基于網絡藥理學及分子對接技術探討半夏瀉心湯治療慢性淺表性胃炎的潛在作用機制

周玉其，向世俊，周春穎，陸多多，崔嘉樂，雷熙，吳佳楠，黃一興，張維炊，杜以寬，楊 春*（.廣東醫科大學東莞市干細胞與再生組織工程重點實驗室，廣東東莞 523808；2.東莞市人民醫院中心實驗室，廣東東莞 523059）

慢性淺表性胃炎（CSG）是指胃黏膜在幽門螺桿菌（Hp）感染和炎癥細胞浸潤等各種致病因素作用下所致的非萎縮性慢性炎癥性病變，患病率極高，約占接受胃鏡檢查者的80%～90%[1]，如未獲得有效治療，可發展為慢性萎縮性胃炎（CAG），少數還存在癌變風險[2]。在臨床上對CSG 的治療沒有特效藥，多以對癥治療為主，主要包括根除Hp、胃黏膜保護、抑酸和增強胃腸動力等，雖然能取得一定的療效，但存在復陽率高和副作用大的問題[3]。CSG 屬中醫“胃脘”“心下痞”等范疇，發病機制主要是脾胃受損致胃失和降、脾失健運，使脾胃的納運和升降的功能失調，氣機郁滯，日久可致“濕阻”“食積”“痰結”“血瘀”等病理表現，從而加重病情。近年來，中醫藥治療CSG 的療效，尤其是在降低復發率和顯著改善患者臨床癥狀等方面的作用逐漸得到了臨床的認可[4]。其中，中醫的經典方劑——半夏瀉心湯在臨床上療效突出。該方劑由半夏、黃芩、干姜、人參、甘草、黃連和大棗等組成，具有辛開苦降、寒熱平調、補瀉兼施的配伍特點以及具有和胃降逆、散結除痞、和中健脾的功效[5]。此外，半夏瀉心湯還有抗炎、抗幽門螺旋桿菌、保護胃黏膜、抗氧化應激、調節胃腸功能和免疫調節的作用[6-7]。半夏瀉心湯可顯著改善Hp 感染、胃酸分泌過多和胃黏膜損壞等臨床癥狀[8]，但其作用的分子生物學機制目前尚不清楚。在大數據時代，網絡藥理學有助于更好地系統性研究中醫藥，對中醫藥研究具有重要的實踐指導意義，且分子對接技術可以彌補藥理實驗帶來的不足，為中藥活性成分的篩選提供解決方法[9-10]。本研究通過網絡藥理學的方法探討半夏瀉心湯治療CSG 的潛在分子機制，并運用分子對接技術驗證，為更深入研究半夏瀉心湯治療CSG 的活性成分及分子機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 半夏瀉心湯有效成分和靶點的收集

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）分別查找半夏瀉心湯中的藥材：半夏、黃連、黃芩、干姜、人參、甘草和大棗，并獲取相應的化學成分。以口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 為條件進行有效成分的篩選，并運用TCMSP 數據庫查找篩選所得化合物對應的靶點，然后通過Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）將篩選出的靶點轉化為對應的Gene Symbol 和Uniprot ID。

1.2 CSG 靶點獲取

以“chronic superficial gastritis”為關鍵詞在Gene Cards 數據庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM數據庫（https：//omim.org/）中獲取CSG 疾病靶點，將收集的靶點匯總，去重后得到CSG 疾病靶點。

1.3 藥材-成分-靶點圖的構建

根據收集到的半夏瀉心湯藥材的有效成分和對應的靶點，使用Cytoscape 3.8.2 軟件建立“藥材-成分-靶點”網絡，并使用軟件自帶的“Network Analyzer”板塊進行網絡拓撲學分析。

1.4 蛋白網絡互作（PPI）圖構建

將收集到的有效成分對應的靶點和CSG 疾病靶點進行比對，篩選出兩者交集的靶點，將交集靶點輸入string 數據庫（https：//-db.org/）進行PPI 網絡分析，分析模式設置為“Multiple proteins”，物種限制為“Homo sapiens”，置信度設置為≥0.90，并隱藏孤立蛋白，導出TSV 文件。然后使用Cytoscape 3.7.2 軟件繪制PPI 網絡，采用“Network Analyzer”板塊對該網絡進行網絡拓撲學分析，根據介數中心性、緊密度及節點連接度篩選得到核心靶點。

