鹽補骨脂對人HK-2、人Hep-G2及豬LLC-PK1的細胞毒性比較分析

王慶濤 高 琛 劉 暢,3 趙紅瓊 郝智慧*

(1.新疆農業大學 動物醫學學院,烏魯木齊 830052;2.中國農業大學 中獸醫藥創新中心,北京 100193;3.青島農業大學 化學與藥學院,山東 青島 266109)

補骨脂又稱為破骨脂,是補骨脂干燥的成熟果實。通常用作驅蟲藥、壯陽藥和止瀉藥,臨床一般用于治療皮膚疾病,如牛皮癬、白皮病、麻風和皮膚炎癥性疾病等[1]。近年來,隨著對補骨脂不斷的深入研究,補骨脂的一些活性成分具有抗炎、增強機體免疫力、抗腫瘤等功效也逐漸被發現[2]。在2015版的《中國藥典》中,有41種含有補骨脂的成方制劑被收錄[3-4],目前,補骨脂被開發形成的中成藥制劑達上百種,在皖西白鵝等動物以及人醫臨床中現已成為常用的補益類中藥,如補腎益腦膠囊、益腎靈顆粒等[5],但是,中國食品藥品監督管理局已發布公告稱,以補骨脂為主要原料生產的如壯骨關節丸、白蝕丸等中成藥可能產生與補骨脂相關的肝損傷等副作用,現已引起國內外研究者和醫生對補骨脂的用藥問題高度關注[6]。目前,利用各種提取方法對補骨脂的活性成分進行提取,共發現了117種活性成分,其中甲基補骨脂黃酮A、補骨脂素、異補骨脂素、異補骨脂定、補骨脂定、補骨脂寧、補骨脂乙素、補骨脂甲素含量較多[7]。研究表明,使用鹽炙對補骨脂進行炮制的方法,有利于有效成分的煎出[8]。然而在一些研究中顯示,補骨脂的主要成分中也具有產生肝腎毒性的物質[7],但是其毒性物質基礎往往是多種有毒成分的集合,其組成成分的化學特性各異,具體的毒性成分不明確,在相關研究中也缺乏主要成分對肝、腎毒性作用差異的比較,不能為后續的藥物開發或臨床應用提供直觀性的參考和建議。

本研究以人腎小管上皮細胞(HK-2)、人肝癌細胞(Hep-G2)以及豬腎細胞(LLC-PK1)為評價模型,對比研究鹽補骨脂水醇提取物及其主要成分甲基補骨脂黃酮A、補骨脂定、異補骨脂定、異補骨脂素、補骨脂素、異補骨脂定、補骨脂寧、補骨脂乙素、補骨脂甲素對HK-2細胞、Hep-G2細胞、LLC-PK1細胞的毒性差異,為后續開展補骨脂或補骨脂有效成分的相關研究提供科學依據,在最大程度發揮其藥理作用的同時,減少其毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與細胞培養

HK-2、LLC-PK1細胞系購于美國ATCC細胞庫、Hep-G2細胞系,購自國家生物醫學實驗細胞資源庫。HK-2細胞在含有體積分數100 U/mL青霉素(PG)、100 mL/L胎牛血清(FBS)、0.1 mg/mL鏈霉素(SM)的DMEM-F12完全培養液中常規培養、LLC-PK1細胞在含有體積分數100 U/mL PG、0.1 mg/mL SM、100 ml/L FBS的DMEM-High Glucose完全培養液中常規培養。Hep-G2細胞在含有體積分數100 U/mL PG、0.1 mg/mL SM和100 ml/L FBS的MEM完全培養液中常規培養。將培養的細胞置于體積分數5%、37 ℃的CO2培養箱中進行培養和傳代培養。

1.2 藥品、試劑與儀器

鹽補骨脂購自中國北京同仁堂有限責任公司。

鹽補骨脂醇提取物:使用體積分數為70%的乙醇對打粉后的鹽補骨脂進行回流提取,加10倍量溶劑,回流提取時間為2 h,使用8層紗布收集濾液,共3次。合并3次醇提取液,經旋轉蒸發儀減壓濃縮,備用。

鹽補骨脂水提物:鹽補骨脂以蒸餾水回流提取,加10倍量水后,浸泡1 h,回流提取3次(間隔時間均為2 h),間隔期間使用8層紗布收集濾液,合并3次水提取液,經旋轉蒸發儀減壓濃縮,備用。

