金線蘭莖腐病的病原菌鑒定與防治藥劑的篩選

葉 煒, 顏沛沛, 王培育, 羅維鴻, 林敏水, 沈紹榕, 江金蘭

[1.福建省(山區)作物遺傳改良與創新利用重點實驗室,福建 三明 365509;2.三明市農業科學研究院藥用植物研究所,福建 三明 365509;3.福建農林大學園藝植物生物工程研究所,福建 福州 350002;4.永安市林業局,福建 永安 366038;5.永安市黃泥家有限責任公司,福建 永安 366038]

金線蓮(Anoectochiumroxburghii)為蘭科(Orchid)花葉開唇蘭屬(Anoectochilus)金線蘭(A.roxborghil)及其近緣種植物的統稱,為多年生草本植物[1],在福建民間為傳統用藥,有“藥王”之稱[2]。金線蘭及其近緣種植物廣泛分布于我國南部,全世界約有40余種,我國有20種2變種,種質資源較為豐富[3-4]。由于野生金線蓮價值高昂,我國不同地區的金線蓮野生資源已被嚴重破壞,是國家二級保護植物。金線蓮在我國已有30多年的栽培歷史[5-6]。為提高金線蓮苷、多糖、總黃酮、總酚以及生物堿等有效成分的含量,金線蓮需經4～6個月的移栽[7-10]。由于金線蓮喜冷涼、陰濕的環境,栽培過程中極易受到莖腐病的影響。目前,莖腐病抗病品種的選育與高效防治技術研發仍較缺乏,開展金線蓮莖腐病抗性育種及高效防治技術研究有重要的現實意義。

現已知尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是金線蓮莖腐病致病菌。該菌遺傳多樣性豐富,可為害多種作物,是研究最為密集的病原菌之一[11-13]。目前雖有少數金線蓮莖腐病的病原物鑒定與防治方法的報道,但該病仍是金線蓮規?；N植的主要威脅[11-13]。福建永安是我國金線蓮的中心產區,素有“中國金線蓮之鄉”的美稱,而莖腐病高發是阻礙金線蓮產業推廣普及的主要因素。鑒定莖腐病的主要致病菌,分析不同種蘭科植物的抗病性以及該致病菌的防治措施將有利于金線蓮莖腐病抗性育種及高效防治的開展。本研究在前人工作的基礎上,分離鑒定永安金線蓮產區尖孢鐮刀菌莖腐病致病菌,開展其在5個金線蓮栽培種以及其他蘭科植物上的致病性分析,測定8種防治藥劑對病菌的平板抑菌效果,以期為金線蓮莖腐病抗性育種及高效防治提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣 金線蘭[A.roxborghil(wall.) Lindl ]莖腐病植株于2021年8月取自永安市上坪鄉七寶農林省級專業合作社種植基地,海拔約1 100 m。

1.1.2 蘭科植物種質 金線蓮栽培種:福建小圓葉(1#)、紅霞(56#)、福建尖葉(16#)、滇南開唇蘭(A.burmannicusRolfe)(43#)、臺灣銀線蘭(A.formosanusHayata)(21#),鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)(17C-1),姬蝴蝶蘭[Phalaenopsisequestris (Schauer) Rchb. f.]及墨蘭[Cymbidiumsinense(Jackson ex Andr.) Willd.],均保存于三明市農業科學研究院藥用植物研究所。

1.1.3 供試藥劑 化學藥劑分別為:甲霜·惡霉靈水劑(江西正邦作物保護股份有限公司,含甲霜靈6%、惡霉靈25%);咪鮮胺水乳劑[上海滬聯生物藥業(夏邑),含45%咪鮮胺];氟硅唑乳油(山東省青島瀚生生物科技股份有限公司,含40%氟硅唑);多抗·戊唑醇可濕性粉劑(陜西美邦藥業集團股份有限公司,含10%多抗霉素、10%戊唑醇);代森錳鋅可濕性粉劑(湖南農大海特農化有限公司,含80%代森錳鋅);苯甲醚甲環唑水分散粉劑(先正達南通作物保護有限公司,含10%苯甲醚甲環唑);精甲·咯菌腈懸浮種衣劑(先正達南通作物保護有限公司,含3.75%精甲霜靈、2.5%咯菌腈);苯甲·嘧菌脂懸浮劑(先正達南通作物保護有限公司,含12.5%苯醚甲環唑,20%嘧菌脂)。以上試劑分別用無菌水稀釋為1 250倍液、2 500倍液和5 000倍液備用。