1.5 基因生物功能學（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將兩者交集的靶點的Gene symbol 輸入DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/），設置物種為“Homo sapiens”進行GO 和KEGG 通路富集分析，然后使用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）將GO 分析結果用條形圖表示，KEGG 分析結果用氣泡圖表示。

1.6 成分-靶點-通路網絡的構建和拓撲分析

為了進一步說明成分、靶點和通路之間的關系，使用Cytoscape 3.8.2 軟件構建“成分-靶點-通路”網絡圖，并對網絡進行拓撲分析，以介數中心性、緊密度和節點連接度分析得到核心成分。

1.7 分子對接驗證

從PDB 數據庫（http：//www1.rcsb.org/）中下載核心靶點蛋白質結構，使用Chimera 軟件除去其他多余的鏈和水分子，利用Pymol 獲得對接盒子信息。從TCMSP 數據庫中下載化合物的mol2 文件后，導入Chem 3D 軟件，調整化合物空間構象，Minimize 能量優化，保存為mol2 結構。使用Ledock 軟件上傳化合物和蛋白文件，輸入盒子信息，將化合物以及對應靶蛋白對接，獲取對接結果。利用Pymol 對結果進行分析，得到化合物-靶蛋白對接圖。

2 結果

2.1 半夏瀉心湯化學成分及靶標篩選結果

以OB≥30% 和DL≥0.18 為篩選條件，共獲得活性成分212 種，去除重復成分后共191 種，其中25 種成分未能在TCMSP 數據庫中查詢到對應的靶點，2 種成分的靶點無法在Uniprot 數據庫中找到對應的Gene Symbol 和Uniprot ID，所以最終篩選得到164 個有效成分和267 個靶點。

2.2 CSG 靶點的獲取

選取在GeneCards 數據庫靶點中大于中位數的前351 個靶點和OMIM 數據庫中的前300 個靶點，匯總去重后最終獲得583 個疾病靶點。

2.3 藥材-成分-靶點網絡的構建和分析結果

使用Cytoscape 3.8.2 軟件建立“藥材-成分-靶點”的網絡圖（圖1），圖中包含438 個節點，2 610 條邊。其中，7 個天藍色圓形節點是中藥，11 個粉紅色正方形節點是7 味中藥的共有成分；153 個正六邊形節點是7 味中藥分別的獨有成分：7 個紫色的是黃連的成分，85 個淺綠色的是甘草的成分，3 個黃色的是干姜的成分，12 個深藍色的是大棗的成分，25 個棕綠色的是黃芩的成分，12 個肉色的是人參的成分，9 個深紅色的是半夏的成分，267 個橙紅色菱形的是藥物靶點。

圖1 半夏瀉心湯藥材-成分-靶點網絡圖

2.4 PPI 網絡互作結果

將中藥有效成分對應的靶點和CSG 疾病靶點進行比較，篩選出兩者交集的靶點共89 個，如圖2 所示。將交集的靶點輸入String 數據分析平臺，進行蛋白互作用分析后，再運用Cytoscape3.7.2 軟件繪制PPI 網絡圖，見圖3。該網絡共涉及85 個靶點（有4 個靶點為孤立蛋白）和362 條邊。在PPI 網絡中隨著節點連接度值和combined-score 增大，節點和邊均逐漸增大，顏色亦由紅轉變為藍。PPI 網絡顯示，以STAT3、JUN、TP53、MAPK1、RELA、AKT1 和TNF 等節點為中心，節點連接度值較高。以介數中心性大于中位數0.005644，緊密度大于中位數0.411765，節點連接度大于兩倍中位數14 為條件，篩選得到STAT3、JUN、TP53、AKT1、MAPK1、RELA 和TNF 等11 個核心靶點，見表1。

