石墨烯對杉木無性系根際土壤酶活性和微生物多樣性的影響

邱靜雯，章進峰，張 筱，魏永平，陳愛玲，趙建國，葉義全，，曹光球，*

（1.福建農林大學 林學院，福建 福州 350002；2.福建省永安國有林場，福建 永安 366000；3.秦嶺國家植物園，陜西 西安 710404；4.國家林業草原杉木工程技術研究中心，福建 福州 350002；5.山西大同大學 炭材料研究所，山西 大同 037009）

【研究意義】杉木（Cunninghamia lanceola）是我國南方最重要的速生用材樹種之一。近年來，隨著木材市場對杉木材需求不斷增大，杉木人工林面積不斷擴大，同時對優質苗木的需求也隨之增加。優質苗木不僅能夠提高造林成活率，而且有利于提高苗木的抗逆性和促進其早期生長[1-2]。施肥是培育優質苗木的關鍵措施之一。但是不合理的施肥方式不僅增加林業生產成本，還容易導致土壤容重增加、田間持水量降低、土壤保水保肥能力下降等[3-4]，對環境產生一系列污染，甚至降低植物對養分的吸收利用效率，造成肥料嚴重浪費[1-2]。因此，制定科學合理的施肥措施，提高肥料利用效率成為當今林業亟待解決的技術難題之一?！厩叭搜芯窟M展】石墨烯是由碳原子以sp2雜化軌道構成的一種二維層狀新型碳納米材料，近年來越來越多研究表明石墨烯在促進植物種子萌發、根系生長、提高肥效等方面扮演著關鍵角色。張夫道等[5]研究表明，施加納米材料可提高植物肥料利用效率，有利于提高農產品產量與改善品質。相關研究表明石墨烯會穿透種子種皮促進水分吸收[6]，促進番茄[7]、甘藍型油菜[8]、蠶豆[9]等種子的萌發。氧化石墨烯和石墨烯可促進水稻[10]側根發育以及小麥[11]幼苗地上部的生長。值得注意的是，近年來一些研究相繼表明，石墨烯介導的植物生長調控與其對根際微生態系統結構與功能的改變密切相關[12-13]。土壤微生物是土壤生態系統中重要的組成部分，參與土壤中有機質分解、養分轉化循環等諸多生態學過程[14-15]，土壤微生物代謝活動、根系分泌物及腐殖質分解和合成是土壤酶的主要來源，土壤酶活性高低表征土壤熟化程度，影響著土壤微生物多樣性和群落結構組成[16]，因此土壤酶與土壤微生物均是反映土壤肥力的重要指標。蔣月喜等[17]在對朝天椒的研究中發現，在基礎施肥的基礎上添加適量濃度的石墨烯能夠提高根際土壤酶活性，改善土壤質量，增加朝天椒產量。劉澤慧等[18]研究發現石墨烯中的含氧官能團能以電荷吸引的方式吸附土壤中的陽離子，增強土壤團聚結構并釋放養分，間接為植物提供營養，促進植株生長發育。Song 等[19]研究表明石墨烯的施加提升了土壤酶活性，細菌豐度和多樣性指數顯著增加，且微生物多樣性指數與土壤脲酶、有機質、水解氮呈一致變化。Zhang 等[20]通過探究不同濃度石墨烯對長白落葉松根際土壤理化性質及微生物多樣性發現低濃度的石墨烯施加改善了長白落葉松根際土壤養分，顯著影響了土壤微生物多樣性和群落結構，一定濃度下石墨烯有益于植物生長發育?！颈狙芯壳腥朦c】目前碳納米材料主要運用在農業上，而在林業上鮮見研究報道。本課題組在前期研究中發現石墨烯與復合肥配施能夠促進杉木幼苗生長、氮素吸收利用[21-22]，但這種石墨烯介導的生長促進作用是否與其對土壤酶活性和微生物多樣性的改變有關則尚不清楚?！緮M解決的關鍵問題】鑒于此，本文通過分析不同濃度石墨烯處理對杉木幼苗根際土壤酶活性及微生物多樣性的影響，篩選出適合于杉木苗木施肥的最佳石墨烯濃度，從而為杉木優質苗木的高效培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗點概況

試驗地位于福建農林大學金山校區國家林業草原杉木工程技術研究中心田間實驗地大棚（26°05′N119°13′E）。試驗地屬亞熱帶季風氣候，年平均溫度20～25 ℃，年平均日照時數1 700～1 980 h，年平均降水量900～2 100 mm，無霜期約326 d。