甲基補骨脂黃酮A、補骨脂素、異補骨脂定、異補骨脂素、補骨脂寧、補骨脂定、補骨脂乙素、補骨脂甲素,均購自成都德瑞克生物科技有限公司,HPLC純度均為≥98%;磷酸緩沖液(PBS),購自北京啟研生物科技有限公司;CCK-8,購自美國MedChemexpress生物科技有限公司。

1.3 檢測指標

1.3.1 補骨脂提取物細胞活力測定

取鹽補骨脂水提取物、鹽補骨脂醇提取物樣品適量,經0.22 μm濾膜過濾后,每種成分使用培養基配制成0.5、1、2、3、4、5、6、7和8 mg/mL的藥液。調整細胞密度,HK-2細胞密度為10 000/孔、Hep-2細胞密度為25 000/孔、LLC-PK1細胞密度為10 000/孔,將其接種在96孔板中,37 ℃,5% CO2培養,貼壁生長12 h后使用不含血清的對應培養基,饑餓12 h后,棄掉培養液,給藥組加入含補骨脂提取物質量分數為0.5、1、2、3、4、5、6、7和8 mg/mL的培養基培養24 h。藥物處理24 h后,棄掉藥液,隨后加入100 μL濃度為10%的CCK-8試劑,HK-2細胞和LLC-PK1細胞37 ℃孵育4 h,Hep-G2細胞37 ℃孵育2 h后,使用酶標儀檢測吸光度(波長為450 nm),計算細胞存活率后,計算半數抑制率(IC50)。

1.3.2 補骨脂主要活性成分細胞活力測定

取甲基補骨脂黃酮A、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂素、補骨脂寧、異補骨脂素、補骨脂定、異補骨脂定,每種成分以DMSO配制成50 mmol/L濃度的儲備液。試驗時將其以培養基分別配制成25、50、75、100、125、150、175和200 μmol/L藥液,對照組為含體積分數0.4%的DMSO。細胞鋪板同1.3.1.1。給藥組加入含不同補骨脂的主要成分(25、50、75、100、125、150、175和200 μmol/L)的培養基培養24 h,藥物處理24 h后,棄掉藥液。隨后同1.3.1中使用CCK-8法測定細胞存活率,并計算IC50值。

1.4 統計學方法

采用GraphPad Prism 9分析軟件處理。采用Excel 2021軟件進行作圖,與對照組相比,*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 補骨脂提取物對HK-2細胞活力的影響

給藥培養24 h后檢測,發現鹽補骨脂醇提取物、水提取物能夠抑制HK-2細胞的活力。24 h的IC50值顯示,在相同給藥條件下,鹽補骨脂水提取物的IC50值為1.736 mg/mL,鹽補骨脂醇提取物的IC50值為0.558 mg/mL。由此可見,鹽補骨脂水提取物的毒性小于鹽補骨脂醇提取物(圖1)。

(a)鹽補骨脂水提取物;(b)鹽補骨脂乙醇提取物。(a) Water extract of salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus.圖1 不同鹽補骨脂提取物對HK-2細胞活力的影響Fig.1 Effect of different salt Psoraleae Fructus extracts on the viability of HK-2 cells

2.2 補骨脂主要成分對HK-2細胞活力的影響

給藥培養24 h后檢測,發現甲基補骨脂黃酮A、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂定、異補骨脂定能夠抑制HK-2細胞的活力,而補骨脂寧在本試驗劑量下沒有顯著毒性(P>0.05)。24 h的IC50值排序為(補骨脂寧>補骨脂素>異補骨脂素>異補骨脂定>補骨脂定>甲基補骨脂黃酮A>補骨脂乙素>補骨脂甲素)。24 h的IC50值顯示,在相同給藥條件下,補骨脂甲素對HK-2 細胞毒性較其他成分對HK-2細胞的毒性強。此外,還比較了補骨脂主要成分與馬兜鈴酸A對于HK-2細胞的毒性,結果發現甲基補骨脂黃酮A、補骨脂乙素、補骨脂甲素、補骨脂定的毒性強于馬兜鈴酸A(圖2)。

(a)補骨脂素;(b)甲基補骨脂黃酮A;(c)異補骨脂定;(d)異補骨脂素;(e)補骨脂寧;(f)補骨脂定;(g)補骨脂乙素;(h)補骨脂甲素;(i)馬兜鈴酸A。(a) Psoralen; (b) Bavachinin A; (c) Isopsoralidin; (d) Isopsoralen; (e) Corylin; (f) Psoralidin; (g) Isobavachalcone; (h) Bavachin; (i) Aristolochic acid A.圖2 補骨脂主要成分對HK-2細胞活力的影響Fig.2 Effect of the main components of Psoraleae Fructus on the viability of HK-2 cells