圖2 半夏瀉心湯有效成分和CSG 疾病的交集靶點

表1 11 個核心靶點

圖3 PPI 網絡圖

2.5 GO 富集及KEGG 富集分析

使用DAVID 6.8 對兩者交集的89 個靶點進行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析，獲得715 條GO條目和112 條KEGG 通路。然后以錯誤發現率（FDR）<0.01 為篩選條件，得到214 條GO 條目，其中分子功能（MF）22 條、生物過程（BP）175 條、細胞組成（CC）17 條以及KEGG 通路85 條。對于GO 富集分析結果，按照FDR 值從小到大的順序進行排序，各取排列前10的條目做成三合一柱狀圖，圖中條形的長度代表相應條目所富集基因數量，如圖4 所示。在生物過程方面，靶點主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程的負調控、對藥物的反應和基因表達的正調控等過程上。在細胞組分方面，靶點主要富集在細胞質、細胞外間隙、胞外區、線粒體和細胞質的核周區域和蛋白質復合體等處。在分子功能方面，這些靶點主要與蛋白質、酶和轉錄因子結合，具有蛋白質同源和異源二聚體活性等。對于KEGG 分析結果，按照FDR 值從小到大的順序進行排序，取排列前10 的條目進行可視化，制成氣泡圖，如圖5 所示。KEGG 富集分析結果顯示，靶點主要富集在結直腸癌、膀胱癌和胰腺癌等癌癥通路、TNF 信號通路和HIF-1 信號通路等。

圖4 GO 功能富集分析結果

圖5 KEGG 通路分析

2.6 成分-靶點-通路網絡的構建和拓撲分析

利用Cytoscape3.8.2 軟件對藥物活性成分-作用靶點-通路進行網絡構建，得到一個具有199 個節點、608 條邊的網絡，見圖6。紫色的節點代表藥物活性成分，青色的節點代表作用靶點，黃色的節點代表通路。通過“Network Analyzer”對網絡進行分析，以介數中心性大于中位數0.000195，緊密度大于中位數0.441964，節點連接度大于2 倍中位數6，篩選得到網絡中10 個核心活性成分，見表2。槲皮素連接靶點有46 個，漢黃芩素20 個，山奈酚19 個，黃芩素13 個，β-胡蘿卜素13 個，金合歡素11 個，甘草查耳酮A9 個。

表2 成分-靶點-通路網絡中核心成分拓撲學性質

圖6 藥物活性成分-作用靶點-通路網絡圖

2.7 分子對接驗證

從“成分-靶點-通路”網絡中篩選出來的11 個核心成分中選前3 個成分及其對應靶點與PPI 中的關鍵靶點中相同的靶點進行分子對接，得到結果見表3。分子對接吻合度越小代表配體與受體蛋白結合性越好，發生作用的可能性越大。關鍵靶蛋白與有效成分的結合能均遠低于-5.0 KJ/mol。各靶點與成分的3D結合模型見圖7?；衔?靶蛋白對接圖顯示化合物與靶蛋白能形成氫鍵等分子間作用力，進一步說明了篩選結果的可靠性。

表3 關鍵靶點及其對應化合物分子對接結果

圖7 各靶點與藥物成分相互作用的分子對接示意圖

3 討論

慢性胃炎是一種進行性、終身性炎癥，可在數年或數十年逐步發展為萎縮性胃炎，而萎縮性胃炎是目前公認的癌前病變，可進展為胃癌[11]。循證醫學表明，半夏瀉心湯在改善CSG 患者胃脘痛、痞滿、噯氣癥狀療效明顯，且Hp 轉陰率和胃鏡改善率都優于對照組，有助于防止疾病進一步進展，符合中醫“治未病”的思想理念，體現了中醫藥獨特的優越性[12]。

