體外循環術后患者來源的腸道菌群重建對腸黏膜損傷大鼠菌群特征和炎癥反應的影響

伊小婷，范嘉寧，刁玉剛，孫瑩杰

近些年來，不同疾病與腸道菌群之間的相關性得到了專家和學者們的廣泛關注。 有研究表明，腸道菌群類別的改變能夠影響結腸組織的發育，從而影響腸黏膜屏障的功能［1］。 腸黏膜屏障是機體阻擋非特異性感染的第一道防線，課題組前期的研究已證實心肺轉流（cardiopulmonary bypass，CPB）可通過炎癥反應、缺血再灌注損傷、氧化應激反應、細胞凋亡損傷等多種方式損傷腸黏膜屏障［2-3］，引發腸損傷。 因此，CPB 所致腸損傷的機制是否與腸道菌群的紊亂相關尚有待研究，本實驗擬對此進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇無特定病原體成年雄性標準差大鼠共30 只，體重為400～450 g。 按照隨機數字表法將大鼠隨機分為3 組：偽無菌大鼠組（S 組）、偽無菌大鼠+接種健康人源糞菌濾液組（N 組）和偽無菌大鼠+接種行CPB 下心臟瓣膜術后患者糞菌濾液組（C 組），每組分別為10 只。 第1 天至第14 天給予S 組、N 組和C 組大鼠由甲硝唑（250 mg／kg）、氨芐西林（250 mg／kg）、硫酸新霉素（250 mg／kg）混合配制而成的抗生素雞尾酒胃管灌胃處理，每天2 次，每次2 ml；第15 天至第28 天N 組、C 組分別接受來自健康人源和行CPB 下心臟瓣膜術后患者源的糞菌移植，每天1 次。

1.2 制作糞菌懸液 將-80℃保存的糞便取出稱重，按1 ∶10 的比例加入無菌生理鹽水（1 g 糞便加入10 ml 生理鹽水），置于50 ml 的小燒杯內，密封，放置于磁力攪拌器上攪拌15 min，離心管收集混懸液，標記濾液體積，將混懸液4℃下離心10 min，上清液即為糞菌懸液。

1.3 糞菌移植 糞菌移植之前禁食6 h，大鼠取俯臥位，搔刮法盡量排空直腸內留存糞便，在內徑2 mm 塑料軟管表面涂抹無菌生理鹽水潤滑后輕柔置入結腸，至軟管頂端距離肛門約8 mm，緩慢注入糞菌液500 μl，輕柔拔出軟管后用無菌紗布或棉簽壓住肛門幾秒鐘，執鼠尾使大鼠保持頭低腳高姿態約1 min 后放回籠中，1 次／d，連續14 d。

1.4 檢測指標 建模成功后，糞菌移植14 d 后，收集各組大鼠糞便，每只大鼠取3 粒糞便貯存于-80℃冰箱供宏基因組學測序；脊椎脫臼法處死大鼠，無菌取靜脈血、離心，血清供酶聯免疫吸附（Elisa）檢測；取結腸組織置于4%多聚甲醛溶液貯存，以備光學顯微鏡下觀察；另取部分結腸組織-80℃保存，蛋白免疫印跡（Westernblot）法檢測緊密連接蛋白（zonula occludin-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）的表達水平。

宏基因組學測序是對微生物群體進行高通量測序，分析特定環境中微生物群體基因組成及功能、微生物群體的多樣性與豐度，進而分析微生物與環境、微生物與宿主之間的關系，發現具有特定功能的基因。 具體方法如下：①DNA 提?。海╝）糞便樣本加入裂解液，混勻；（b）離心取上清，加酚∶氯仿∶異戊醇（25 ∶24 ∶1），混勻，離心；（c）取上清，加氯仿∶異戊醇（24 ∶1），混勻，離心；（d）取上清，加入異丙醇，搖晃，沉淀；（e）離心后用75%乙醇洗滌2 次，吹干；（f）加入蒸餾水溶解DNA 樣品；（g）加入RNaseA加速溶劑消化RNA，37℃下放置。 ②DNA 檢測：瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性。 ③文庫構建及質檢。 ④上機測序。 ⑤下機質控。 ⑥信息分析：（a）數據質控；（b）去除宿主；（c）物種注釋；（d）常用功能數據庫注釋；（e）豐度聚類分析；（f）抗性基因注釋；（g）高級功能注釋。 ⑦測序數據處理：（a）去除接頭序列；（b）掃描序列；（c）去除最終長度小于50 bp 的序列。

