不同花色紫薇花瓣的花色苷化合物組分及含量比較

馬曉華, 陳春青, 葉勝忠, 錢仁卷, 鄭 堅, 張旭樂

(1.浙江省亞熱帶作物研究所,浙江 溫州 325005;2.溫州市資源植物創新利用實驗室,浙江 溫州 325005;3.平陽縣林業技術推廣指導和森林資源保護站,浙江 平陽 325400;4.永嘉縣森林病蟲害防治中心,浙江 永嘉 325100)

花色是觀賞植物的重要性狀之一,是植物自然進化過程中最具適應意義的表型性狀。豐富的花色不僅可以吸引傳粉者幫助植物授粉繁殖,也賦予植物多姿多彩的外在表型以滿足人類的視覺欣賞需求[1-2]?；ㄉ厥菢嫵芍参锘ㄉ闹匾镔|基礎,其成分與含量差異直接影響花的呈色現象[3]。植物花色素主要分為甜菜素、類胡蘿卜素和類黃酮三大類。其中,類黃酮是形成豐富花色的決定性色素群[4]?；ㄉ帐穷慄S酮化合物的主要組成部分,是決定花色的主要色素群,廣泛存在于紅色、藍色、紫色的植物花瓣中[5]?；ò觑@示出的顏色不僅與花色苷種類密切相關,而且與其含量也密不可分[6]。在花色苷種類與比例相似情況下,總含量不同也會使花色有差異[7]。飛燕草素、矢車菊素、芍藥花素、錦葵素、天竺葵素及矮牽牛素等均是自然界中最常見的花色苷[8]。

紫薇(Lagerstroemiaindica)是中國的傳統花卉之一,也是園林造景中應用最為廣泛的景觀植物之一[9]。常見的紫薇花色主要包含鮮紅、深紅、粉紅、紫色及白色等,以紅色系為主。林啟芳等[10]研究發現,類黃酮代謝途徑中產物的積累差異是導致黃薇屬與紫薇屬植物花色差異的主要原因,但關于紫薇屬植物不同花色的成因仍需進一步探索。因此,為明確不同色系紫薇花瓣中花色苷化合物種類及含量,本研究以不同色系的紫薇花瓣為研究材料,采用超高效液相色譜—串聯質譜(ultra high performanc eliquid chromatography-mass spectrometer, UPLC-MS/MS)技術對花瓣中的花色苷化合物進行廣泛靶向代謝物定性定量分析,并通過主成分分析(PCA)探明不同花色間的差異,以期為紫薇花色的定向改良及特色新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與花色比對

參試的紫薇包括:‘屋久島’紫薇(L.fauriei)、‘蘇森’(L.indica‘SIOUX’)、‘喬克托’(L.indica‘CHOCTAW’)、‘美國紅火箭’(L.indica‘Red rocket’)、‘紫葉丹紅’(L.indica‘Ebony Embers’)和‘四川大日紅’(L.indica)(圖1)。使用英國皇家園藝學會比色卡(royal horticultural society color card, RHSCC)初步鑒定紫薇花色。在光源充足(非直射光)條件下,對每種紫薇花色比對10次,出現頻率最高的花瓣顏色視為花色表型結果[11]。

L1.‘屋久島’;L2.‘蘇森’;L3.‘喬克托’;L4.‘美國紅火箭’;L5.‘紫葉丹紅’;L6.‘四川大日紅’。圖1 參試的不同花色紫薇Figure 1 L.indica varieties with different petal colors tested

1.2 花色苷的提取與分析

1.2.1 提取 2021年8月中旬,于溫州市景山紫薇苗圃基地(28°23′N,120°72′E)采摘盛花期的紫薇花朵。每個參試紫薇取3個生物重復。經液氮速凍后,將紫薇花朵保存在-80 ℃冰箱。將冷凍后的紫薇花瓣研磨至粉末狀,每份稱取0.05 g,加 4 mL體積分數為70%的甲醇溶液后搖晃30 s,渦旋2 min,之后超聲波震蕩30 min,然后于4 ℃下避光浸提24 h,其間間或搖晃幾次。 12 000 r·min-1離心 20 min,取1 mL上清液,用0.22 μm微孔濾膜過濾后供上機分析。

1.2.2 組分分析 采用UPLC-MS/MS的方法鑒定紫薇花瓣所含花色苷成分。參照 Li et al[12]的方法,UPLC分析條件如下:色譜柱為Acquity UPLC HSS T3 C18型(1.8孔徑,2.1 mm×100 mm);柱溫45 ℃,流速0.4 mL·min-1,進樣體積2 μL;流動相的A液為體積分數為0.1%甲酸溶液,B液為含0.1%甲酸的乙腈(體積比為99.9∶0.1)。洗脫程序梯度:0 min,水/乙腈(體積比為95︰5);3 min,80︰20;10 min,0︰100;12 min,0︰100;15 min,5︰95;19 min,5︰95。質譜條件為:電噴霧離子源溫度為550 ℃,正離子模式下質譜電壓為5 500 V,氣簾氣為241.325 kPa。根據優化后的去簇電壓和碰撞能掃描檢測每個離子對,并基于由標準品構建的MWDB數據庫(Metware database)對質譜檢測數據進行定性分析。

