基于臘葉標本分析的木姜葉柯表型性狀變異及地理分化研究

趙鵬霞，楊 旭，楊志玲，田朝霞，羊奕珣

（1.中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2.河北農業大學 園藝學院，河北 保定 071000；3.浙江省林木育種技術研究重點實驗室，浙江 杭州 311400）

【研究意義】植物表型是現代植物育種研究中的重要方向之一，對植物表型性狀的研究有助于全面、系統地揭示樹種遺傳變異規律，以及植物在生長過程中對資源的分配利用和對環境的適應規律[1]。植物的表型性狀是基因型對外界環境變化的適應性響應，在長期的選擇壓力中發生不可逆的變化，經穩定遺傳后產生的[2-3]。植物表型性狀中，葉片是對環境變化敏感且可塑性較大的器官[4]，葉片表型性狀不僅影響植物的基本行為和光合功能，而且能反映植物對不同生境適宜能力及其與環境相互作用等信息[5-6]?！厩叭搜芯窟M展】植物標本承載著大量的植物信息以及生境信息，為記錄生物多樣性的檔案，亦是人類分類調查資源研究活動的百科全書[7]?！爸袊鴶底种参飿吮攫^”（Chinese Virtual Herbarium，簡稱CVH）以電子數據形式存儲植物標本資料，為不同需求的用戶提供標本數據查詢及共享服務，使植物標本得到充分有效利用[8-9]，植物標本數據信息化也是國際上的發展趨勢[10-11]，據統計僅在2006—2016 年CVH 標本資源信息支撐了17 部專著、近600 篇科研論文的發表，其科研成果主要應用于瀕危物種評估、國家重點野生植物分布、中醫藥植物分析等多個領域[7,12]。木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）為殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）常綠喬木，其葉片含有二氫查耳酮類化合物，味甜，可代茶飲，又名甜茶?，F代藥理研究表明，木姜葉柯葉片二氫茶耳酮類化合物中根皮苷能抑制葡萄糖在腎臟的重吸收，進而控制血糖，干預糖尿病、腎病的發生和發展，還可促進葡萄糖的分泌、降低空腹和餐后血糖水平，而不發生低血糖副作用[13]；二氫查耳酮類化合物中根皮苷、三葉苷和根皮素能預防和改善糖尿病并發癥，它們在抗糖尿病作用上受到越來越多的關注[14-15]。2017 年木姜葉柯被國家衛計委批準為新食品資源原料[16]。

【本研究切入點】木姜葉柯廣泛分布于我國秦嶺以南的廣大亞熱帶地區[17]，由于其分布區生境多樣，其不同地理居群間在區域尺度上產生一定形態分化，目前有文獻[18]報道過廣西境內的木姜葉柯葉片表型性狀，在其廣大分布區內葉片表型性狀變異及地理分化特性尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】本文通過研究國內多個植物標本館內木姜葉柯的臘葉標本的葉片表型性狀變異，揭示居群內和居群間地理變異模式，探明葉片表型性狀變異及其與地理-氣候因子的關系，研究結果能為種質資源收集保存評價及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所觀測的木姜葉柯1 200余份標本來自中國科學院植物研究所標本館（PE）、中國科學院華南植物園標本館（IBSC）、中國科學院昆明植物研究所標本館（KUN）、江蘇省中國科學院植物研究所標本館（NAS）、中國科學院成都生物研究所植物標本室（CDBI）、江西農業大學林學院樹木標本館（JXAU）、廣西植物研究所標本館（IBK）、四川大學生物系植物標本室（SZ）、浙江自然博物館植物標本室（ZM）、中南林業科技大學林學院森林植物標本（CSFI）、廈門大學標本館（AU）等。選取其中標本保存完好，采集地清楚，且采集號大于3 份的館藏標本，共計469 份，它們分別屬于62 個居群。不同居群地理氣候因子見表1，其中各地經緯度信息來自GoogleEarth，氣象數據來自中國氣象科學數據共享服務網。

表1 木姜葉柯標本地的地理氣候因子Tab.1 Geographic and climate factors of specimen collection place of L.litseifolius

續表 Continued tab.

續表 Continued tab.

1.2 試驗方法

利用Adobephotoshop 軟件中的標尺對數字標本館下載獲得的標本圖片進行葉片形態參數的測量和統計。統計的指標包括葉片長度（leaf length，LL），葉片寬度（leaf width，LW），葉面積（leaf area，LA），葉尖長度（tip length，TL），葉尖夾角（tip angle，TA），葉基夾角（base angle，BA），葉柄長度（petiole length，PL），數出一級側脈數（primary lateral veins，PLV），并計算葉片長寬比（LL/LW）。

