X蛋白(pX)在血清4型禽腺病毒感染LMH細胞后對Toll樣受體的影響

李小鳳,韋 悠,羅思思,謝志勤,阮志華,張民秀,黃嬌玲,李 丹,萬麗軍,李 孟,任紅玉,謝麗基,謝芝勛

(廣西獸醫生物技術重點實驗室/廣西獸醫研究所/農業農村部中國(廣西)—東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,南寧 530001)

【研究意義】禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)通常感染5周齡以下的肉雞[1],被感染肉雞呈現心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome,HHS),其病理特征是心包內有透明或草莓色積液,肺水腫,肝臟腫脹變色,腎臟膨脹,伴有局灶性壞死和點狀出血。近年來,FAdV-4疫情在中國雞群中多次暴發,致死率高達80%[1-2],對家禽養殖業造成嚴重威脅。病毒在感染宿主后,宿主會啟動抗病毒的免疫應答系統來抑制病毒復制。了解FAdV-4編碼蛋白與宿主感染之間的相互作用有利于闡釋致病機制和開發新穎、有效的治療方案?！厩叭搜芯窟M展】禽腺病毒為無囊膜雙鏈DNA病毒,病毒粒子直徑70～90 nm,呈正二十面體結構,每個病毒粒子由252個衣殼粒組成[3]。其中,Hexon、Peton和Fiber是衣殼的主要結構蛋白,核衣殼蛋白還包括pX、pⅥ、pⅦ和pVⅢ。Hexon蛋白因其抗原決定簇和中和血清的特性,常被用作研究分子流行病學的靶標[4]。Penton蛋白在感染過程中附著于宿主細胞,依賴宿主細胞表面整合素介導細胞內吞[5];Shah等[6]研究表明,Penton蛋白作為亞單位疫苗免疫2周齡無特定病原(Specific pathogen free,SPF)雞,對攻毒試驗雞有90%的保護率,說明其有作為亞單位疫苗的潛力。纖突蛋白Fiber分為3個結構域(頭部、頸部、尾部),不同血清型的Fiber蛋白差異較大,FAdV-1、FAdV-4和FAdV-10有2個纖突蛋白,分別為Fiber-1和Fiber-2。Pan等[7]研究表明,在病毒感染過程中,Fiber-1蛋白頭部與宿主受體CAR結合促進病毒侵入宿主,Fiber-2促進病毒復制;韋悠等[8]研究發現Fiber-2截短重組蛋白及單克隆抗體具有良好的反應原性和特異性,可用于FAdV-4病毒檢測試劑盒研發。Ⅲα蛋白調節病毒侵入宿主細胞,協助病毒粒子的組裝成熟[9]。pX是由腺病毒晚期編碼的一種富含精氨酸殘基的高堿性蛋白[10],包含核和核仁定位信號序列[11]。此外,pX含有2個腺病毒蛋白酶切割位點[12],且其前體非共價結合病毒[13],并與病毒其他核心蛋白一起參與濃縮病毒基因組[14];人腺病毒pX能調節E2蛋白的積累[12];pX在病毒復制過程中參與將線性雙鏈DNA基因組帶到衣殼的過程[15-16];Zhao等[17]研究證實,FAdV-4 pX是誘導雞肝癌細胞(LMH)壞死的主要因子。以上研究證實,pX和其他編碼蛋白在病毒復制過程中發揮重要作用,但pX與宿主的天然免疫關系尚不清楚。病毒感染宿主后,宿主細胞啟動天然免疫系統利用一系列模式識別受體(Patterns recognition receptors,PPRs)識別病毒。PRRs包括Toll樣受體、MDA5和cGAS受體[18-19]。PRRs識別病毒核酸后,激活下游信號通路,誘導Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)及炎性細胞因子(如IL-1β、IL-6、IL-8和IL-15)產生,抑制病毒復制。雖然FAdV-4能引起宿主的天然免疫應答,但是也能逃避宿主強大的先天免疫反應,甚至進化出各種防御機制來保證自身的生存和復制。為研究FAdV-4編碼蛋白與宿主天然免疫信號通路的關系,廣西獸醫生物技術重點實驗室先后進行FAdV-4全病毒感染LMH細胞試驗及病毒Fiber-1、Peton、22k、52k等重組質粒轉染LMH細胞后病毒感染試驗,檢測天然免疫相關基因mRNA轉錄水平[20]。綜上所述,FAdV-4編碼蛋白在逃逸宿主天然免疫系統的識別和影響病毒感染進程等方面發揮著重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】在廣西獸醫研究所獸醫生物技術室課題組的前期研究中發現FAdV-4強毒株感染LMH細胞和SPF雞后,Toll樣受體及效應因子mRNA轉錄水平發生顯著變化[21-22],說明FAdV-4感染與宿主的天然免疫模式識別受體及其效應因子產生密切相關。已有研究表明pX具有結合病毒的功能[13],并參與濃縮病毒基因組[14],但在這些過程中,宿主天然免疫系統的作用尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】以FAdV-4 pX蛋白為研究對象,構建pEF1α-HA-X重組表達質粒,轉染LMH細胞,利用實時熒光定量PCR檢測10種Toll樣受體及6種效應因子mRNA轉錄水平,探討FAdV-4 pX蛋白在病毒復制過程中和宿主天然免疫之間的相互作用,為進一步闡釋FAdV-4感染致病機制和免疫應答機理提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病毒與細胞 FAdV-4(FAdV-4-GX2019-010株)、LMH細胞和PEF1α-HA載體均由廣西獸醫生物技術重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 PrimeSTAR?GXL PremiX Fast、Prime Script RT Master MiX、PMD18-T載體、TaKaRa DNA Ligation Kit Long、EcoR Ⅰ和KpnⅠ限制性內切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;DMEM/F12細胞培養基、胎牛血清(FBS)、轉染試劑盒(Lipofectamine 3000)、HA標記小鼠源單克隆抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG(H+L)購自美國賽默飛世爾科技公司;Universal Genomic DNA Kit購自康為世紀生物科技股份有限公司;Gene JET RNA Purification Kit、2×SYBR Green Master MiX購自美國英杰生命技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像分析儀(型號為Gel DocTMXR+)購自美國Bio-Rad公司;超微量分光光度計(型號NanoDrop2000)、實時熒光定量PCR儀(型號Quant Studio 5)購自美國賽默飛世爾科技公司;倒置熒光顯微鏡(型號ECLIPSETi2-U)購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 參考廣西獸醫生物技術室分離FAdV-4-GX2019-010株(登錄號MW439 040)已測得的X基因編碼區序列,使用Oligo 7.37設計PCR擴增引物。上游引物:5′-ccggaattcggATGCCCGCCGTGCTTTTGAC-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點),下游引物:5′-cccggtaccTCACTTGTTGCCATACAACTTATTG-3′(下劃線為KpnⅠ酶切位點),引物委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA抽提與X基因編碼區序列擴增 參照病毒Universal Genomic DNA Kit試劑盒說明書對FAdV-4病毒液進行DNA提取。以提取的DNA為模板,用PCR擴增X基因編碼區序列。反應體系為50 μL:2×TransTaq-T PCR Super Mix 25 μL,上下游引物各1 μL(引物濃度10 μmol/L),DNA模板3 μL,無核酸酶水補足至50 μL。反應程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,進行34個循環;72 ℃終延伸5 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分離得到目的條帶。

