FBXW7過表達對棕櫚酸誘導C2C12細胞萎縮及焦亡的作用及機制研究

付婉瑞,古再麗努爾·卡德爾,何雅琦,馮穎

復旦大學附屬華東醫院營養科,上海 200040

肌少癥性肥胖(sarcopenic obesity, SO),即過度肥胖伴肌肉質量或功能低下,在65歲及以上老年人群的患病率已高達11%[1],作為一種肥胖與肌少癥共存的疾病,兩者互為因果,且與多種慢性非傳染性疾病的高發有關。研究表明, SO是老年人衰弱、代謝紊亂、住院和死亡的獨立顯著的危險因素[2]。焦亡(pyroptosis)是一種新近發現的程序性細胞死亡方式,不同于細胞凋亡,其特征為細胞膜結構完整性的破壞,以及細胞內容物釋放激活的強烈炎癥反應。肥胖和衰老可激活焦亡通路,后者在SO相關的全身性低度炎癥及眾多并發癥中扮演著重要的角色[3-4]。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7, FBXW7)是一種擁有7串聯WD40重復結構域的F-box蛋白,可直接識別并泛素化多種底物,作為腫瘤抑制因子得到了廣泛的研究。而近年來不少的研究發現, FBXW7還可調節脂質代謝并發揮炎癥抑制作用[5-6]。由此,探究FBXW7對焦亡通路的調節作用,可為SO防治策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器FBXW7過表達慢病毒及對照慢病毒載體(由上海吉凱基因醫學科技股份有限公司構建);胎牛血清(美國Gibco, 10091148);高糖DMEM培養基(中國思拓凡, SH30243.01);馬血清(中國美倫公司, MB2968);棕櫚酸鈉(美國sigma, P9767-5G); MG132(中國源葉公司, S42096); FBXW7抗體(美國Novus Biologicals, NBP2-50403);環己酰亞胺&ASC抗體(均購自美國CST, 2112S&67824T);GSDMD抗體(英國Abcam, ab209845); FBX32抗體&NF-κB p65抗體(均購自中國愛博泰克公司, A6825&A10609); SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(中國雅酶公司, PG212); CCK-8試劑盒、蘇木素與伊紅染色液、改良油紅O染色試劑盒、 RIPA、 GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶染色試劑盒、 NLRP3抗體、 CASP1抗體、 P21抗體(均購自中國碧云天公司,貨號分別為C0038、 C0107 &C0109、 C0158M、 P0013B、 AF1186、 A0208、 ST025、 C0602、 AF2155、 AF1681、 AF5252);多功能酶標儀(美國Bio-tek);凝膠成像系統(美國Bio-Rad);倒置常規顯微鏡(日本尼康);共聚焦顯微鏡(德國徠卡)。

1.2細胞培養小鼠C2C12細胞系(小鼠成肌細胞, FH0345)購自上海富衡生物科技有限公司。C2C12細胞首先培養于完全培養基中(含10%胎牛血清, 1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養基),當細胞達到80%匯合度時,更換為分化培養基(含2%馬血清, 1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養基)繼續培養4～5 d。

1.3細胞活力檢測CCK-8選用10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA,不含脂肪酸與IgG)溶解棕櫚酸鈉(palmitate, PA),干預C2C12細胞24 h構建SO細胞模型[7]。

篩選PA的工作濃度。96孔板中有提前接種細胞(5 000 cell/100 μL/孔)及無細胞的接種孔,每孔加入200 μL不同濃度PA溶液或對照BSA溶液,干預24 h后進行CCK-8測量：棄去舊培養基,每孔加入10% CCK-8溶液200 μL,繼續培養1 h,然后取出96孔板在450 nm波長下測定吸光度。細胞活力計算：細胞活力=[A(PA)-A(空白)]/[A(PA對照)-A(空白)]