1.2 方法

1.2.1 金線蘭莖腐病病原菌分離與純化 采用組織分離法。切取病植株病健交界的組織塊接種于針刺造傷的無菌金線蓮莖段或葉片上,然后置于潤濕的無菌濾紙,于25 ℃、14 h·d-1光照條件下培養5～7 d。葉片發病后,再取病葉病健交界的組織塊接種于PDA培養基,置于25 ℃下培養5～7 d,之后挑取邊緣菌絲進行2～3次純化繼代,直至獲取性狀穩定的純化菌株。金線蓮無菌苗誘導與繼代方法見羅慶國等[14]的方法。

1.2.2 金線蘭莖腐病病原菌形態學觀察 參照王培育等[15]的方法。將純化菌株培養7 d后,挑取菌塊于顯微鏡(Olympus BX53)10倍與40倍物鏡下拍照。利用血小板計數器計算孢子濃度。

1.2.3 金線蘭莖腐病病原菌分子鑒定 參照文獻[15],利用CTAB法提取純化后的菌株總DNA。參照文獻[16],利用真菌通用ITS引物ITS1(5′-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行 PCR 擴增。參照文獻[17],利用多肽鏈延伸因子EF-1α(elongation factor-1α)基因序列引物EF1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)和EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)進行PCR擴增。20 μL PCR反應體系為: 2×Taq預混液10 μL,10 μmol·L-1上下游引物各1 μL,1 μL菌株DNA,雙蒸水補至20 μL。PCR反應條件: 94 ℃預變性5 min; 95 ℃變性20 s, 根據引物溫度退火20 s, 72 ℃延伸30 s,設40個循環;最后72 ℃延伸6 min。 1%瓊脂糖電泳,回收500 bp左右條帶,送鉑尚生物技術有限公司測序。 利用GenBank數據庫比對測序結果。

利用MEGA 6.0軟件,以已知鐮刀菌的ITS序列及EF-1α序列為參照,分別采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構建進化樹。參比的ITS序列包括尖孢鐮刀菌:FLR11(MK370694.1)、WZ-248(MN856369.1)、WZ-175(MN856309.1)和MR2934(MN709613.1);木賊鐮刀菌(F.equiseti):NX2-1(MK764999.1);朗氏鐮刀菌(F.langsethiae):CBS 113234(NR_121214.1);茄鐮刀菌(F.solani):CBS 140079(NR_163531.1);禾谷鐮刀菌(F.graminearum):SN34(MH782580.1)。參比的EF-1α序列包括尖孢鐮刀菌西瓜?；?(F.oxysporumf.sp.niveum):150523(MN689546);尖孢鐮孢菌芝麻?；?F.oxysporumf.sp.sesami):FS11719a(MN417191);尖孢鐮刀菌番茄?；?F.oxysporumf.sp.lycopersici):F79(KC831768)、F41(MH587166);F.oxysporumf.sp.opuntiarum:FuO319(KC196120)、DB18AGO01(MT450439);輪枝鐮孢菌(F.verticillioides):FVB8(KC599244)、 K311(KF562131);層出鐮刀菌(F.proliferatu):DI19(KF993985)、259(KC584812);亞粘團鐮孢菌(F.subglutinan):OS12(JX867944);禾谷鐮刀菌:CBS130959(JX118859)。

1.2.4 尖孢鐮刀菌致病性分析 參照文獻[15],用4 mm打孔器取培養7 d的病原菌平板菌落的邊緣菌塊,用無菌水配置孢子濃度為0.9×109個·mL-1的菌液。吸取2 μL接種于針刺或不針刺葉片表面,置于25 ℃、14 h·d-1光照條件下培養5～7 d后觀察拍照。根據病斑與葉面積比值計算病情指數,按10%～100%分為1～10級。試驗設3次重復。