1.2 材料來源

試驗用苗為福建省洋口國有林場提供的1年生‘洋061’杉木無性系扦插苗，平均地徑為（5.44±0.73）mm，平均苗高（29.32±3.17）cm。盆栽盆（容量為10 L，深度24 cm）為市場購買。盆栽土壤為過1 cm鐵絲網篩除雜質后混合均勻的山地紅心土，其化學性質為全碳（3.44±0.01）g/kg，全氮（0.44±0.01）g/kg，全磷（0.08±0.01）g/kg，全鉀（5.04±0.13）g/kg。石墨烯母液由山西大同大學趙建國教授課題組提供。復合肥（N∶P2O5∶K2O=16∶16∶16）由美國瑞恩集團公司生產。

1.3 試驗方法

依據課題組前期試驗結果，將5 g/L 的石墨烯母液分別稀釋成濃度為30，25，20 mg/L 試驗添加液。試驗采用完全隨機區組設計，3組完全隨機區組，每個完全隨機區組4種處理。處理一（T1）：復合肥30 g+石墨烯30 mg/L；處理二（T2）：復合肥30 g+石墨烯25 mg/L；處理三（T3）：復合肥30 g+石墨烯20 mg/L，處理四（CK）：復合肥30 g。每盆種植1 株苗，每盆為1 個重復，區組內每個處理10 個重復；共處理120 盆。試驗于2020 年5 月開始，2020 年11 月結束，共180 d。2020 年5 月15 日在苗木四周開2 cm 溝，分別施入30 g復合肥及不同濃度石墨烯添加液500 mL。培養180 d后，區組內取4株平均木，采用抖落法收集根際土壤，根際土壤樣品放在干凈的牛皮紙上自然陰干，研磨成粉狀過0.149 nm 篩后裝入自封袋后置于-80 ℃冰箱保存用于測定土壤酶活性及微生物多樣性，每個測試指標測定3個重復。

1.4 測定方法

1.4.1 根際土壤酶活性分析 土壤酶活性由蘇州科銘生物技術有限公司提供的微量法酶活測定試劑盒測定。

1.4.2 土壤微生物測定 采用Mobio 公司的PowerSoil DNA Isolation Kit 土壤微生物總DNA 提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，對提取后的DNA產物經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，合格DNA稀釋至1 ng/μL保存于-80 ℃。采用引物KYO2F（GATGAAGAACGYAGYRAA）和ITS4R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴增真菌ITS 區；采用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT）擴增細菌16SrRNA的V3～V4區，擴增過程參照文獻[23]進行。

1.5 數據處理

采用FLASH 軟件對原始數據進行質量過濾和雙端序列的拼接，得到有效數據；采用Uparse 軟件，將相似度≥97%的序列歸為一個操作分類單元即OTU（operational taxonomic unit）并利用Greengene 數據庫進行物種注釋；運用Qiime 軟件進行alpha 多樣性指數分析；用PAST 軟件進行土壤微生物與土壤環境因子RDA 典型相關分析；采用Excel 2012 軟件進行數據整理；運用Origin 9 軟件制圖；運用SPSS 23.0 統計軟件進行單因素及Person相關性分析。

2 結果與分析

2.1 石墨烯對杉木無性系根際土壤酶活性的影響

脲酶、谷氨酰胺酶、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶均是與氮代謝有關的酶，是影響土壤氮素水平的重要因子。由圖1 可知，T3 處理土壤脲酶活性比對照提高6.87%，而T1、T2 分別比對照降低29.84%、9.22%，T1 處理顯著低于T3、CK（P＜0.05）；T2、T3 處理硝酸還原酶活性比對照提高39.16%、59.32%，T1 降低34.79%，整體表現為T3＞T2＞CK＞T1，4 種處理均達到顯著性差異（P＜0.05）；T3 亞硝酸還原酶活性與對照相比提高2.65%，而T1、T2 分別降低14.44%、1.69%，但4 種處理之間差異不顯著；T3 處理谷氨酰胺酶比對照提高11.75%，T1、T2處理與對照相比分別降低3.9%、11.45%，T3顯著大于T2（P＜0.05），由此可知，當石墨烯濃度為20 mg/L 時，4 種酶活性最高且均高于對照組，隨著石墨烯濃度增加，其對土壤酶活性抑制作用增強，整體呈現低促高抑的變化規律。

圖1 不同濃度石墨烯處理對根際土壤酶活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of graphene on enzyme activities in rhizosphere soil

2.2 石墨烯對土壤微生物群落多樣性的影響

去除掉低質量的序列，得到的細菌樣本有效序列共1 391 114條，真菌樣本有效序列共1 393 737條，樣本測序覆蓋度均達到90%以上，表明該處理下主要優勢微生物得到分析，數據滿足后續的數值分析。