A(PA)：具有細胞、 CCK-8溶液和PA溶液的孔的吸光度。

A(空白)：具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度。

A(PA對照)：具有細胞、 CCK-8溶液和PA對照溶液的孔的吸光度。

1.4FBXW7過表達使用FBXW7過表達慢病毒(FBXW7)及對照慢病毒載體(CMV enhancer-MCS-3flag-polyA-EF1A-zsGreen-sv40-puromycin, FBXW7-vec)轉染C2C12細胞72 h后,使用含嘌呤霉素的培養基篩選已成功轉染慢病毒的C2C12細胞;再選用嘌呤霉素濃度遞減為工作濃度的1/2～1/4的培養基,繼續對轉染后的C2C12細胞進行篩選和擴增,收集穩定過表達FBXW7的C2C12細胞進行后續實驗。

1.5蘇木素伊紅(hematoxylinandeosin,HE)染色培養皿中先加4%多聚甲醛室溫固定15 min,再加蘇木素染色液染色5～10 min,然后用蒸餾水洗去多余的染料。隨后加鹽酸乙醇分化液分化約30 s,再用蒸餾水沖洗約10 min;加伊紅染色液染色30 s,再用70%乙醇洗滌2次后置于鏡下觀察、拍照。隨機拍攝6個視野,測量每個視野中30個肌管的直徑。

1.6油紅O(OilredO,ORO)染色C2C12細胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min后,取適量染色洗滌液覆蓋細胞約20 s后棄去;加適量油紅O染色10～20 min,棄去油紅O染色工作液后,再加染色洗滌液覆蓋細胞約30 s后棄去;用PBS漂洗細胞約20 s后棄去,再加入新的PBS置于鏡下觀察、拍照。

1.7細胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色培養皿中加入β-gal染色固定液室溫固定15 min,加PBS潤洗細胞3次,每次3 min。棄去PBS,每孔加入適量染色工作液,置于37 ℃、無CO2恒溫箱過夜,然后置于鏡下觀察、拍照。

1.8乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)釋放實驗在“樣品最大酶活性對照孔”中加入10%的LDH釋放試劑,繼續培養1 h。然后取各處理孔上清液, 400 g離心5 min,轉移上清至新的96孔板中。按照說明書準備適量INT溶液(1X),然后按照乳酸溶液： INT溶液(1X)∶酶溶液=1∶1∶1配制LDH檢測工作液。在96孔板各孔中分別加入60 μL LDH檢測工作液及120 μL樣品,混勻室溫避光孵育30 min。然后在490 nm波長下測量吸光度。LDH相對釋放量(%)=100×(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/(細胞最大酶活性孔的吸光度-樣品對照孔吸光度)。

1.9免疫熒光使用4%多聚甲醛室溫固定C2C12細胞15 min,加入免疫染色封閉液,封閉約1 h。加配制好的FBXW7一抗溶液(1∶100)及GSDMD一抗溶液(1∶100),于4 ℃孵育過夜。洗滌后根據一抗種屬類型選擇合適的免疫熒光二抗,避光孵育1 h,洗滌后加入適量DAPI染色液,染核15 min。最后加入一滴抗熒光淬滅劑,置于共聚焦顯微鏡下進行觀察、拍照。

1.10免疫印跡(westernblot,WB)收集干預后的C2C12細胞,加入配制好的細胞裂解液(RIPA,含磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑),置于冰上充分裂解后,收集細胞裂解液, 13 000 rpm, 4 ℃離心15 min。收集上清液,加入蛋白上樣緩沖液,置于干式金屬浴儀器中, 100 ℃加熱15 min使蛋白變性。配制10%的SDS-PAGE膠,加入蛋白樣品, 120 V電泳1.5 h,然后收集凝膠,覆蓋PVDF膜置于轉膜夾中, 300 mA,冰浴轉膜2 h。收集PVDF膜孵育一抗溶液： FBXW7(1∶1 000)、 GSDMD(1∶1 000)、 ASC(1∶1 000)、 NLRP3(1∶5 000)、 NF-kB p65(1∶1 000)、 CASP1(1∶5 000)、 FBX32(1∶1 000)、 GAPDH(1∶10 000), 4 ℃過夜,洗膜后加入二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L), 1∶2 000)室溫孵育1 h,漂洗后置于顯影儀中進行曝光拍照。