1.5 HE 染色 取結腸組織置于4%多聚甲醛中固定，鹽酸緩沖液沖洗，酒精脫水過夜，蠟塊包埋后切片，HE 染色、反蘭，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察結腸組織病理學的改變。

1.6 Elisa 檢測 ①標準品的稀釋；②加樣；③溫育；④配液；⑤洗滌；⑥加酶；⑦溫育；⑧洗滌；⑨顯色；⑩終止；○1 測定。

1.7 Westernblot 法檢測 將結腸組織稱重、研磨、勻漿、離心，取上清液；煮沸；配置濃縮膠、分離膠，加入樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；舍去膠放入緩沖液，搖勻；利用濾紙、聚偏二氟乙烯蛋白印跡膜，制作夾膜，轉膜1 h；洗膜；洗膜后加入ZO-1 兔抗鼠多克隆抗體，occludin 兔抗鼠多克隆抗體，搖床孵育1 h；洗膜后加入羊抗兔免疫球蛋白IgG 多克隆抗體，放入搖床1 h；漂洗，通過電化學發光系統顯影，進而分析免疫印跡灰度值，以磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.8 統計方法 采用SPSS 25.0 統計軟件處理，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩亞組設計的實驗結果分析采用獨立樣本t檢驗，多組設計的實驗結果分析采用單因素方差分析，最小顯著差別法進行兩兩比較，腸道菌群宏基因測序結果采用Student's t 檢驗測量兩組間的差異，利用乘積矩系數進行相關分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠腸道菌群宏基因組學測序結果 各組大鼠腸道菌群的聚類分析：S 組、C 組和N 組各自聚集，分區良好，提示各組大鼠種植的腸道菌群組成存在明顯差異。 見圖1、2。

圖1 各組大鼠腸道菌群的主坐標分析

2.2 各組大鼠腸道菌群的組成及差異顯著性分析S 組、C 組和N 組腸道菌群組成在屬水平上的相對豐度如圖3 所示，克雷伯菌屬（Klebsiella）、阿克曼菌屬（Akkermansia）、普雷沃菌屬（Prevotella）和乳桿菌屬（Lactobacillus）的表達在三組中均有明顯差異。 與S 組比較，C 組和N 組克雷伯菌屬的相對豐度明顯減低（P＜0.05），而C 組和N 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，C 組阿克曼菌屬、普雷沃菌屬的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而N 組和S 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，N 組乳桿菌屬的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而C 組和S組間無明顯差異（P＞0.05）。 見圖3。

圖2 各組大鼠腸道菌群的非度量多維尺度分析

S 組、C 組和N 組腸道菌群組成在種水平上的相對豐度如圖4 所示，肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella_pneumoniae）、嗜黏蛋白-艾克曼菌（Akkermansia_muciniphila）和地中海-瑪斯里菌（Mediterranea_massiliensis）的表達在三組中均有明顯差異。 與S組比較，C 組和N 組肺炎克雷伯桿菌的相對豐度明顯減低（P＜0.05），而C 組和N 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，C 組嗜黏蛋白-艾克曼菌的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而N 組和S 組間無明顯差異（P＞0.05）；與S 組比較，N 組地中海-瑪斯里菌的相對豐度明顯增加（P＜0.05），而C 組和S組間無明顯差異（P＞0.05）。 見圖4。

圖4 各組大鼠腸道菌群在種水平上的變化分布圖

2.3 各組大鼠結腸病理學變化 S 組出現不同程度的損傷表現，絨毛縮短、腸黏膜水腫，細胞大量缺失并呈空泡樣變性；C 組腸黏膜層受損變短，核固縮、核深染增多；N 組黏膜層增厚，細胞形態規整，可見大量正常細胞，見圖5。

圖5 各組大鼠結腸病理學變化（HE×200）

2.4 各組炎性介質濃度比較 與S 組比較，C 組和N 組大鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度均減低（P＜0.05）；與C 組比較，N 組大鼠術后7 d 血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度明顯減低（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組炎性因子濃度的比較

2.5 各組免疫蛋白表達 與S 組比較，C 組和N組大鼠腸組織ZO-1、occludin 表達水平上調（P＜0.05）；與C 組比較，N 組大鼠腸組織ZO-1、occludin表達水平均上調（P＜0.05），見圖7。