1.2.5 尖孢鐮刀菌防治藥劑篩選 參照文獻[18],用4 mm打孔器取培養7 d的病原菌平板菌落的邊緣菌塊接種于PDA平板中央。利用4 mm打孔器以十字交叉法打孔平板,每孔分別注射化學藥劑1 250倍液、2 500倍液、5 000倍液各50 μL,以無菌水為對照,3次重復。培養7 d后,根據抑菌圈大小計算抑制率。

2 結果與分析

2.1 金線蘭莖腐病病原物的分離純化

于永安市上坪鄉獲得1株金線蘭莖腐病發病植株。病株葉片褐化萎蔫,布滿黃白色菌絲,植株莖部水漬化,嚴重時僅余葉鞘(圖1)。于無菌條件下剪取發病植株病健結合部位的組織塊2～3 mm2,接種于針刺創傷無菌葉片與莖部表面。接種7 d后可見接種部位水漬狀褐化,發病癥狀與田間一致。葉片接種部位呈現水漬狀褐化并生長出放射狀菌絲(圖2A),莖部從接種部位開始呈水漬狀褐化并上下漫延,可致全株干枯(圖2B)。將無菌葉片病健結合部位的組織塊置于PDA培養基,經2～3次純化培養獲得ASP01菌株。

A.葉部;B.莖部。圖1 金線蘭莖腐病發病株癥狀Figure 1 Symptoms of A.roxborghil stem rot

A、C為接種0 d;B、D為接種7 d。 圖2 金線蘭莖腐病組織接種的發病癥狀Figure 2 Symptoms of A.roxborghil inoculated with stem rot tissue

2.2 金線蘭莖腐病病原物菌株的鑒定

2.2.1 形態學特征 ASP01菌株接種7 d后,白色絮狀致密菌絲布滿6 cm PDA平板(圖3A、3B)。菌落呈突起狀,紫紅色(圖3A、3B)。菌絲寬2～6 μm,布滿油狀微粒(圖3C)。產孢細胞單生呈瓶狀(圖3C),小型分生孢子著生于單生瓶梗上(圖3D),單胞,長卵圓形,無隔膜,長2～8 μm,寬2～3 μm(圖3E),在瓶梗頂端聚成團狀(圖3D);大型分生孢子鐮刀形,呈雙生聚集于單生瓶梗上(圖3D),少許彎曲,具隔膜,多為3隔,長25～30 μm,寬3～5 μm(圖3F);厚垣孢子尖生或頂生,球形,表面光滑無突起,直徑4～7 μm(圖3C)。

A.菌落正面(7 d);B.菌落背面(7 d);C.菌絲、厚垣孢子及產孢細胞;D.小型分生孢子及大型分生孢子的著生形態;E.小型分生孢子;F.大型分生孢子與小型分生孢子。線段代表20 μm。圖3 ASP01菌株的形態特征Figure 3 Morphological characteristics of strain ASP01

2.2.2 分子鑒定 用真菌ITS序列的通用引物進行PCR擴增并測序,獲得該菌株的ITS序列長度為525 bp,登錄號為ON055851.1。通過與已知鐮刀菌屬菌株ITS序列構建進化樹可見,ASP01與尖孢鐮刀菌菌株聚為一類,而與木賊鐮刀菌、朗氏鐮刀菌、茄鐮刀菌及禾谷鐮刀菌的遺傳距離較遠(圖4)。

圖4 ASP01菌株的ITS序列進化樹Figure 4 Phylogenetic tree of strain ASP01 based on ITS sequences

用EF-1α序列引物進行PCR擴增并測序,獲得該菌株的EF-1α序列長度為689 bp,登錄號為OQ632817。通過與已知鐮刀菌屬EF-1α序列構建進化樹可見,ASP01與F.oxysporumf.sp.opuntiarum聚為一類,且與尖孢鐮刀菌其他?；瓦z傳距離較近,而與鐮刀菌其他種的遺傳距離較遠(圖5)。

圖5 ASP01菌株的EF-1α序列進化樹Figure 5 Phylogenetic tree of strain ASP01 based on EF-1α sequences