不同濃度石墨烯處理微生物多樣性指數見表1。Coverage 指數在不同處理之間均為0.99，說明樣本測序深度高，測序結果可信度高。Simpson 和Shannon 指數綜合體現物種的變化程度，細菌的Shannon、Simpson指數在不同濃度處理與對照之間差異不顯著，真菌T3、T2處理分別比對照提高18.39%、11.53%，而T1 降低了14.75%，大小排序為：T3＞T2＞CK＞T1，與對照差異顯著。Chao1、Ace 指數主要反映樣本的物種豐富度信息，是估計物種總數的指標，數值越大，表示樣本中物種多樣性越高，在細菌中T1、T2、T3 分別比對照提高0.02%、11.29%、10.26%，除T1外，與對照差異顯著，真菌T2、T3處理下Chao1與Ace指數與對照差異顯著，均在石墨烯濃度為20 mg/L時，多樣性指數最高。綜上所述，當石墨烯濃度為20 mg/L時，根際土壤微生物多樣性指數達到最大，相較細菌多樣性而言，石墨烯對真菌多樣性的影響更加顯著。

表1 根際土壤微生物多樣性指數Tab.1 Microbial diversity index of rhizosphere soil

2.3 根際土壤微生物多樣性與土壤酶活性相關關系

由表2 可知，硝酸還原酶與細菌中Chao1 和Ace 指數呈極顯著相關。在真菌多樣性指數中脲酶與Shannon 指數呈顯著正相關，硝酸還原酶與Shannon、Simpson 指數呈顯著極顯著正相關，與Chao1 指數呈顯著相關，谷氨酰胺酶與Shannon、Simpson指數呈顯著相關。

表2 根際土壤微生物群落多樣性指數與土壤酶活相關性分析Tab.2 Correlation analysis between rhizosphere soil microbial community diversity index and soil enzyme activity

采用RDA（Redundancy analysis）冗余分析對環境因子、樣本之間進行研究，環境因子與細菌與真菌群落組成在相關分析見圖2、3，箭頭表示環境因子，排序軸與箭頭連線夾角表示環境因子與排序軸的相關性，夾角越小表明關系越密切，而箭頭連線表示環境因子與研究對象相關程度的大小，箭頭越長表示環境因子對樣本分布的影響越大，如圖2 所示，第一主坐標軸對土壤細菌變化解釋達86.80%，第二主坐標軸對土壤細菌變化解釋達9.45%，共解釋了細菌96.25%的變異。如圖3 所示，第一主坐標軸對土壤真菌變化解釋達57.27%，第二主坐標軸對土壤真菌變化解釋達27.64%，共解釋了真菌84.91%的變異。因此，硝酸還原酶是微生物多樣性變化的主要因子，且均與T3樣本關系密切。

圖2 土壤細菌群落RDA分析Fig.2 RDA analysis map of soil bacterial community

圖3 土壤真菌群落RDA分析Fig.3 RDA analysis map of soil fungal community

3 討論

3.1 石墨烯對杉木幼苗根際土壤酶活性的影響

土壤酶作為土壤生態系統中重要的組成部分，對土壤的能量轉換和物質循環起著重要的作用，通常是衡量外來物質對土壤生物活性影響的重要指標之一[24]。石墨烯作為一種新型的碳納米材料，具有較大的比表面積、易溶于水等特點，對土壤中的養分離子有較強的吸附性，能減少土壤因降水、灌溉導致的淋溶損失，具有保肥作用[25]。試驗中添加20 mg/L石墨烯處理有利于脲酶活性提升，這與段成偉等[26]發現低濃度的石墨烯能夠增加東北暗棕壤的脲酶活性研究結果相似。脲酶能夠促進尿素水解NH4+，成為植物可以利用的有效氮[27]，是土壤微生物氮源的重要來源，對促進土壤氮素循環有重要意義。以往研究報道，脲酶活性與微生物數量、有機質含量呈正相關，碳源的加入可促進土壤中微生物活性，繼而提升脲酶活性[25]。因此推測石墨烯的施用活化了土壤的肥力與養分，為土壤微生物的生存提供了有利的環境，從而導致了脲酶活性的增加。谷氨酰胺酶是控制氮代謝的酶，其活性的提高既可以增強氮代謝運轉，又可以促進氨基酸的合成[28]，氨基酸可作為氮源在微生物代謝過程中轉化為植物生長調節劑以促進植物生長[1]。本研究中20 mg/L 石墨烯處理下谷氨酰胺酶活性提升，但3 種石墨烯處理均與對照差異不顯著，說明土壤谷氨酰胺酶活性對石墨烯濃度響應不敏感。硝酸還原酶、亞硝酸還原酶是土壤反硝化過程中2種重要的反硝化酶，其活性表征土壤反硝化能力。本試驗中20 mg/L 濃度石墨烯處理下2 種反硝化酶均高于對照組，其中硝酸還原酶達顯著性差異，這與相關研究報道石墨烯溶液能夠提高朝天椒根區土壤硝酸還原酶活性[17]研究結果相似。硝酸還原酶是催化NO-