圖7 各組大鼠ZO-1、occludin 蛋白的表達

2.6 大鼠差異性腸道菌群與炎癥反應嚴重程度的相關性分析 炎癥反應的嚴重程度與血清炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平成正相關，故將三組大鼠的腸道菌群表達豐度測得的IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平進行相關性分析，研究結果提示普雷沃菌屬、副沙門氏菌屬、腸桿菌屬、阿克曼菌屬、腸球菌屬和擬桿菌屬與炎癥反應的嚴重程度成正相關（r＝0.21，P＜0.05），而狄氏副擬桿菌屬、乳桿菌屬與炎癥反應的嚴重程度成負相關（r ＝-0.58，P＜0.05）。

3 討 論

鑒于人類在體實驗的局限性，限制了相關的檢測和機制研究，因此可將人類菌群通過糞菌移植（fecal microbiota transplants，FMT）的方法移植到動物模型上。 FMT 是指將功能菌群移植到受體的消化道中，通過重建受體的腸道菌群達到研究或治療的目的［4］，目前已成為研究腸道菌群與宿主關系的重要手段。 其優勢在于人類的腸道菌群可通過該技術定植在無菌／偽無菌大鼠的消化道中，使實驗動物的腸道菌群與人類更相近，實驗結果與人類更具相關性。

課題組前期實驗研究發現，CPB 后的大鼠腸黏膜層縮短變薄，絨毛的上皮細胞有不同程度的變形、核固縮、核壞死，固有層存在炎性細胞浸潤以及充血水腫，證實CPB 可損傷大鼠的腸黏膜屏障［5］。 腸屏障損傷后可致大量毒性產物及促炎細胞因子的釋放，進而誘發全身炎癥反應綜合征以及多器官功能障礙綜合征，同時全身炎癥反應也是CPB 促發腸損傷的相關機制之一。

已有研究表明，腸道菌群的改變與炎癥反應息息相關，特定的腸道細菌及其代謝產物可發揮促炎或抑制炎癥反應的作用，進而引發腸屏障功能的改變［6］。 此外，腸屏障功能的穩定性還有賴于腸上皮細胞間的特定連接方式，即ZO-1 和occludin 蛋白的表達。 它們是腸上皮細胞之間相互連接的骨架結構，構成了腸黏膜組織的第一道防線，可防止大分子物質在細胞間隙之間任意進出，維持腸黏膜上皮的穩定性，保護腸屏障功能的完整性。 本研究發現，當腸道菌群作為干預因素時，偽無菌組大鼠血清的IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平最高，炎性反應最明顯，腸組織ZO-1、occludin 的表達水平最低；與偽無菌大鼠比較，接受CPB 術后患者菌群移植的大鼠血清炎性因子表達有所減低，ZO-1、occludin 蛋白的表達水平均增加；而接受健康人菌群移植的大鼠血清炎性因子表達水平最低，ZO-1、occludin 蛋白的表達水平最高。 各組大鼠腸道菌群的組成及差異顯著性分析，炎癥反應的嚴重程度可能與普雷沃菌屬、阿克曼菌屬的相對豐度增加，肺炎克雷伯菌的相對豐度減低有關。 現有研究表明，普雷沃菌屬具有較強的炎性特性，能刺激腸上皮細胞產生IL-8、IL-6 等炎性因子，從而介導黏膜炎癥反應的發生，提示某些普雷沃菌株可能為臨床上重要的致病菌，可通過促進慢性炎癥參與人類的相關疾?。?］。 而阿克曼菌屬一般被認為是益生菌，可以降解腸黏膜的黏蛋白，降低肥胖、Ⅱ型糖尿病的發病率。 然而，最新研究發現在高糖飲食的小鼠體內阿克曼菌屬的相對豐度過高，結腸組織黏膜層變薄，腸屏障功能受損，導致結腸炎的誘發和惡化［8］。 而本研究中，普雷沃菌屬和阿克曼菌屬均為炎癥水平升高組中的特征性腸道菌群，提示腸道菌群確實可參與炎癥反應的發生和發展，進而導致腸黏膜屏障損傷，且不同的特征性腸道菌群可發揮不同的促炎作用。

綜上所述，CPB 后腸道菌群的改變所引起的炎癥級聯反應是導致腸屏障功能損害的機制之一。 這可能是因為普雷沃菌屬和阿克曼菌屬的相對豐度增加，促進了有毒產物和炎性細胞因子的產生，損傷了腸屏障，進而引發腸損傷。