1.2.3 pEF1α-HA-X表達載體構建 目的條帶經膠回收后,與pMD18-T載體于16 ℃連接過夜,將連接產物轉化DH5α感受態細胞,37 ℃培養過夜,篩選陽性克隆,搖菌擴大培養提取質粒,進行雙酶切鑒定,將鑒定正確的樣品送至深圳華大基因科技有限公司測序,正確的重組質粒命名為T-X。

在37 ℃恒溫下,用EcoR Ⅰ和KpnⅠ限制性內切酶酶切pEF1α-HA載體和T-X重組質粒4 h,切膠回收目的片段,并將二者于16 ℃連接過夜,轉化DH5α感受態細胞,37 ℃培養過夜,篩選陽性克隆,經雙酶切及測序驗證,篩選插入完全正確的表達質粒,并命名為pEF1α-HA-X。

1.2.4 pEF1α-HA-X重組表達質粒轉染LMH細胞 LMH細胞按約1×106個/mL的數量接種于6孔細胞培養板,待LMH細胞鋪滿80%～90%,棄掉培養基,PBS洗2遍。分別將質粒pEF1α-HA-X(試驗組)和pEF1α-HA(對照組)與轉染試劑混勻(2 μg/孔),孵育30 min后轉染LMH細胞,作用4 h,補加2 mL 培養基,繼續培養24 h,LMH細胞狀態良好,以MOI=0.01的FAdV-4進行刺激1～2 h,棄去病毒液,加入病毒維持液,繼續培養24 h。以下試驗是在FAdV-4感染24 h后收集LMH細胞進行,同時設立pEF1α-HA-X與pEF1α-HA不添加病毒刺激組。添加病毒刺激組分別標記為pEF1α-HA-X+和pEF1α-HA+,不加病毒刺激分別標記為pEF1α-HA-X-和pEF1α-HA-。