3轉化為NO-2的專性酶，其活性主要受土壤溫度、pH、有機質的影響[27]，楊士等[29]研究表明生物炭負載氧化石墨烯能夠提升土壤中的pH 值，蔣月喜[17]等研究表明石墨烯能夠提高土壤中的有機質含量，對土壤pH 有一定的調節作用，有機質能夠激活土壤中硝酸還原酶的活性[30]，這可能是本研究中硝酸還原酶活性增加的原因。土壤亞硝酸還原酶主要作用是催化NO-2還原成NH2OH，為將NH2OH催化還原為植物可吸收的氮素（NH4+）的反應提供充足的反應底物[31]，一方面20 mg/L石墨烯處理促使硝酸還原酶活性的提高，充足的NO-2有利于亞硝酸還原酶催化反應的進行，另一方面反硝化酶的生成主要受反硝化微生物的調控[30]，適宜濃度的石墨烯可能有利于某些反硝化微生物的生存，因此提高了亞硝酸還原酶的活性。上述結果表明，20 mg/L 的石墨烯在一定程度上可促進土壤脲酶、谷氨酰胺酶、硝酸還原酶、亞硝酸還原酶活性，提高杉木幼苗對氮素的吸收利用。

3.2 石墨烯對杉木幼苗根際土壤微生物多樣性的影響

外源石墨烯可以進入生物細胞，釋放金屬離子，吸附污染物，間接或直接地對土壤微生物產生影響[32-33]，土壤中的微生物分解、釋放土壤中的營養元素向植物遷移，繼而影響植物生長，已有研究相繼證實了這一點[17,34]。本研究結果表現為微生物多樣性隨著石墨烯濃度的增加呈先升高后降低的變化規律，20 mg/L，25 mg/L石墨烯顯著提升了真菌的豐富度及常見物種的優勢度，20 mg/L石墨烯處理下土壤微生物多樣性指數達到最高。土壤微生物多樣性影響土壤生態系統的結構和功能，與土壤養分之間相互作用，維持穩定的土壤微生物多樣性，能夠提高林地生產力，增強抗病原菌的能力，有利于植物生長發育[35]。Rong 等[36]將石墨烯及其氧化物施加在4 種不同類型土壤中發現土壤微生物多樣性得到提升。Du等[37]報道石墨烯不僅提升了土壤中細菌的種類和多樣性，并且使一些固氮的細菌在屬水平上富集。Ru等[38]研究表明氧化石墨烯通過影響土壤的關鍵性質（土壤pH、有機質、脲酶）提升微生物多樣性。因此推測土壤理化性質和酶活性的改變可能是本試驗土壤微生物多樣性提升的原因之一。但值得注意的是，隨著濃度的提高，4種酶活性和微生物多樣性反而降低，當濃度達到30 mg/L，酶活性甚至低于對照組，說明石墨烯對土壤酶活與微生物多樣性促進作用存在濃度效應。多數研究也表明，過量的納米材料的添加會對土壤產生毒害，這可能是本研究酶活與微生物多樣性在30 mg/L 時顯現下降的原因。此外，相關性及RDA分析指出，脲酶與硝酸還原酶與微生物多樣性指數呈顯著或極顯著正相關，有研究表明參與土壤碳氮循環的微生物對納米材料較敏感，可能由于石墨烯的添加有利于某些參與碳氮循環的微生物生存，使土壤酶活性與微生物多樣性變化趨勢一致，但影響機制較復雜，還需進一步研究。

4 結論

20 mg/L 濃度石墨烯提升了杉木幼苗根際土壤脲酶、谷氨酰胺酶、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性分別較對照提高了2.65%～59.32%，其中尤以硝酸還原酶活性提升最為顯著。20 mg/L，25 mg/L 濃度石墨烯提升了土壤微生物多樣性，較細菌多樣性而言，石墨烯對真菌多樣性的影響更加顯著，脲酶與硝酸還原酶與微生物多樣性指數呈顯著或極顯著正相關。

綜合土壤酶活性和微生物多樣性指標，本研究條件下20 mg/L 石墨烯濃度是適合杉木優良無性系洋061 生長的最佳濃度。該處理下通過提高杉木幼苗根際土壤參與氮代謝相關的酶活性和土壤微生物群落多樣性，促進養分的周轉，提高植物對養分的吸收利用，從而最終促進植物的生長。本結論也印證了課題組在前期研究得到20 mg/L，25 mg/L 石墨烯能夠利于杉木幼苗養分積累、根系生長及氮素吸收利用[21-22]的結果。