過程進行隨訪。

綜上所述，盡管通過三個階段(早期愈合階段、浸潤增殖階段和基質重塑階段)，以及宿主和移植物在兩個不同部位(關節內和骨隧道內)的反應，更清晰地描繪了ACLR移植物的愈合過程，但是如何更精確地在特定的時間段和部位通過生物調節發揮其在改善ACLR移植物愈合方面的潛力并獲得預期成果，未來仍需要更多高質量的深入研究(精確調節愈合目標階段)來進一步印證并提供新的思路。