1.11統計學分析所有實驗至少重復3次。使用GraphPad Prism 軟件進行數據處理,符合正態分布的計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示。使用ImageJ軟件處理染色以及WB條帶圖像。2組比較時使用非配對雙尾Studentt檢驗,多組比較時使用單因素ANOVA 及Bonferroni 事后檢驗進行分析。以P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1PA處理誘導C2C12細胞脂質積累及肌管萎縮衰老C2C12細胞在分化培養基中培養4～5 d后,可見C2C12細胞融合成多核肌管(圖1A)。參照文獻[7]及本研究CCK8的實驗結果,最終選用250 μM作為干預C2C12細胞的PA工作濃度(圖1B)。ORO染色結果顯示PA處理組肌管內出現較多的脂滴,而BSA干預的對照組無脂滴聚集,說明PA干預成功誘導C2C12細胞發生了成脂分化(圖1C)。另外,PA干預使C2C12肌管直徑減小,說明PA干預誘導肌管發生了萎縮(圖1D&E)。FBX32是肌肉萎縮的蛋白標志物, WB實驗結果發現PA干預組細胞中FBX32蛋白表達水平上升1.75倍,進一步證明了肌萎縮的發生(圖1F&G)。SA-β-gal活性增加是細胞衰老的常見標志,表現為藍綠色細胞數量增加。結果顯示, PA干預后的C2C12細胞SA-β-gal活性升高,即細胞老化程度上升(圖1H&I)。P21是細胞周期抑制因子,是細胞衰老標志物。WB實驗結果發現PA干預使細胞中P21蛋白表達水平上升1.68倍,進一步證明了細胞衰老的發生(圖1J&K)。

2.2PA處理誘導C2C12細胞中焦亡相關蛋白降解半衰期延長為了探究脂質積累對焦亡通路蛋白穩定性的影響,本研究檢測了PA干預C2C12細胞后焦亡相關蛋白的半衰期。環己酰亞胺(cycloheximide, CHX)是細胞內蛋白質合成的抑制劑。當細胞內蛋白質合成被抑制后,蛋白質水平會因為泛素化修飾誘導的蛋白酶體的蛋白分解作用下降。MG132是蛋白酶體抑制劑,可以抑制蛋白酶體的分解作用。WB實驗結果顯示, CHX干預后炎癥標志物核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)P65亞基以及焦亡標志蛋白核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3), 半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1, CASP1), 消皮素D(gasdermin D, GSDMD),和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的蛋白含量明顯下降,但PA干預后,可見以上蛋白標志物半衰期的明顯上升,表明PA可以明顯抑制蛋白質的降解作用,這和MG132的干預效果類似(圖2)。以上結果進一步說明PA引起炎癥及焦亡的原因可能與蛋白質穩定性相關。

2.3PA處理降低C2C12細胞中FBXW7表達水平PA 干預在降低C2C12細胞中肌管直徑和增加脂質積累的同時,可使FBXW7表達量下降(圖3A-C),這說明PA可能是通過降低FBXW7表達水平來調節SO表型。為了研究FBXW7在SO發生發展中的調控作用,本研究采用慢病毒載體轉染C2C12細胞來構建過表達FBXW7的穩定轉染株：熒光圖像顯示,慢病毒載體成功進入C2C12細胞(圖3D);WB顯示,慢病毒成功介導了FBXW7在C2C12細胞中的過表達(圖3E-F)。

注： A：不同培養階段C2C12細胞的HE染色; B：不同濃度PA干預C2C12細胞24 h后的細胞活力; C：工作濃度PA干預后肌管內中脂質積累(ORO染色); D&E.：工作濃度PA干預后肌管直徑變化(HE染色); F&G：工作濃度PA干預后FBX32表達水平變化。H& I：工作濃度PA干預后肌管老化程度變化(SA-β-gal染色); J&K：工作濃度PA干預后P21表達水平變化。與對照相比, ns無統計學意義,***P< 0.001, ****P< 0.0001。圖1 C2C12細胞的成熟分化, PA干預誘導C2C12細胞的成脂分化及肌管萎縮

注： WB分析CHX(10 μM)、或CHX + PA、或CHX + MG132(10 μM) 處理后C2C12細胞中焦亡標志物： NLRP3(圖A)、 GSDMD(圖B)、 CASP1(圖C)、ASC(圖D),以及炎癥標志物(P65,圖E)的蛋白表達量。在相同時間點, CHX vs CHX+PA或CHX vs CHX+MG132, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001。圖2 PA干預使炎癥及焦亡的蛋白標志物穩定性增加