綜上所述,將ASP01菌株鑒定為尖孢鐮刀菌。

2.3 金線蘭莖腐病病原物的致病性分析

2.3.1 不同接種方式對ASP01致病力的影響 針刺造傷與無針刺造傷對APS01致病性的影響見圖6。從圖6可見,接種7 d后,無針刺造傷葉片未表現病癥,而針刺造傷葉片表現出明顯的水漬化與葉片失綠,接種無菌水的葉片均不發病(圖6)。以上表明,物理創口加速尖孢鐮刀菌對葉部的感染。

圖6 不同接種方法下ASP01菌株的致病性Figure 6 Pathogenicity of APS01 with different inoculation methods

2.3.2 ASP01對不同金線蓮種質的致病性差異 為比較ASP01對不同金線蓮種質的致病性差異,使用不同種質金線蓮無菌葉片接種ASP01孢子液,以接種無菌水為對照。接種7 d后可見,ASP01對所有參試金線蓮種質致病(圖7)。其中,滇南開唇蘭、福建小圓葉、紅霞病情指數較高,分別為10.00、9.95和4.69,而福建尖葉與臺灣銀線蘭病情指數較低,分別為0.95和0.72(表1)。

表1 ASP01對金線蓮種質的病情指數比較Table 1 Disease index of different A.roxburghii germplasms inoculated with APS01

2.3.3 ASP01對不同蘭科種質的致病性差異 為進一步了解ASP01對蘭科其他植物的致病情況,在鐵皮石斛、姬蝴蝶蘭以及墨蘭無菌葉片上接種ASP01菌液,以接種無菌水為對照。接種7 d后(表2),鐵皮石斛及墨蘭的接種點無明顯擴展,表現較強抗性,但姬蝴蝶蘭則以接種點為中心呈水漬化擴散,表明ASP01可侵染姬蝴蝶蘭(圖8)。

表2 ASP01對蘭科種質的病情指數比較Table 2 Disease index of different orchid germplasms inoculated with ASP01

圖8 ASP01對蘭科種質的致病性Figure 8 Pathogenicity of APS01 to different orchid germplasms

2.4 金線蘭莖腐病病原物的防治藥劑篩選

8種藥劑對ASP01菌株生長的抑制效果見表3。咪鮮胺水乳劑抑制效果最佳,當稀釋倍數為5 000倍時,其抑菌率可達93.83%,當稀釋倍數為2 500倍時,抑菌率可達100.00%(表3、圖9B)。氟硅唑乳油抑菌效果僅次于咪鮮胺,當稀釋倍數為1 250倍時,抑菌率可達87.65%(圖9C)。精甲·咯菌腈懸浮種衣劑、苯甲醚甲環唑水分散粉劑、苯甲·嘧菌脂懸浮劑在稀釋濃度為1 250倍時,抑菌率可達75.31%～80.25%,當濃度下降時其抑菌效果也顯著下降(圖9F～9H)。甲霜·惡霉靈水劑、多抗·戊唑醇可濕性粉劑以及代森錳鋅可濕性粉劑對ASP01生長抑制效果效差(圖9A、9D、9E),在1 250倍稀釋倍數下,其抑菌率僅在9.88%～22.22%之間。

表3 不同藥劑對ASP01菌株的抑菌效果1)Table 3 Inhibition effect of different fungicides on ASP01

A.甲霜·惡霉靈水劑;B.咪鮮胺水乳劑;C.氟硅唑乳油;D.多抗·戊唑醇可濕性粉劑;E.代森錳鋅可濕性粉劑;F.苯甲醚甲環唑水分散粉劑;G.精甲·咯菌腈懸浮種衣劑;H.苯甲·嘧菌脂懸浮劑;I.無菌水(對照)。以上十字交叉孔按逆時針從3點鐘方向依次注入0、5 000倍、2 500倍及1 250倍藥劑。圖9 不同藥劑對ASP01菌株的抑菌效果Figure 9 Inhibition effect of different fungicides on ASP01

