應用脈沖標記粗枝云杉和四川紅杉幼苗的13C分配特征研究

楊玉婷，楊紅艷，劉金超，曲煒辰，杜 婷，張 玉，張 麗，游成銘，譚 波，徐振鋒，李 晗

（四川農業大學生態林業研究所/長江上游林業生態工程四川省重點實驗室/長江上游森林資源保育與生態安全國家林業和草原局重點實驗室/高山森林生態系統定位研究站，成都 611130）

20 世紀80 年代以來，穩定碳同位素示蹤成為研究生態系統碳循環最科學有效的方法之一，可分析大氣-植物-土壤中碳的同位素變化規律，能夠真實地反映植物源土壤有機碳的累積及分解轉化過程[1-4]。自然界中12C 和13C 的相對豐度分別為98.89%和1.11%，14C只有極微量且具有放射性[5]，無放射性13C 無放射性對人體不具危害且具有標記均勻、可長期標記等優點，因而近年來研究者們更傾向于把穩定同位素13C作為示蹤物[6]。目前，碳穩定性同位素人工標記方法主要分為連續標記法和脈沖標記法，與連續標記相比，脈沖標記費用低、設備和環境條件要求簡單，在生態系統碳循環研究中得到了廣泛應用[7]。國內外許多學者對小麥、水稻和玉米等植物運用脈沖標記法進行同位素標記，研究其生長過程中光合碳的分配和轉移，對認識碳的轉化途徑和地球化學循環具有重要意義[8-12]。

隨著研究的深入，穩定碳同位素技術逐漸被用于研究植物-土壤系統碳循環[13-14]、植物體與環境的關系[15-17]、植物群落的動態變化[18]、土壤呼吸的動態變化及區分[19-20]、凈生態系統碳交換的區分[21-22]等研究領域。冉珊珊等[23]對互花米草進行了4 次13C 脈沖標記后發現，各器官固定的13C 量隨標記次數增加而增加，而孫昭安等[24]在13C脈沖標記法定量冬小麥光合碳分配及其向地下的輸入研究中發現，經過4 周的示蹤期后，13C 在冬小麥-土壤系統中的分配已基本穩定，已有研究多選取生長周期較短的草本植物進行標記，對生長緩慢的木本植物尤其是針葉樹種的標記研究鮮有報道[25-26]。粗枝云杉（Picea asperata）是川西亞高山森林主要的建群種之一，亦是長江上游生態屏障帶的重要組成部分[27-28]，而四川紅杉（Larix masteriana）作為四川特有彩葉樹種[29]，是維持川西亞高山森林生態價值和景觀價值的重要組成樹種[30]。因此，本研究選取針葉常綠樹種粗枝云杉和針葉落葉樹種四川紅杉幼苗為研究對象，采用13C脈沖標記法，探究標記后兩種針葉樹種植物體不同器官和土壤13C 富集的分布規律，為了解應用脈沖標記法在針葉樹種13C 穩定同位素標記過程中的光合碳分配規律提供科學數據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以生長良好、無病蟲害的5 a 生粗枝云杉和四川紅杉幼苗為實驗材料，兩種幼苗各25 株，高分別為50 cm和120 cm左右。將幼苗移栽至直徑20 cm，高30 cm的花盆中。培育土選用幼苗培育原土與營養土的混合土，每盆裝土約8 kg?；ㄅ柚糜诤銣?0 ℃、恒濕60%并裝有定時生長燈的培養室內，模擬幼苗原生環境，每天供給12 h光照。根據土壤水分情況，5～7 d 澆水1 次。培養4 個月后，選擇生長狀況良好的幼苗進行標記實驗。

1.2 13C脈沖標記

在幼苗生長旺盛期2020 年8 月初開始13C 標記實驗，間隔10 d，共標記4 次，每次標記均在晴朗白天進行。將生長架用透明加厚塑料膜覆蓋，用丁基防水膠帶內外密封（架高1.9 m、長4.2 m、寬0.8 m），上下層生長架分別放置粗枝云杉和四川紅杉幼苗，利用Na213CO3（99 atom%13C）與2 mol/L HCL 反應提供13CO2進行標記。在箱內安裝4個小型電風扇，用于保證箱內氣體混合均勻。另選取四川紅杉和粗枝云杉未標記的幼苗各6株作為對照。具體標記步驟為[23]：

①.生長架每層放置4 個250 mL 的燒杯，其中2 個燒杯中放置5 g Na213CO3，另外2 個燒杯中放置5 g Na212CO3；

②.標記箱每層放置2 個1 L 量杯，向量杯中分別倒入250 mL 500 g/L NaOH，密封標記箱，打開風扇，讓幼苗進行光合作用的同時吸收CO2，造成幼苗“饑餓”狀態，提高后期幼苗對13CO2的固定;

③.一段時間后，取出量杯，關閉生長燈，迅速分別向每層裝有Na213CO3的1個燒杯中倒入200 mL 2 mol/L HCL 溶液，待反應5 min 后，打開生長燈，打開風扇，靜待幼苗進行光合作用45 min；