1.2.3 含量測定 參考Wang et al[13]的方法對花色苷進行定量分析。采用超高效液相色譜—四級桿飛行時間質譜聯用儀(UPLC-Q-TOF-MS) 分析花色苷各組分的相對含量,用MultiaQuant軟件進行色譜峰的積分和校正,計算各色譜峰的峰面積內對應物質。

1.3 數據處理

使用Excel 2013和SPSS 19.0軟件,對紫薇花色苷含量進行數據統計與單因素方差分析,并繪制主成分分析圖;利用GraphPad 8軟件和MetaboAnalyst,繪制聚類分析圖與柱狀圖[14]。

2 結果與分析

2.1 參試紫薇的花色表型比較

根據比色卡結果(表1),參試紫薇可分為3個色系,即白色、紅色和紫色。其中,‘屋久島’(L1)為白色系;‘蘇森’‘喬克托’‘美國紅火箭’及‘紫葉丹紅’(L2～L5)均屬紅色系;‘四川大日紅’(L6)則為紫色系(圖1)。

表1 參試紫薇的花色分類Table 1 Petal color classification of L.indica varieties tested

2.2 參試紫薇的花色苷總含量比較

將紫薇花瓣提取液上樣,經UPLC-MS/MS分離鑒定表明,紅色系花瓣總花色苷相對含量顯著高于紫色系、白色系花瓣(圖2)。其中,深紅色‘紫葉丹紅’(L5)的花色苷總含量最高,為7 806.33 μg·g-1,顯著高于L1、L2和L6;白色的L1最低,為1 125.91 μg·g-1。6個品種花色苷總含量依次為:‘紫葉丹紅’(L5)>‘喬克托’(L3)>‘美國紅火箭’(L4)>‘蘇森’(L2)>‘四川大日紅’(L6)>‘屋久島’(L1)。

L1.‘屋久島’;L2.‘蘇森’;L3.‘喬克托’;L4.‘美國紅火箭’;L5.‘紫葉丹紅’;L6.‘四川大日紅’。不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。圖2 不同花色紫薇花瓣的花色苷總含量比較Figure 2 Comparison of total anthocyanins in L.indica petals with different colors

花色苷按照不同化合物結構分為8類(表2)。其中,白色系紫薇以黃酮類、矢車菊素類及錦葵色素類化合物為主,分別占花色苷總含量的58.16%、26.45%及7.49%;在紅色系中,L2與L3所含錦葵色素類化合物比例較高,分別達31.15%和38.49%,而L4、L5與L6主要以飛燕草素類化合物為主,分別占35.01%、45.32%和34.69%。

表2 不同花色紫薇花色苷化合物占花色苷總含量的百分比Table 2 Proportions of different anthocyanin components in L.indica petals with different colors

2.3 參試紫薇花色苷化合物含量聚類熱圖分析

為更好地比較參試紫薇各單體花色苷組分的積累差異,將鑒定出的59種化合物進行聚類熱圖分析。如圖3所示,基于各單體花色苷化合物含量,可將不同色系樣品分為2類,即白色系‘屋久島’紫薇以及屬于紅色系、紫色系的其他5個品種。其中,L2和L6、L3和L6均出現聚集情況,說明具有較為相似的花色苷積累模式。此外,大多數單體花色苷化合物以結合糖苷的形式存在。按照花色苷化合物含量的高低,可將其分為3組。第1組包含12種花色苷化合物,分別為:芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、芍藥花素-3-O-葡萄糖苷、二氫楊梅黃酮、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、蘆丁、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和錦葵色素-3-O-葡萄糖苷,在6個紫薇品種中均被檢測到且含量較高;第2組中,L5單體花色苷含量高于其他品種;第3組鑒定出的化合物在6個品種花瓣中均為痕量存在。

2.4 參試紫薇花色苷化合物主成分分析

為進一步明確不同花色紫薇花瓣中的主要花色苷化合物,將檢測得到的59種花色苷化合物進行主成分分析(圖4)。以第1主成分(貢獻率67.5%)、第2主成分(貢獻率為25.1%)繪制二維散點圖及主成分因子載荷圖(圖4A)。篩選出12種主要花色苷化合物,分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、芍藥花素-3-O-葡萄糖苷、芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷、二氫楊梅黃酮、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(異槲皮苷)、蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷。同時以該12種花色苷化合物為主成分,可將6個參試品種分為2個類群,即白色系‘屋久島’(L1-1,L1-2,L1-3)及其他品種(圖4B)。