本研究通過對“成分-靶點-通路”網絡的拓撲分析可以得知槲皮素、漢黃芩素、山奈酚、黃芩素和β-胡蘿卜素的度值較高，提示可能是半夏瀉心湯治療CSG的主要有效成分。研究表明，槲皮素還可以通過上調BCL-2 水平，下調BAX 水平，使BCL-2/BAX 比例增加，抑制胃上皮細胞凋亡，同時可以下調p38MAPK 信號通路，促進細胞周期進展來增強胃黏膜細胞的增殖，從而發揮保護胃黏膜的作用[13]。漢黃芩素是從黃芩中提取的一種黃酮類物質，具有抗腫瘤活性，其機制可能是通過降低HIF-1α 和MCT-4 蛋白的表達抑制胃癌細胞SGC7901 的增殖，可以上調PFP 等的表達增加NK細胞對胃癌細胞的殺傷活性[14-15]。山奈酚還可以通過抑制中性粒細胞聚集和髓過氧化物酶（MPO）的活性，調節炎癥細胞因子表達水平及促進NO 生成發揮胃保護作用[16]。研究表明，黃芩素對酸化乙醇誘導的胃急性潰瘍的保護作用與抗氧化應激、抑制胃酸分泌、增加胃黏液分泌、調節炎癥的機制有關[17]。

由PPI 網絡圖可知半夏瀉心湯治療CSG 的主要靶點為STAT3、TP53、TNF 和IL-6 等。這些靶點主要與炎癥、細胞凋亡、氧化應激和免疫調節等相關。AKT1屬于蛋白激酶超家族，它不僅能調節細胞代謝，還能調節細胞遷移和侵襲，具有致癌作用[18]。研究表明，與未感染Hp 的非萎縮性胃炎相比，感染Hp 的非萎縮性胃炎p-Akt 表達增加，且在慢性萎縮性胃炎和胃癌中AKT1 表達顯著增加[19-21]，我們推測AKT1 可能與CSG疾病的惡性轉化有關。研究報道黃連和半夏可以降低大鼠胃黏膜組織中AKT mRNA 和p-Akt1 的表達水平[22]。槲皮素也可以通過降低p-Akt 水平，抑制PI3K/Akt 信號通路誘導細胞凋亡來抑制胃癌干細胞的生長，還能激活p53/AMPK/mTOR 信號通路，增強胃癌細胞自噬水平，誘導胃癌細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤功能[23-24]。此外，黃岑素處理的胃癌MGC-803 細胞也可以抑制PI3K/AKT 信號通路并誘導其自噬[25]。綜上所述，夏瀉心湯可能是通過多種有效活性成分協同靶向AKT1 途徑抑制細胞增殖、促進細胞凋亡和自噬發揮治療作用。

STAT3 是JAK-STAT 信號通路的重要成員，與細胞的增殖、分化及凋亡等密切相關，可調控機體炎癥和免疫反應等生理病理過程[26]。研究發現激活JAK1/STAT3 信號通路會促進巨噬細胞發生極化并釋放TNF-α、IL-6 和IL-8 等炎性因子[27]。而山奈酚可以通過抑制JAK1 和JAK2 的磷酸化阻斷LPS 處理的巨噬細胞中的JAK-STAT 信號通路抑制炎癥發生[28]。同時槲皮素也可以抑制IL-6 和IFN-γ，減少p-STAT1 和STAT3 蛋白，抑制CCA 細胞中的JAK-STAT 級聯反應[29]。TP53 又被稱為p53，屬于抑癌基因，與抗炎活動有關[30]。有研究報道，p53 可以顯著抑制小鼠原發性巨噬細胞TNF-α基因表達，降低血清TNF-α 水平，發揮抗炎的作用[31]。高尤亮等[32]研究發現，可以通過上調p53 的表達促進炎癥細胞凋亡，抑制TNF-α 等炎癥細胞因子表達，從而使胃黏膜癥狀減輕。TNF-α 可以誘導炎癥細胞損傷胃黏膜，破壞胃黏膜的保護屏障[33]。陳永燦等[34]的研究表明，半夏瀉心湯可以通過下調NF-κB 的表達抑制炎性細胞TNF-α 等的轉錄、釋放，從而促進胃黏膜組織的修復。NF-κB 的過度激活是炎癥反應的重要原因之一，槲皮素和山奈酚能夠通過調節其活性，在mRNA 和蛋白水平抑制iNOS、COX-2 和C 蛋白反應，發揮抗炎作用[35-36]。槲皮素還可通過TNFR-c-Src-ERK1/2-c-Fos和NF-κB 通路下調TNF-α 誘導的基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達發揮對人胃黏膜上皮損傷的抗炎保護作用[37]。IL-6 是炎癥起始階段的重要促炎癥因子，槲皮素可以抑制脂多糖（LPS）誘導的中性粒細胞表達IL-6 發揮早期抗炎作用[38]。在LPS 誘導的THP1 巨噬細胞中漢黃芩素可以通過顯著抑制IL-6/STAT3、PI3K/AKT 信號通路發揮抗炎作用[39]。吉英等[40]研究發現，半夏瀉心湯可以下調IL-6 水平抑制胃潰瘍患者的炎癥反應。綜上所述，半夏瀉心湯可能是通過多種有效活性成分協同調節復雜的炎癥信號傳遞級聯反應發揮抗炎作用。