1.2.5 pX重組蛋白Western-blotting和間接免疫熒光驗證 Western-blotting方法:收集細胞后用RIPA裂解液裂解,獲得蛋白混合液樣品,重組蛋白樣品經SDS-PAGE分離后轉印至PVDF膜,用4%脫脂乳室溫封閉4 h,棄除封閉液,加入HA標記小鼠源單克隆抗體(1∶2000),于4 ℃孵育過夜,次日用PBST洗膜4次,再加入按HRP標記山羊抗鼠二抗(1∶2000),室溫孵育1 h,用PBST洗膜4次,用DAB試劑顯色拍照。

間接免疫熒光方法:重組質粒轉染LMH細胞48 h后,棄除培養基,依次使用4%多聚甲醛固定15 min,通透液(Triton X-100)孵育15 min,封閉液封閉1 h。棄除封閉液,按500 μL/孔加入HA標記小鼠源單克隆抗體(1∶500),4 ℃孵育過夜。棄除一抗,PBS洗3遍。按500 μL/孔加入FITC標記的兔抗鼠二抗(1∶1000),室溫孵育1 h。棄除二抗,PBS洗3遍,用倒置熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.6 LMH細胞RNA抽提及反轉錄 收集細胞,參照Gene JET RNA Purification Kit抽提試劑盒說明書進行RNA抽提,超微量分光光度計測定濃度,進行一步法反轉錄,反轉錄反應體系為20 μL:5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL,RNA 1 μg,無核酸酶水補至20 μL。反轉錄程序:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。

1.2.7 實時熒光定量PCR測定 得到的cDNA稀釋10倍后作為模板進行實時熒光定量PCR,反應體系為20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free水6 μL。反應程序:50 ℃激活2 min,95 ℃預變性2 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,60 ℃延伸1 min,共40 個循環。每個樣品重復3次。以β-肌動蛋白基因(β-actin)為內參基因,檢測chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a、chTLR2b、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21、IFN-α、INF-β、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-15的mRNA轉錄水平,引物信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2.8 數據統計與分析 將獲得的試驗組與對照組目的基因及β-actin的Ct值,代入2-ΔΔCt公式計算相對表達量,計算公示為:

△Ct(試驗組)=Ct(試驗組目的基因)-Ct(試驗組內參基因);

△Ct(對照組)=Ct(對照組目的基因)-Ct(對照組內參基因);

△△Ct=△Ct(試驗組)-△Ct(對照組)。

添加病毒刺激組與未加病毒刺激組分別計算結果,表達量的差異倍數使用2-ΔΔCt。最后利用IBM SPSS statistics 2.0對數據進行Studentt差異性分析,P<0.05判斷為差異顯著,用*標注,P<0.01判斷為差異極顯著,用**標注。采用Prism 8制圖。

2 結果與分析

2.1 X基因編碼區序列PCR擴增及產物鑒定

以病毒基因組DNA為模板,PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠分離可獲得大小約為540 bp的條帶(圖1),與預期結果相符。測序分析顯示,FAdV-4的X基因開放閱讀框(ORF)長540 bp,共編碼179個氨基酸殘基,與本實驗室上傳到GenBank的血清4型禽腺病毒X基因(登錄號MN577984.1)核苷酸序列相似性為100%。

2.2 pEF1α-HA-X重組表達質粒雙酶切鑒定結果

pEF1α-HA-X重組表達質粒經雙酶切鑒定后得到540 bp片段,說明X基因目的片段已經正確插入pEF1α-HA載體(圖2)。經深圳華大基因科技有限公司測序,結果顯示插入的X基因大小、位置、ORF均正確,表明pEF1α-HA-X重組表達質粒構建成功。

2.3 pX重組蛋白Western-blotting和間接免疫熒光驗證結果

pEF1α-HA-X重組表達質粒(試驗組)和pEF1α-HA空質粒(對照組)轉染LMH細胞48 h后,Western-blotting結果顯示,試驗組裂解出來的蛋白與HA標記小鼠源單克隆抗體特異性反應,在27 kD處有一特異條帶,而對照組在此處沒有出現相應條帶(圖3)。間接免疫熒光結果顯示,試驗組的細胞可見大量綠色熒光,而對照組沒有綠色熒光(圖4)。說明pX重組蛋白在LMH細胞中正確表達。

M: Trans 2K DNA標記;1～4: X基因擴增產物。M:Trans 2K DNA Marker; 1-4: X gene PCR amplification products.