注： A： PA及BSA干預的FBXW7共聚焦圖像(紅色, FBXW7;藍色,細胞核); B&C：工作濃度PA干預C2C12 細胞24 h后FBXW7表達水平; D-F：構建慢病毒轉染的FBXW7過表達C2C12細胞株(共聚焦顯像, WB)。與對照相比, ***P< 0.001, ****P< 0.0001。圖3 PA干預FBXW7表達與FBXW7穩定過表達C2C12細胞株

2.4FBXW7過表達改善PA干預誘導的C2C12肌管萎縮及焦亡使用PA干預過表達FBXW7的C2C12細胞,發現FBXW7過表達能改善PA處理誘導的肌管萎縮(圖4A&B)。焦亡的特征是細胞膜完整性喪失和胞質LDH的釋放,因此測量LDH釋放量可以反映細胞焦亡情況。LDH實驗結果顯示,FBXW7過表達可抑制PA誘導LDH釋放,說明FBXW7可以改善PA誘導的C2C12細胞焦亡(圖4C)。WB結果進一步證實PA干預可以誘導肌萎縮標志蛋白(FBX32)、炎癥標志蛋白(P65)以及焦亡相關蛋白(ASC、 CASP1、 GSDMD、 NLRP3)上調,而FBXW7的異位表達可以抑制PA誘導的上述效應(圖4D-E)。

2.5FBXW7與GSDMD存在共定位關系FBXW7通過其Cdc4磷表位(Cdc4 phosphodegron, CPD, S/TPXXS/T/D/E)與各種磷酸化底物結合,隨后通過K48泛素化和蛋白酶體介導底物的降解[8]。本研究分析了GSDMD及其同家族GSDME蛋白序列,發現其含有CPD基序,推測FBXW7可能通過與GSDMD的CPD基序結合調控蛋白穩定性(圖5A)。在PA干預后,本研究對C2C12細胞中的GSDMD蛋白及FBXW7蛋白進行了免疫熒光染色。結果顯示, FBXW7聚集于焦亡細胞的特征性水泡中(圖5B)。另外, FBXW7與GSDMD存在共定位關系,表明FBXW7可能與GSDMD直接結合發揮泛素化作用(圖5C)。

3 討論

肌少癥性肥胖,雖可見于任何年齡段的肥胖人群,但增齡過程中,伴隨骨骼肌質量與功能的逐步下降而出現的體脂的相對或絕對增加,仍不容忽視。脂肪組織關聯性代謝紊亂而產生的負面影響,如氧化應激、炎癥、胰島素抵抗等,可使肥胖獨立引起骨骼肌質量和功能下降;肌少癥因能量消耗減少可直接促進脂肪堆積;因此,肥胖和肌少癥可能會協同增強彼此的程度;此外,慢性非傳染性疾病及其并發癥、久坐少動等不良生活方式,也會增加SO的發病風險。有關SO定義、診斷的不斷更新及發病機制的探究,是SO治療的基石。

注： A&B： PA干預FBXW7過表達C2C12穩定轉染株24 h后肌管直徑變化(HE染色); C： PA干預FBXW7過表達C2C12穩定轉染株24 h后細胞外培養基中的LDH水平變化(LDH釋放實驗,按“最大酶活性孔”的LDH水平作歸一化); D-E： PA干預FBXW7過表達C2C12穩定轉染株24 h后FBX32、 ASC、 CASP1、 P65、 GSDMD、 NLRP3的表達水平(WB)與BSA組相比, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001;與PA + FBXW7-vec組相比, #P< 0.05, ##P< 0.01, ###P< 0.001, ####P< 0.0001。圖4 FBXW7過表達抑制PA誘導的C2C12細胞肌管萎縮、 LDH釋放及焦亡相關蛋白表達