2.5 參試紫薇主要花色苷化合物的含量差異比較

為進一步明確不同花色紫薇的主要花色苷化合物含量差異,選取12種主要成分進行比較。如圖5B、5L所示,在紅色系品種中,隨著花瓣顏色加深,飛燕草素-3-O-葡萄糖苷及山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量逐漸增加,且在L5中含量最高,分別達3 416.80、69.26 μg·g-1;而矢車菊素-3-O-葡萄糖苷及2種芍藥花素類化合物(芍藥花素-3-O-葡萄糖苷和芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷)則在L4中最大(圖5A、5E、5F)。在圖5C、5D、5G、5H中,白色系L1中含有少量的錦葵色素類化合物(錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷)及痕量的矮牽牛素類化合物(矮牽牛素-3-O-半乳糖苷和矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷)。由圖5J可見,紅色系L2中槲皮素-3-O葡萄糖苷含量顯著高于其他紫薇品種。6個品種花瓣的矮牽牛素類化合物積累模式相同(圖5G、5H)。

L1.‘屋久島’;L2.‘蘇森’;L3.‘喬克托’;L4.‘美國紅火箭’;L5.‘紫葉丹紅’;L6.‘四川大日紅’。A.矢車菊素-3-O-芍藥糖苷;B.飛燕草素-3-O-葡萄糖苷;C.錦葵色素-3-O-葡萄糖苷;D.錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷;E.芍藥花素-3-O-葡萄糖苷;F.芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷;G.矮牽牛素-3-O-半乳糖苷;H.矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷;I.二氫楊梅黃酮;J.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;K.蘆丁;L.山柰酚-3-O-蕓香糖苷。不同小寫字母表示差異達0.05顯著水平。圖5 不同花色紫薇花瓣的主要花色苷化合物含量比較Figure 5 Comparison of main anthocyanin components in L.indica petals with different colors

3 討論與結論

本研究選取的6個紫薇品種分為白色系、紅色系與紫色系(圖1),共在花瓣中檢測出59種花色苷化合物。其中,紅色系花色苷總含量最高,紫色系次之,白色系最低,說明深色系紫薇中花色苷總含量高于淺色系紫薇。這與張潔[15]對不同顏色的12種美國紫薇及5種中國紫薇的研究結果相似,即白色系紫薇中花色苷總含量顯著低于其他色系?；ò觑@示出的顏色不僅與花色苷種類密切相關,與花色苷含量、比例也密不可分[16-17]。已有研究表明,飛燕草素類化合物多使花瓣呈現藍紫色,錦葵素類化合物多呈現淡紫色,矢車菊素類化合物多呈現艷紅色,芍藥素類化合物多呈現橘紅色,而天竺葵素類化合物多呈現深紅色[18-20]。本研究發現,白色系紫薇以黃酮類化合物為主,占花色苷總含量的58.16%;在紅色系中,‘蘇森’與‘喬克托’所含錦葵素類化合物比例較高,而‘美國紅火箭’‘紫葉丹紅’與‘四川大日紅’以飛燕草素類化合物為主,分別占35.01%、45.32%和34.69%。以上表明,不同紫薇品種的花色苷成分與其顯示出的花色基本相同,且花色苷種類及含量差異是形成不同花色的原因之一。這與玉蘭(Magnoliadenudata)[21]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[22]中的研究結果相似,表明花色苷種類及含量影響花色。錦葵色素與矮牽牛素類化合物是花瓣顯示紅色的重要組分之一,且隨著兩者含量的增加,花瓣顏色也隨之加深。

本研究對紫薇花瓣的59種花色苷化合物進行聚類分析發現,參試紫薇主要分為2組,即白色系‘屋久島’以及屬于紅色系、紫色系的其他5個品種,其中‘蘇森’和‘四川大日紅’、‘喬克托’和‘四川大日紅’(圖3)均出現聚集情況。進一步進行主成分分析表明,錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷和錦葵色素-3-O-葡萄糖苷等在內的12種花色苷化合物是紫薇花瓣中的主要花色苷化合物?！畣炭送小绹t火箭’和‘紫葉丹紅’紅色紫薇花瓣中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥花素-3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖苷等顯著高于其他紫薇品種,是由于紫薇花色苷合成途徑中間產物與終產物含量差異所致[23]?！菥脥u’紫薇花瓣白色可能與飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和錦葵色素-3, 5-O-二葡萄糖苷較低有關,推測不同品種紫薇花瓣生物合成花色苷的過程存在差異[24-25]。

綜上所述,6個紫薇品種花瓣中共檢測出59種花色苷化合物,花色表型分別為白色系、紅色系和紫色系;根據各單體花色苷化合物含量,可將不同色系樣品分為2類,即白色系‘屋久島’紫薇以及屬于紅色系、紫色系的其他5個品種。其中,紅色系紫薇花瓣中花色苷總含量較高,以錦葵色素類與矮牽牛素類物質為主,紫色系紫薇花色苷含量次于紅色系,以飛燕草素類化合物為主要呈色物質,而白色系紫薇花瓣中花色苷含量較低,以黃酮類化合物為主。本研究結果可為進一步解析紫薇花瓣花色苷生理生化機制與種質資源的定向改良提供初步的理論依據。