2.3 補骨脂提取物對Hep-G2細胞活力的影響

給藥培養24 h后檢測,發現鹽補骨脂醇提取物、水提取物能夠抑制Hep-G2細胞的活力。24 h的IC50值顯示,在相同給藥的條件下,鹽補骨脂水提取物的IC50值為3.891 mg/mL,鹽補骨脂醇提取物的IC50值為1.049 mg/mL,由此可見,鹽補骨脂水提取物的毒性要小于鹽補骨脂醇提取物。研究顯示,美國每年因對乙酰氨基酚引起的急性肝功能衰竭(AHF)的發生率呈逐年上升趨勢(1998年21%,2003年51%)[9],所以對比分析鹽補骨脂醇提取物、水提取物和對乙酰氨基酚對于Hep-G2細胞毒性的影響,發現鹽補骨脂水提取物的毒性要小于對乙酰氨基酚,但是鹽補骨脂乙醇提取物的毒性大于對乙酰氨基酚(圖3)。

2.4 補骨脂主要成分對Hep-G2細胞活力的影響

給藥培養24 h后檢測,發現甲基補骨脂黃酮A、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂定、異補骨脂定能夠抑制Hep-G2細胞的活力,而補骨脂寧在本試驗劑量下基本沒有毒性(P>0.05)。24 h的IC50值排序為(補骨脂寧>補骨脂素>異補骨脂定>異補骨脂素>補骨脂定>補骨脂乙素>甲基補骨脂黃酮A>補骨脂甲素)。IC50值顯示,在相同給藥條件下,補骨脂甲素對Hep-G2細胞毒性較其他成分對Hep-G2細胞的毒性強(圖4)。

2.5 補骨脂提取物對LLC-PK1細胞活力的影響

在給藥培養24 h后檢測,發現鹽補骨脂醇提取物、水提取物能夠抑制LLC-PK1細胞的活力。24 h的IC50值顯示,在相同給藥質量分數條件下,鹽補骨脂水提取物的IC50值為1.759 mg/mL,鹽補骨脂醇提取物的IC50值為0.737 mg/mL。由此可見,鹽補骨脂水提取物的毒性要小于鹽補骨脂醇提取物(圖5)。

(a)鹽補骨脂水提取物;(b)鹽補骨脂乙醇提取物;(c)對乙酰氨基酚。(a) Water extract salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus; (c) Acetaminophen.圖3 不同鹽補骨脂提取物對Hep-G2細胞活力的影響Fig.3 Effects of different salt Psoraleae Fructus extracts and acetaminophen on the viability of Hep-G2 cells

(a)補骨脂素;(b)甲基補骨脂黃酮A;(c)異補骨脂定;(d)異補骨脂素;(e)補骨脂寧;(f)補骨脂定;(g)補骨脂甲素;(h)補骨脂乙素。(a) Psoralen; (b) Bavachinin A; (c) Isopsoralidin; (d) Isopsoralen; (e) Corylin; (f) Psoralidin; (g) Bavachin; (h) Isobavachalcone.圖4 補骨脂主要成分對Hep-G2細胞活力的影響Fig.4 Effect of the main components of Psoraleae Fructus on the viability of Hep-G2 cells

(a)鹽補骨脂水提取物;(b)鹽補骨脂乙醇提取物。(a) Water extract of salt Psoraleae Fructus; (b) Ethanolic extract of salt Psoraleae Fructus.圖5 不同鹽補骨脂提取物對LLC-PK1細胞活力的影響Fig.5 Effect of different salt Psoraleae Fructus extracts on the viability of LLC-PK1 cells

3 討論與結論

由于中藥具有多成分、多途徑、多靶點綜合作用的整體性特點,其毒性物質基礎往往是多種有毒成分的集合,且組成成分的化學特性各異,有些成分毒-效關系不明確,這也增加了中藥毒性物質基礎研究的難度,需借助有效的方法明確中藥毒性物質。