④.重復步驟③，繼續向每層裝有Na213CO3的另1個燒杯中倒入HCL 溶液產生13CO2，靜待幼苗進行光合作用45 min。最后2 次則分別向每層裝有Na212CO3的燒杯中倒入HCL 溶液產生12CO2，同樣前后分別靜待幼苗進行光合作用45 min，促進箱內13CO2同化，減少13CO2的損失，提高幼苗對13C 固定率。

⑤.整個標記過程持續5 h，標記完成后，撤除塑料蓋膜。

1.3 樣品采集與室內分析

脈沖標記完成后，對幼苗進行干旱處理，待幼苗枯死葉片凋落后，分別從組合標記架上隨機采集粗枝云杉和四川紅杉標記各6株以及未標記幼苗各6株，每株幼苗分別采集葉片、枝、根以及盆中土壤，密封帶回實驗室。采集植物器官和土壤樣品用去離子水洗凈后，于65 ℃烘干至恒重，分別磨碎混勻，過200 目篩，采用同位素質譜儀（CCIA-38, ABB Inc, Canada）測定δ13C值。

1.4 數據統計分析

采用配對樣本t-檢驗比較各樹種幼苗同一器官（土壤）在標記前后δ13C值的差異顯著性；利用雙因素方差分析檢驗器官（土壤）和樹種以及二者交互作用對標記前后幼苗13C 分布的影響。以上分析在Microsoft Excel 2013、SPSS 27.0（IBM Corp.）和Prism 8.0（Graphpad Software Inc.）中運行，顯著性水平設定為α = 0.05。

2 結果與分析

2.1 脈沖標記前后粗枝云杉與四川紅杉各器官δ13C值變化

由圖1（a）可見，未標記粗枝云杉的根、枝、葉和土壤的δ13C 值范圍分別為：-27.01‰～-26.87‰、-27.54‰～-27.58‰、-29.11‰～-29.02‰和-26.01‰～-25.87‰，其表現為葉＜枝＜根＜土壤，但是粗枝云杉根、枝、葉片以及土壤中δ13C值差異不明顯；而經過了4次13C脈沖標記后，粗枝云杉的根、枝、葉和土壤的δ13C值范圍分別為：-23.02‰～63.97‰、-23.72‰～18.52‰、-20.09‰～14.09‰ 和-20.27‰～-15.71‰，其表現為土壤＜枝＜葉＜根，并且粗枝云杉根的δ13C值遠大于粗枝云杉其他器官或土壤的δ13C 值，土壤的δ13C值遠小于粗枝云杉其他器官的δ13C值。對粗枝云杉不同器官（土壤）標記前后δ13C 值進行配對樣本t-檢驗，結果表明：粗枝云杉各器官以及土壤在標記前后均差異顯著（P＜0.05）。

圖1 標記前后粗枝云杉（a）與四川紅杉（b）不同器官（土壤）δ13C值 (n=6)Figure 1 δ13C values of different organs(soil) of P. asperata (a) and L. masteriana (b) before and after labeling (n=6)

由圖1（b）可見，未標記四川紅杉的根、枝、葉和土壤δ13C值表現為枝＜根、葉＜土壤，其根、枝和土壤的δ13C 值 范 圍 分 別 為：-27.67‰～ -27.54‰、-28.98‰～-28.95‰和-26.67‰～-26.54‰，葉的δ13C值均為-27.57‰，但是未標記四川紅杉根、枝、葉以及土壤的δ13C 值差異不明顯；完成4 次脈沖標記后，四川紅杉根、枝、葉以及土壤δ13C 值表現為土壤＜根＜枝＜葉，其根、枝、葉和土壤的δ13C 值范圍分 別 為：25.33‰～171.64‰、36.68‰～206.84‰、79.40‰～230.91‰和-16.49‰～-11.28‰，并且四川紅杉中葉的δ13C 值遠大于四川紅杉其他器官以及土壤中的δ13C 值、土壤中的δ13C 值遠小于四川紅杉其他器官中的δ13C 值、根與枝中的δ13C 值相接近。對四川紅杉不同器官標記前后δ13C 值進行配對樣本t-檢驗，結果表明：四川紅杉各器官以及土壤在標記前后均差異顯著（P＜0.05）。

2.2 粗枝云杉和四川紅杉13C分布規律的差異

將未標記的四川紅杉與粗枝云杉各體內器官與土壤中的δ13C進行比較發現：13C在四川紅杉與粗枝云杉各器官以及土壤中無明顯差異且均表現為葉＜枝＜根＜土壤；而對標記后四川紅杉與粗枝云杉各幼苗體內器官與土壤中的δ13C值作比較，結果顯示標記后四川紅杉13C富集量明顯高于粗枝云杉13C富集量，四川紅杉與粗枝云杉δ13C 值表為：四川紅杉＞粗枝云杉，且四川紅杉葉的13C富集量遠高于四川紅杉其余器官或土壤以及粗枝云杉各器官或土壤中的13C 富集量，其δ13C 值在標記前為-27.57‰，標記后δ13C 達到79.40‰～230.91‰，而粗枝云杉與四川紅杉土壤的13C富集量相接近，其δ13C值分別為-20.27‰～-15.71‰、-16.49‰～-11.28‰。對標記前后四川紅杉和粗枝云杉不同器官（土壤）δ13C值進行雙因素分析，結果表明：器官（土壤）、樹種以及二者的交互作用對標記前后幼苗的13C 分布均具有顯著的影響（表1）。