M:Trans 8K DNA標記;1～4:pEF1α-HA-X雙酶切產物。M: Trans 8K DNA Marker; 1-4:Double enzyme digestion of pEF1α-HA-X products.

2.4 FAdV-4 pX對LMH細胞Toll樣受體mRNA轉錄水平的影響

pEF1α-HA-X重組表達質粒轉染LMH細胞48 h后,所檢測的10 種chTLRs表達量與相應的對照組相比出現不同程度上調(圖5)。與pEF1α-HA-組相比,pEF1α-HA-X-組chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉錄水平極顯著上調(P<0.01,下同),分別為pEF1α-HA-組的9.76和12.34倍;chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA轉錄水平顯著上調(P<0.05,下同),chTLR3和chTLR4的mRNA轉錄水平上調表達,但差異不顯著(P>0.05,下同)。與pEF1α-HA+組相比,pEF1α-HA-X+組chTLR1a、chTLR1b、chTLR2a和chTLR2b的mRNA轉錄水平極顯著上調,分別為pEF1α-HA+組的3.78、4.10、6.70和5.57倍;chTLR3的mRNA轉錄水平顯著上調,為pEF1α-HA+組的3.09倍;而chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA轉錄水平與pEF1α-HA+組差異不顯著。與pEF1α-HA-X-組相比,pEF1α-HA-X+組chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉錄水平極顯著下調,分別下調60.0%和66.7%;chTLR2a、chTLR2b和chTLR3轉錄水平顯著上調2.91、2.01和1.47倍,其他chTLRs的mRNA轉錄水平下調,但差異不顯著。FAdV-4感染pX過表達LMH細胞24 h后,pX能促進chTLR2a、chTLR2b和chTLR3的mRNA轉錄水平表達,并抑制其他chTLRs的mRNA轉錄水平。

M:蛋白標記(11～180 kD);1:pEF1α-HA-X質粒; 2:pEF1α-HA空質粒。M: Protein Marker(11-180 kD);1: pEF1α-HA-X plamid;2:PEF1α-HA empty plamid.

圖4 pX重組蛋白的間接免疫熒光驗證結果(100×)Fig.4 Indirects immunoflurescence identification result of pX recombinant protein (100×)

2.5 FAdV-4 pX對LMH細胞效應因子mRNA 轉錄水平的影響

細胞效應因子檢測結果(圖6)顯示,未添加FAdV-4感染時,與pEF1α-HA-組相比較,pEF1α-HA-X-組IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-15的mRNA轉錄水平顯著提高;IL-8的mRNA轉錄水平極顯著提高,為pEF1α-HA-組的11.6倍;IFN-α的mRNA轉錄水平上調,但差異不顯著。添加FAdV-4感染24 h后,與pEF1α-HA+組相比,pEF1α-HA-X+組干擾素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-1β和IL-8)的mRNA轉錄水平極顯著提高,分別為pEF1α-HA+組的2.90、2.77、3.10和3.3倍;IL-6的mRNA轉錄水平顯著提高,為對照組的2.54倍(P<0.05);IL-15的mRNA轉錄水平與pEF1α-HA+組差異不顯著。與pEF1α-HA-X-組相比,pEF1α-HA-X+組IFN-α、IFN-β和IL-1β的mRNA轉錄水平顯著提高,分別提高2.03、1.05和1.55倍;而IL-6、IL-8和IL-15表達量下調,其中IL-8極顯著下調71.29%。上述結果說明,pX在LMH細胞過表達后,受到病毒感染時,能促進或抑制細胞效應因子表達,說明pX對宿主細胞的天然免疫有激活作用,也有自己逃逸天然免疫的策略。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同。 * indicates significant differences(P<0.05), and ** indicate extremely significant differences(P<0.01).The same as below.

圖6 FAdV-4 pX對效應因子mRNA表達量的影響Fig.6 Effect of FAdV-4 pX on the mRNA expressions of the cytokines