補骨脂最早記載于《雷公炮炙論》,未言明其毒性。但近年來,國內外學者對補骨脂及其制劑肝腎毒性的關注度越來越高[10]。如王宇等[11]發現對鼠使用灌胃的給藥方式給予補骨脂乙醇提取物后,相關膽汁合成和轉運酶受到破壞,發生膽汁淤積型的肝臟損傷,且補骨脂的毒性呈性別依賴性,對雌性大鼠更易造成肝臟損傷,又如Wang等[12]發現補骨脂甲素等黃酮類成分可通過抑制肝臟微粒體中的葡萄糖醛酸轉移酶1A1,從而使膽紅素水平升高,造成肝臟毒性。本研究依據補骨脂致肝、腎損害的藥理學特點,以HK-2細胞、Hep-G2細胞及LLC-PK1作為研究對象,以細胞活力作為檢測指標,對鹽補骨脂水、醇提取物及其主要成分對于各細胞的毒性進行評估。結果表明鹽補骨脂醇提取物及水提取物可能對肝、腎損傷產生影響,且鹽補骨脂醇提取物對于肝、腎細胞的毒性要大于補骨脂水提取物。尤力都孜等[13]和阿卜杜米吉提等[14]研究表明,使用補骨脂乙醇提取物給小鼠灌胃后發現,其肝臟呈現明顯的損傷,且郭兆娟[15]在使用水和乙醇對鹽補骨脂進行提取后,其鹽補骨脂水提取物中補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂甲素、補骨脂定等毒性成分明顯少于乙醇提取物,含量差異較大,在使用肝細胞對比研究后發現,補骨脂醇提取物對于肝細胞的毒性要大于補骨脂水提取物,其結果與本試驗的結果相一致。由此可知,不同的提取方式可能會影響補骨脂的毒性,其原因可能是鹽補骨脂在使用乙醇提取后,其毒性成分發生了改變。一些相關研究表明在補骨脂醇提取物中有效成分的含量要高于水提取物[15],在未來的應用中,怎樣平衡兩者之間的關系,是以后需要進行探討的問題。

毒性成分方面,甲基補骨脂黃酮A、補骨脂甲素、補骨脂乙素、異補骨脂定、補骨脂定、補骨脂素、異補骨脂素可能是補骨脂致肝、腎細胞損傷的潛在成分,在HK-2細胞和Hep-G2細胞中,補骨脂甲素的毒性均大于補骨脂其他主要成分。在本研究中,雖然使用了2種不同物種細胞進行比較,但是在有毒成分作用的細胞中,都呈現出了劑量依賴性的毒性。研究表明,在使用異補骨脂素灌胃后發現,大鼠的腎臟系數升高,體重減輕,血清中尿素氮含量顯著升高,經病理組織學檢查后發現,腎臟遠曲小管皮質層出現了明顯的空泡變性,說明異補骨脂素可引起大鼠腎毒性[16-18],而吳婭麗等[19]使用網絡藥理學方法篩選補骨脂毒性成分的推測與本研究結果相符。

對乙酰氨基酚是解熱鎮痛藥的一種,過量使用是造成藥物性肝損傷主要原因之一[20],而馬兜鈴酸A是馬兜鈴酸中主要的組成物質,其靶器官為腎臟,長期使用含馬兜鈴酸A的藥物會導致馬兜鈴酸腎病,嚴重時會發展成終末期腎病[21]。本研究對鹽補骨脂的提取物與對乙酰氨基酚、補骨脂的毒性成分與馬兜鈴酸A的毒性分別進行比較后發現其毒性成分中的甲基補骨脂黃酮A、補骨脂乙素、補骨脂甲素、補骨脂定的毒性要大于馬兜鈴酸A,鹽補骨脂乙醇提取物的毒性要大于對乙酰氨基酚,從側面說明了鹽補骨脂及其毒性成分對肝、腎毒性的程度。

因此根據本研究結果,可在后續深入研究其體內外肝、腎損傷及機制和臨床應用時,選擇合適的有效成分或提取方式,為后續的研究提供科學依據。本研究存在一些局限性,使用HK-2腎小管上皮細胞、LLC-PK1豬腎細胞以及Hep-G2人肝癌細胞進行體外試驗并不能完全反映藥物對于機體的毒副作用。因此,后續試驗將基于以上結果,開展補骨脂水、醇提取物及其主要成分體內毒性的比較及相關的體內外機制方面的研究。此外,一些研究表明,不同動物種屬及性別存在藥物毒性的差異,后續我們將根據試驗結果,開展不同種屬、性別方面的研究,為后續深入研究補骨脂毒性及其機制提供試驗依據,也為含補骨脂中成藥的減毒研究提供思路。

綜上所述,鹽補骨脂水提取物、醇提取物對HK-2細胞、Hep-G2細胞及LLC-PK1細胞均具有一定的細胞毒性,且鹽補骨脂醇提取物毒性更大;補骨脂甲素、補骨脂乙素、甲基補骨脂黃酮A、補骨脂素、異補骨脂素、異補骨脂定、補骨脂定對HK-2細胞、Hep-G2細胞具有一定的細胞毒性,且補骨脂甲素的毒性要大于補骨脂其他主要成分。