3 討論

莖腐病是金線蓮種植中最為常見的病害之一,發病速度快、范圍大,在防治上具有較大的難度[12]。在種植的全過程均可見該病的發生,但種植初期及種植5～6個月后發生率較高。尤其是種植初期,因出瓶、洗苗等一系列操作極易造成幼苗機械損傷,從而使該病高發。趙云青等[12]與路梅等[11]分別分離了金線蓮莖腐病致病菌株尖孢鐮刀菌,ASP01的形態特征與致病表現與前者較為接近,表現為接種5～7 d可見莖部發病,進而導致全株萎蔫水漬化。本試驗中,利用發病株組織塊接種無菌植株,從而快速分離得到莖腐病致病菌株ASP01。此方法可快速排除非致病菌的干擾,有效減少分離致病菌株的工作量,已在文心蘭軟腐病[18]與褐斑病[15]的分離中得到應用。尖孢鐮刀菌是研究最為密集的地下真菌病原物之一,可通過其自身的一系列酶促作用降解植物細胞壁而進入植物體內。最常見的方式為該真菌通過根尖、根毛、伸長區以及缺口進入根表皮層后,通過細胞間隙進入維管組織。這個過程因植株本身的抗性不同而長短不一,最快2 d可到達細胞間隙,而具有抗性的植物在侵入位點可產生木質化或木栓化的細胞壁,到達根皮層需要8 d或者更長,并在到達維管組織前受到抑制[19-20]。本試驗中,ASP01菌株可快速侵入具有機械損傷的葉片部位,而沒有機械損傷的葉片則表現為不發病或者發病期延長至7 d以上。因此,在種植過程中避免蟲害、種植、栽培管理等操作造成機械損傷是防止該病高發的一個重要技術手段。

尖孢鐮刀菌可為害包括金線蓮、香莢蘭(Vanillafragrans)、建蘭(C.ensifolium)、蝴蝶蘭、石斛等多種蘭科植物[11,12,21-25],但不同生理小種對蘭科植物致病性差異較大[22]。通過ITS序列進化樹分析顯示,ASP01菌株與分離自福建三明與龍巖地區的建蘭莖腐病的尖孢C9與C11菌株[23],但與分離自福建松溪與詔安的鐵皮石斛莖腐病FJDO-1菌株遺傳距離較遠[24],表明尖孢鐮刀菌在不同區域與寄主間存在較高的多樣性。通過進一步利用EF-1α序列構建進化樹分析發現, ASP01菌株與F.oxysporumf.sp.opuntiarum?；途蹫橐活?。F.oxysporumf.sp.opuntiarum?；蛢H見報道于意大利的蟹爪蘭(Schlumbergeratruncata)[26]與金琥(Echinocactusgrusonii)[27],國內還未見相關報道,而APS01菌株是否屬于該?；腿杂写谶M一步的鑒定。本研究中,對福建省種植最多的5個金線蓮栽培品種進行了致病性測試,包括親緣關系較遠的滇南開唇蘭與臺灣銀線蘭。致病性測試表明,ASP01菌株對所有參試品種致病,但臺灣銀線蘭與福建尖葉的病情指數相對較低,表明可通過育種來改良金線蓮的抗莖腐病特性。在蘭科其他植物的接種中,鐵皮石斛及墨蘭對ASP01具有較強抗性,表明尖孢鐮刀菌具有一定的?；?這些蘭科植株中存在相應的防御機制。

本研究對ASP01菌株防治藥劑進行篩選表明,咪鮮胺水乳劑、氟硅唑乳油以及精甲·咯菌腈懸浮種衣劑、苯甲·嘧菌脂懸浮劑、苯甲醚甲環唑水分散粉劑均可以達到較好的抑菌效果,而甲霜·惡霉靈水劑、多抗·戊唑醇可濕性粉劑、代森錳鋅可濕性粉劑的抑菌效果差。黃鵬等[25]對建蘭的莖腐病防治表明,咪鮮胺、苯醚甲環唑抑菌效果較好,本研究與該結果較為接近。邵清松等[13]對金線蓮的莖腐病防治表明,戊唑醇乳油效果最佳、其次為腈菌唑和福星乳油,本研究與該結果不同,這可能與所分離獲得的尖孢鐮刀菌生理小種不同有關。