表1 標記前后四川紅杉和粗枝云杉不同器官（土壤）δ13C值的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA results of δ13C values in different organs(soil) of L. masteriana and P. asperat before and after labeling

3 討論

3.1 脈沖標記13C在不同樹種的富集分布規律

近年來，穩定性同位素技術的發展使得定量研究光合產物碳的去向成為可能[31]，發現器官（土壤）、樹種以及二者的交互作用對標記前后幼苗的13C 分布均具有顯著影響。在脈沖標記13C 時各器官及土壤13C 的富集量總體表現為：四川紅杉＞粗枝云杉，并且四川紅杉葉片富集的13C 值遠高于其他器官或土壤的13C 富集。造成這種差異的原因可以從兩種樹種的形態特征和對環境的適應性展開。

植物通過光合作用固定13CO2，將光合碳產物輸送至植物體各個部位，并通過根系轉移到土壤，經過土壤微生物作用最終回歸大氣或以有機質的形式固定在土壤中。在這個過程中，由于不同植物的形態特征及對環境的適應性不同，其對光合產物的分配和累積情況也不同[31]。相關研究表明，葉片作為光合作用主要器官能直接影響植物的光能利用率和CO2固定能力。孟猛等[32]研究表明，具有較大葉面積指數的樟樹相比于夾竹桃樟樹能夠接受更多的光合有效輻射，從而使得光合固定碳的能力得到明顯提升[33-34]。同時，葉片的δ13C 值還受環境溫度、相對濕度、光照與海拔等因素影響[35-36]。在本研究中四川紅杉各器官及土壤對13C 的富集量高于粗枝云杉，可能是因為四川紅杉葉面積相比于粗枝云杉更大，能夠固定更多的13C；此外，四川紅杉與粗枝云杉最適生長的環境狀況也存在差異：四川紅杉幼齡階段有明顯的速生性，為中國落葉松屬植物中較耐陰的種類，喜溫涼、濕潤氣候；粗枝云杉稍耐蔭，能耐干燥及寒冷的環境條件。在本研究中空氣濕度更適于四川紅杉生長，從而使得四川紅杉的光合速率相對更快，對13C的富集量更大。

3.2 脈沖標記13C在不同器官的富集分布規律

植物體器官在生長發育與生理代謝過程中執行功能和養分需求不同，使得植物體對于光合產物在器官間的分配存在差異。在本研究中，不同器官（土壤）對標記前后13C富集量具有顯著影響。植物主要依靠葉片的光合作用13C 固定在植物體內，并在植物-土壤系統中進一步分配，經過4次脈沖標記后，四川紅杉各器官（土壤）13C豐度值表現為：葉＞枝＞根＞土壤；粗枝云杉各器官（土壤）13C 豐度值表現為：根＞葉＞枝＞土壤。兩種樹種葉、枝和根的13C 富集量均大于土壤，這與冉珊珊等[24]用13C脈沖標記法研究互花米草光合碳的分配和安婷婷等[9]標記玉米1 d后同一處理組13C豐度變化的研究結果一致。此外，器官間光合產物差異也與外部環境相關，但是本研究僅在4 次標記完成后進行一次性采樣，無不同采樣時間對比，未能對各器官13C 富集量細微變化進行追蹤。

而在不同物種間器官的13C 富集量又存在著差異。早前的研究發現植物光合固定的13C 在不同器官的分配通常表現為莖、葉＞根，這與其本身生理生化過程有關，大部分固定的碳留在地上部分[37-38]；而在本研究中，四川紅杉葉的13C 富集量要顯著高于其他器官，從植物形態學上看，光合產物的運輸規律是先滿足上部器官的積累后再滿足下部器官的積累，這符合光合產物分配的“就近原則”，而粗枝云杉根的13C 富集量要高于其他器官?？赡苁怯蓛蓸浞N的生長特征差異引起，四川紅杉作為速生樹種，幼苗期注重于葉（地上部分）的生長；而粗枝云杉在幼齡期生長緩慢[39]，注重根系（地下部分）生長和養分積累，從而呈現以上結果。

綜上所述，脈沖標記法在實現針葉樹種13C 穩定同位素的標記中效果良好。經過4 次標記，兩樹種各器官和土壤的13C 豐度在標記前后發生了顯著的改變，且落葉樹種四川紅杉表現出對外源13C 更好的固定能力，其中葉片在各器官中實現了最多的13C 富集。這些結果表明脈沖標記法在探究幼苗期針葉樹種器官-土壤中光合產物分配規律方面效果良好，為穩定同位素脈沖標記法在植物生理和生態中的應用提供了一定的基礎數據和技術支持。但本研究整個標記過程均在室內模擬進行，不能完全代表高山植物生長的實際環境，且不同植物的標記時間、次數分別對不同器官標記效果的影響也有待進一步探究。