3 討 論

本研究中,pEF1α-HA-X重組表達質粒轉染LMH細胞后,無論是否被病毒感染,所檢測的10 種chTLRs受體與相應對照組相比都有不同程度地上調表達。其中,chTLR1a和chTLR1b轉錄水平在2種情況下均極顯著上調,與廣西獸醫研究所獸醫生物技術室課題組前期研究FAdV-4感染LMH細胞 24 h后,chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉錄水平升高一致。病毒刺激后,chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉錄水平反而下降,推測是因為pX在LMH細胞過表達后,pX具有一定毒性,宿主細胞的免疫系統被激活,而在病毒感染后,病毒編碼的蛋白抑制chTLR1a和chTLR1b轉錄表達,幫助病毒逃逸宿主天然免疫系統的攻擊。pX重組蛋白在LMH細胞過表達后,pEF1α-HA-X-組的chTLR2a、chTLR2b、chTLR5、chTLR7、chTLR15和chTLR21的mRNA轉錄水平比pEF1α-HA-組顯著上調,說明pX蛋白過表達后能促進上述受體的表達,激活宿主天然免疫系統。值得注意的是,chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15、chTLR21的mRNA轉錄水平在FAdV-4刺激后反而下降,原因可能是病毒與宿主相互作用過程中,宿主啟動的天然免疫系統對受體的選擇有偏好性,同時病毒也有可能通過其他途徑抑制上述受體表達來逃逸宿主天然免疫的攻擊,順利完成復制和生存。pX蛋白在LMH細胞過表達并添加FAdV-4感染后,與pEF1α-HA-X-組相比,pEF1α-HA-X+組chTLR2a和chTLR2b的轉錄水平極顯著上調,chTLR3的轉錄水平顯著上調,說明chTLR2a、chTLR2b和chTLR3參與調控宿主天然免疫應答過程,可作為研究宿主識別FAdV-4感染的模式識別受體。chTLR1a和chTLR1b,chTLR2a和chTLR2b分別由TLR1、TLR2分化而來,當TLR1和TLR2結合后能識別細菌脂多糖[23]。本研究發現,在同等情況下,chTLR1a和chTLR1b,chTLR2a和chTLR2b的mRNA轉錄水平比其他受體轉錄水平上調更明顯,可能在LMH細胞抗FAdV-4感染過程中,TLR1和TLR2聯合發揮作用。病毒感染后,chTLR1a和chTLR1b的mRNA轉錄水平下調,chTLR2a和chTLR2b的mRNA轉錄水平上調,推測是由于兩者在抑制病毒復制的分工不同。TLR3是核內保守性較強的功能蛋白,在抗病毒感染中發揮關鍵作用,可以識別病毒和雙鏈RNA[24]。TLR3是唯一完全依賴于β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TRIF)的核糖核酸傳感器,介導I型干擾素、促炎細胞因子和趨化因子的轉錄誘導,從而共同建立宿主的抗病毒反應[25]。本研究結果顯示,與pEF1α-HA-X-組相比較,pEF1α-HA-X+組chTLR3的mRNA轉錄水平顯著提高,推測chTLR3除了可以識別病毒RNA外,也可以識別FAdV-4基因組DNA在復制過程中產生的RNA中間體,從而抑制病毒復制。

此外,病毒攻擊宿主后,宿主天然免疫系統被激活,PRRs識別病毒后,宿主主要依賴Ⅰ型干擾素和促炎性因子抵御病毒。結果發現,pX在LMH細胞中過表達后,無論是否被病毒感染,所檢測干擾素(IFN-α和IFN-β)和白介素(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-15)mRNA轉錄水平與相應對照組相比均有所提高。pX在LMH細胞中過表達并被病毒感染后,pEF1α-HA-X+與pEF1α-HA-X-組相比,IFN-α、IFN-β和IL-1β轉錄水平顯著提高。IFN-α和IFN-β的功能主要是抑制病毒復制,IFN-β轉錄水平升高與chTLR3轉錄水平上調這一結果相呼應,說明本研究結果可靠,同時也說明pX通過激活宿主的天然系統,提高干擾素轉錄表達水平來抑制病毒表達。IL-1β、IL-6和IL-8屬于炎癥因子,炎癥因子積累有抑制病毒的作用,過多積累可能導致宿主炎癥損傷和急性死亡,這與Zhao等[17]研究發現pX是誘導LMH壞死的主要因子對應,同時與Li等[26]通過FAdV-4感染SPF雞檢測到IL-8表達水平升高結果相似,同時與廣西獸醫研究所獸醫生物技術室課題組前期FAdV-4感染CEF細胞后,SPF雞的IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18表達上調結果[22]相似。炎癥因子的積累導致宿主細胞的死亡,可能是由于宿主在抑制病毒復制,也可能是病毒利用宿主細胞的凋亡來逃逸天然免疫的攻擊使病毒得于繼續復制。這些結果表明pX在FAdV-4感染過程激活宿主天然免疫信號通路起到積極作用。

4 結 論

在LMH細胞過表達pX并添加FAdV-4感染后,pX能激活宿主免疫應答系統,Toll樣受體(chTLR2a、chTLR2b和chTLR3)和其效應因子(IFN-α、IFN-β和IL-1β)的mRNA轉錄水平顯著上調以抑制病毒復制,說明pX具備激活宿主細胞天然免疫系統的功能。