1.3 數據統計

用SPSS19.0軟件One-way ANOVA 計算木姜葉柯居群間葉片均值、方差、變異系數，葉片表型可塑性指數（PPI）用來解釋表型可塑性的特征。

式（1）中，MAX 和MIN 表示某一環境下的最大平均值和最小平均值，PPI 取值為0～1[19]，其值越大表示表型可塑性越大。用巢式方差分析計算葉片表型性狀的變異來源，用Person 相關分析分析葉片各表型性狀之間以及表型性狀與各地理氣候因子的相關系數，以各居群測定值的平均值為單元，利用樣本相關矩陣進行主成分分析，并利用主成分分析的結果對各居群進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 木姜葉柯葉片表型變異特征

表型可塑性大小用變異系數（CV）和表型可塑性指數（PPI）表示。對469 份木姜葉柯葉片的9 個表型性狀進行統計分析（表2）。由表2 可知，木姜葉柯葉片表型性狀變異范圍較大，差異明顯，遺傳多樣性豐富。一般而言，變異系數大于10%表明樣本間差異較大，木姜葉柯葉片性狀的平均變異系數在9.79%～42.57%，平均變異系數為22.59%，其中TL 度的變異幅度最大（42.57%），其次為PL（31.28%），TA、BA 和PLV 的變異幅度相對較小，分別為9.79%、16.87%和10.43%。計算不同居群葉片表型可塑性發現，木姜葉柯葉片性狀的表型可塑性在0.50～1，TL＞PL＞LW＞LA＞LL＞LL/LW＞BA＞PLV＞TA。說明這兩種表型可塑性分析方法的結果相似。在木姜葉柯表型性狀中，TL 可塑性最大，TA 表型可塑性最小。

表2 木姜葉柯葉片表型性狀特征Tab.2 Leaf phonotype traits characteristics of L.litseifolius

木姜葉柯數字標本葉片表型性狀的各個指標居群內和居群間的差異分析見表3。由表3可知，不同居群間葉片表型性狀存在著極顯著的變異（P＜0.01），葉片LL、LW、LL/LW、TL、TA、BA 及LA 的變異主要來源于居群間，PL和PLV數的變異不僅來源于居群間，也來源于居群內。

2.2 木姜葉柯葉片表型性狀的相關分析

對木姜葉柯9 個葉表型性狀作person 相關分析（表4）。由表4 可知，葉片表型性狀間存在顯著或極顯著的相關關系，其中葉片長與葉片寬、葉尖長度、葉面積呈極顯著的正相關，與葉基夾角呈顯著負相關；葉片寬與葉片長寬比呈極顯著負相關，與葉面積呈極顯著正相關，與葉柄長呈顯著負相關；葉片長寬比與葉尖長度和葉尖夾角呈顯著正相關，與葉基夾角呈極顯著正相關；葉尖長度與葉基夾角呈顯著負相關，與葉面積呈極顯著正相關；葉尖夾角與葉脈對數呈極顯著的負相關；葉基夾角與葉脈對數呈顯著正相關。

進一步將葉片表型性狀與標本采集地經緯度和氣候因子進行相關性分析（表4）。由表4 可知，LL、LW 及LA 與采集地經度呈現極顯著負相關，BA 與緯度呈極顯著負相關，LL 與LA 與年降水呈顯著負相關，BA 與極端最低溫度呈極顯著正相關，結果表明生境的地理氣候因子對葉片表型性狀產生一定影響。

表4 木姜葉柯葉片表型性狀與地理因子的相關系數Tab.4 Correlation coefficient of leaf phonotype traits and geographic factors of L.polystachya

2.3 木姜葉柯葉片表型性狀的主成分分析

對9 個葉片表型性狀進行主成分分析，得到3 個特征值大于1 的主成分（表5）。由表5 可知，第一主成分與LL、LW、LA、TA 顯著相關，貢獻率為38.845%，第二主成分與LL/LW、BA、PLV 顯著相關，貢獻率為24.910%，第三主成分與PL、PLV 顯著正相關，貢獻率為17.699%。以上3 個主成分的累計貢獻率為81.454%。

表5 木姜葉柯葉片表型性狀的主成分分析Tab.5 Results of principal components analysis of leaf phonotype traits of L.polystachya

利用提取的主成分數值對62 個居群進行聚類分析（圖1）。由圖1 可知，62 個居群分為4 大類，其中第Ⅰ類為長披針形葉片，包括浙江、云南、湖北居群，廣西金秀、凌云、隆林、上林居群，四川德昌、天全居群和江西貴溪、井岡山居群，它們葉片的特征：葉片較長，葉尖長度較大，葉柄較短；第Ⅱ類為寬披針形葉片，包括貴州各個居群，廣西賀州和龍勝居群，湖南桂東、新寧、宜章居群，四川峨眉、米易居群和重慶奉節居群，它們葉片的特征：葉片長且寬，葉片長寬比較小，葉尖長度較大，葉柄較長；第Ⅲ類為長橢圓形葉片，包括福建將樂、泰寧、武夷山居群，廣西鳳山、靖西、那坡居群，四川敘永居群和重慶南川居群，它們葉片的特征：葉片相對較短而窄，葉片長寬比較大，葉尖長較小，葉柄較短；第Ⅳ類為寬橢圓形葉片，包括廣東和海南居群以及江西、湖南南部、福建西部和廣西東部且靠近廣東居群，它們葉片的特征：葉片較短而寬，葉片長寬比較小，葉尖長較小而葉柄較長。