SO發生機制中,增齡以及肥胖引起的炎癥和焦亡可能是骨骼肌萎縮和代謝失調的主要原因[9-11]。SO與炎癥關系密切。在肥胖小鼠骨骼肌中,可以觀察到肌萎縮和炎性細胞因子水平增加[9, 12- 13]。近期研究發現,高脂血癥[14]或其他刺激可以誘導NLRP3炎癥小體組裝,活化CASP1并且切割GSDMD蛋白,形成GSDMD-N插入細胞膜形成膜孔,促使細胞脹破,誘導細胞焦亡。因此,在肥胖以及肥胖相關炎性疾病中,焦亡通路以及相關蛋白的致病作用已經為人所熟知,而且是治療的潛在靶點之一[15-16]。另一方面,在快速老化小鼠大腦以及自然衰老的老年大鼠骨髓中,NLRP3、CASP1以及GSDMD表達的明顯上升[17-18]。而在香煙煙霧誘導和地塞米松誘導的肌肉萎縮小鼠模型中,焦亡相關蛋白NLRP3、 CASP1以及GSDMD等表達水平提高,而且抑制GSDMD表達可以改善小鼠骨骼肌萎縮[19-20]。在本研究中,PA處理的C2C12肌管中有脂滴形成,并伴隨肌管直徑縮小、細胞衰老、LDH釋放增加以及焦亡相關蛋白標志物的上調,表明焦亡參與了肥胖誘導肌萎縮的過程中。

注： A： GSDMD和GSDME中CPD結構域的比對; B： PA干預后明場以及FBXW7的免疫熒光圖像; C： PA干預后FBXW7與GSDMD的免疫熒光圖像(紅色, FBXW7;綠色, GSDMD; 藍色,細胞核)。圖5 FBXW7與GSDMD的共定位

焦亡相關蛋白的激活主要依賴于炎癥小體途徑,而蛋白的穩定與降解主要依賴于不同的翻譯后修飾,如琥珀?；揎梉21],氧化修飾[22],以及泛素化修飾[23]。其中,泛素化修飾是調控蛋白穩定性的主要途徑之一。線粒體泛素連接酶(mitochondrial ubiquitin ligase, MARCH5)是一種定位于線粒體的E3泛素連接酶。研究發現,MARCH5上調可以抑制炎癥性心肌病中GSDMD的表達,從而發揮保護心肌的作用[24]。另外,亞砷酸鈉可以抑制GSDMD的K48以及K63泛素化,導致GSDMD的積累,促使焦亡發生[23]。以上研究說明,泛素化修飾是調節焦亡通路的重要方式。本研究發現PA可以延長焦亡相關蛋白的半衰期,而且FBXW7過表達可以抑制以上過程,說明泛素化調節在焦亡通路調控中起著重要作用。

FBXW7具有多種生物學功能,可以調控衰老[25], 脂肪生成[26-28], 以及炎癥信號通路[29-31]。在葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠模型中,敲除小鼠腸上皮中FBXW7會激活NF-κB信號,導致促炎因子釋放[32]。在脊髓損傷小鼠模型中,促進FBXW7表達可阻斷NF-κB信號的激活,下調腫瘤壞死因子α和白介素1β[33]。FBXW7通過其CPD基序發揮泛素化修飾作用。研究發現,轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白δ(CCAAT/enhancer-binding protein δ, C/EBPδ)可以促進衰老小鼠肌內脂肪浸潤,從而引發肌少癥[34]。而C/EBPδ蛋白序列中存在CPD基序,因此FBXW7可以通過調節C/EBPδ蛋白的穩定性使之降解[29]。目前, FBXW7與焦亡通路的關系尚未見文獻報道。本研究首次發現上調FBXW7表達水平可以抑制PA誘導的肌管萎縮、 LDH釋放、以及焦亡相關蛋白表達的升高;并且, FBXW7與GSDMD存在共定位關系,說明FBXW7可能通過與GSDMD直接結合,調控其蛋白穩定性,發揮調節SO中焦亡途徑的作用。但尚需進一步的實驗探究其具體的泛素化形式以及結合位點,以及進一步的體內實驗驗證FBXW7對SO的調節作用。

總之,本研究結果表明, PA可以通過延長焦亡相關蛋白的半衰期來提高細胞中的焦亡水平,而FBXW7是以上過程的抑制因子,其機制可能是通過泛素化修飾焦亡相關蛋白來改善肌細胞焦亡。因此, FBXW7在SO的焦亡調控中發揮著關鍵作用,是治療SO的潛在靶點之一。