由KEGG 富集分析結果顯示，半夏瀉心湯與CSG的交集靶點主要富集在癌癥通路、TNF 信號通路和HIF-1 信號通路上。Hp 是非萎縮性胃炎向萎縮性胃炎發展、發生癌前病變和癌癥的重要因素，根除Hp 可以減少癌前病變，預防胃癌的發生、發展[41-42]。研究發現，Hp 感染慢性胃炎患者血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高，且血清TNF-α 和IL-6 表達水平與慢性胃炎的嚴重程度密切相關[43]。刁卓等[44]實驗表明TNF-α在胃癌中的表達明顯高于癌旁正常組織，并證明了胃癌中存在RIP3/TNF-α 通路上調介導的程序性細胞壞死。郭春秀等[45]的研究結果表明，半夏瀉心湯可以抑制NF-κB/STAT3 信號通路的激活，減少炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8 和原癌基因BCL-2 的表達，從而抑制癌前病變的發生和發展；同時，還可通過抑制Hp，降低血清中TNF-α 含量，發揮對Hp 相關性胃炎的治療作用。綜上所述，半夏瀉心湯治療CSG 的作用與抑制Hp感染及對TNF 信號通路進行調控有關，也進一步印證了我們的預測結果。

HIF-1α 是重要的促癌基因，在缺氧條件下該基因被激活從而起到促進癌細胞增殖和轉移過程的作用[46]。胃黏膜的血管損傷可使其發生缺氧性病變，誘導產生血管內皮生長因子（VEGF），胃癌前病變大鼠胃黏膜上皮細胞微血管損傷所致缺氧環境可誘導HIF1-α 的表達，HIF1-α 可能通過上調VEGF 的蛋白表達促進胃癌發生[47]。王紅麗[48]的研究表明，半夏瀉心湯可以通過抑制HIF-1α 等的表達，減輕機體炎癥反應及血管內皮損傷從而緩解癥狀。由于胃黏膜的炎癥刺激，NF-κB 活化并激活HIF-1α/VEGF 通路，發生局部缺氧并加重炎癥反應[49]。楊佳偉[50]在單用槲皮素的情況下，發現其可抑制HIF-1α 的表達，抑制LOVO細胞的遷移。有研究發現黃芩素可以降低 HIF-1α 的表達和轉錄活性；黃芩素與TLR4 直接結合也可以抑制HIF-1α/VEGF 信號通路，減少血管生成[51-52]。綜上所述，半夏瀉心湯可能通過調控HIF-1 信號通路治療CSG。

本研究通過網絡藥理學分析并結合文獻研究，發現槲皮素、漢黃芩素、山奈酚、黃芩素和β-胡蘿卜素等為半夏瀉心湯的主要活性成分，通過分子對接驗證了槲皮素、漢黃芩素、山奈酚與核心靶點AKT1、IL-6 和MAPK1 結合均較好，與已有的文獻呼應。本研究從成分、靶點和信號通路的角度研究半夏瀉心湯治療CSG的作用機制，為闡明半夏瀉心湯治療CSG 的活性成分和潛在作用機制提供了一定的參考價值，但所得結果有待進一步通過實驗進行驗證。