圖1 不同居群木姜葉柯葉片表型性狀聚類分析Fig.1 Cluster analysis result of populations based on L.polystachya leaf phenotypic trait

3 討論

3.1 木姜葉柯葉片遺傳變異豐富

植物表型性狀多樣性是其遺傳適應性和環境異質性長期共同作用的結果，表型性狀變異越豐富，越能提高其對不同環境的適應程度[20-21]。表型性狀變異是遺傳變異的重要組成部分，表型性狀變異越大，存在的遺傳變異可能越大[22]。木姜葉柯廣泛分布在亞熱帶地區，該區域受海洋或內陸等環境和自然條件差異較大，同時作為一種雌雄同株和風媒傳粉植物，其不同居群葉片表型性狀上存在極大的變異，9個葉片表型性狀變異系數9.79%～42.57%，且葉片表型性狀遺傳分化顯著，表明葉片對異質生境具有較強可塑性。表型性狀變異的豐富性為育種專家尋找符合生產需求的品種提供了資源的可能性。木姜葉柯是以葉片為主要利用部位的樹種，不同居群葉片表型性狀變異較大證實其存在豐富的遺傳多樣性，從中挖掘優異基因作為育種材料，將為種質資源保護、利用、創新及遺傳改良提供基礎。

3.2 木姜葉柯葉片表型性狀與地理-氣候因子的關系

通過在較大尺度上針對特定植物類群基于居群水平表型性狀變異分析及研究表型性狀及其與地理-氣候因子間的關系，可以更準確地揭示植物表型性狀的變異格局及生態響應策略[23]。木姜葉柯葉片表型性狀變異呈現經緯雙向變異模式，其中葉片LL、LW、LA 與經度呈極顯著負相關，表現為典型的經向變異模式；葉片LL 和LA 與年降雨量呈顯著負相關，表明降水是影響葉片性狀的主要驅動因子；葉片BA 與緯度呈極顯著負相關，與極端最低溫度呈極顯著正相關，證明低溫是影響葉片基部性狀的主導因子，即隨著經度遞減，降雨逐漸遞減，葉片變短，葉面積遞減，但隨著緯度增加，極端低溫越來越低，葉片基部越來越寬，以減少水分散失，提高葉片對溫度和水分利用效率，從而適應復雜多變的生態環境。

3.3 木姜葉柯葉片表型性狀聚類分析

廣闊的分布區、多樣的生境和氣候的異質性，為研究木姜葉柯葉片表型性狀的地理變異模式提供可能。聚類分析表明木姜葉柯按葉片表型性狀提取的主成分數值可分為4個大類，從大的景觀尺度來看，各居群并未嚴格按照地理距離而聚類，說明居群的葉表型性狀變異具有不連續性；從較小的區域尺度來看，地理距離較近居群又聚為一大類。木姜葉柯葉片表型性狀的聚類結果，說明生長環境的相似性是居群按照地理距離聚類的重要原因，從大的景觀尺度可發現居群所生長的環境大多相對獨立，環境異質性也加劇了各居群間的獨立分化。木姜葉柯依靠風媒遠距離傳播花粉，種子結實量大，以果實為食的嚙齒類動物可使種子長距離擴散，居群間基因交流距離可能大于居群間的地理距離，這顯然造成了居群間基因交流較密切，使得地理距離較近居群具有相似的生態適應策略和地理變異格局。

4 結論

木姜葉柯葉片制作甜茶在我國有悠久的歷史，葉片中根皮苷、三葉苷和根皮素含量高及在抗糖尿病作用使其近年受到越來越多的關注。作為在我國亞熱帶地區分布極廣的資源樹種，長期適應性進化過程中因自身遺傳和外部自然地理環境等多因素綜合作用，木姜葉柯葉片表型性狀形成了豐富的遺傳變異，在不同地理居群間出現了顯著分化，且葉片表型性狀變異呈現經緯雙向變異模式，年降水量和極端最低溫度為主要驅動因子。隨著全球氣候的變化，二氧化碳濃度增高、降水量及極端溫度等關鍵驅動因子的變化可能引發木姜葉柯在適生區面積的日漸減少和分布中心的向北移動[24]。

基于臘葉標本的不同居群間木姜葉柯葉片表型性狀變異較大證實其種質資源有豐富的遺傳基礎，但對于其葉片表型性狀地理變異模式的辨析還需要實地采集更多葉片樣本、全面系統地深入研究，以期為資源保護和開發利用提供理論依據。