蝴蝶蘭PhPIF4基因的克隆與響應GA3表達分析

張英杰　劉民曉　孫紀霞　張京偉　郭文姣　呂曉惠　呂英民

關鍵詞：蝴蝶蘭；PhPIF4；生長調節劑；GA3

中圖分類號：S688 文獻標識碼：A

蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）是蘭科蝴蝶蘭屬植物的統稱，是我國銷售量最大的年宵盆花花卉，也是國際暢銷的盆花種類[1-2]。我國蝴蝶蘭盆花上市時間主要在春節前，因此蝴蝶蘭花期精準調控尤為重要。目前在擬南芥中，已確定了6 個調控開花時間的途徑：光周期、春化、赤霉素、溫度、自主和年齡途徑[3-10]。本課題組在前期蝴蝶蘭成花轉錄組數據中挖掘了大量的成花途徑關鍵基因，其中PhPIF4 基因在成花途徑中表達量顯著增加（未發表數據），成花轉變（抽梗）和小花原基分化期（花梗長10 cm）基因FPKM 值，較低溫處理前增長了22 倍和38 倍。PIF（phytochromeinteracting factor）蛋白是一類能夠與激活狀態的光敏色素phyB 互作進而響應光信號的bHLH（basic helix–loop–helix）類型轉錄因子，在植物生長發育中起到“樞紐”作用，參與植物體內多信號通路調控植物的生長發育[11]。在植物體內，PIF 可能通過整合光和溫度[12] 2 種關鍵的環境信號轉導途徑，參與生物鐘對內源激素信號網絡的調控，使植物能夠迅速地適應周圍的環境并精確調控其發育進程。研究發現，在高溫條件下，PIF4、生長素和植物伸長生長之間存在直接的分子聯系[13]。正常的生長素反應需要赤霉素（GA）的促進作用[14]。PIF4 通過與DELLA 互作影響赤霉素的合成與功能發揮[15]。由PIF4 介導的生長素和GA 的串擾作用也可能作用于植物成花。因此，PIF4 可能在光、溫度和激素等多途徑成花復雜網絡中扮演重要角色。

本研究通過對蝴蝶蘭成花轉錄組數據分析挖掘出來的PhPIF4 基因進行克隆和生物信息學分析，以及對生長調節劑GA3 的響應表達分析，以期闡明PhPIF4 基因的調控機制，對蝴蝶蘭遺傳改良、生長調節劑的應用技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蝴蝶蘭品種大辣椒（Big Chilli）引自廈門和鳴花卉科技有限公司，在山東省煙臺市農業科學研究院內栽培2 年。選用健康、無病蟲害、長勢基本一致的4 葉1 心的成熟苗進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 PhPIF4 基因序列的獲取與分析 PhPIF4基因序列源自本實驗室的轉錄組數據（NCBI ShortRead Achieve 數據庫中登錄號：PRJNA783677，>TRINITY_DN38810_c0_g1_i3_3_2）。利用BLAST網站預測PIF4 氨基酸序列中的保守結構域。用DNAMAN（version 7）軟件進行氨基酸序列比對和保守結構域分析，通過clustal X 軟件進行氨基酸序列同源性比較，通過GeneDoc 繪制多重序列比對圖，利用MEGA 5.0 系統進化分析軟件構建系統進化樹。通過ExPASy（http：//expasy.org/cgibin/pi_tool）在線軟件分析蛋白質的分子量和理論等電點，利用SignalP4.0Server 軟件分析蛋白信號肽，利用SOPMA 分析蛋白二級結構，利用Phyre2分析蛋白三維結構。

1.2.2 亞細胞定位 將整個PhPIF4 編碼區擴增并克隆到pBWA（V）HS-GLosgfp 中，酶切連接后將連接產物轉化大腸桿菌感受態。用酶解液制備擬南芥幼苗葉片細胞原生質體，然后在PEG-4000的作用下將pBWA（V）HS-PhPIF4-GLosgfp 和pBWA（V）HS-GLosgfp 導入原生質體。采用激光共聚焦顯微鏡（Nikon C2-ER）觀察PhPIF4 定位。

1.2.3 生長調節劑對成花的影響 試驗組在轉入低溫處理2 h 和10、20、30 d 后分別噴施GA3 （ T1：100 mg/L，T2：200 mg/L，T3：300 mg/L）、6-BA（T4：100 mg/L，T5：200 mg/L，T6：300 mg/L），100 mg/L GA3+100 mg/L 6-BA（T7）及300 mg/LGA3+300 mg/L 6-BA（T8）共8 組處理，清水為對照（CK）。每組處理15 株，每株噴施5 mL，主要噴施第3 和第4 葉基部，設3 次重復。統計第1 朵花的開放和凋謝日期、花梗長度和花量。用Microsoft Excel 2010 軟件處理數據及制圖，用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。

1.2.4 PhPIF4 基因時空表達及響應GA3 表達 在蝴蝶蘭DBB（潛伏芽期，低溫處理前20 d）、IFB（花序原基分化期，花芽0.5～1 cm）、FBD（小花原基分化期，花梗10 cm）、FB（現蕾期，花梗30 cm）4 個時期分別取噴施GA3 300 mg/L 處理組及對照組的芽點（潛伏芽、花芽和花梗頂端0.5 cm）、葉片和根尖進行qRT-PCR。使用RNA提取試劑盒提取各組織的總RNA，反轉錄合成cDNA 第一鏈，并以cDNA 為模板進行qRT-PCR。引物PIF4（+） ： GTTCCAATACCACCCTTAC ，PIF4（–）：GTCAG CGGAAATAATAGTCTGT。每個RT 反應分2 步。第1 步將0.5 μg RNA、2 μL4×gDNA wiper Mi，加入無核酸酶的H2O 至8 μL。在GeneAmp? PCR System 9700 （Applied Biosystems，USA）中，42 ℃下反應2 min。第2 步加入2 μL 的5×HiScript II Q RT SuperMix IIa，反應在GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems，USA）中進行，50 ℃下反應15 min，85 ℃下反應5 s。然后將10 μL 的RTRT reaction mix用nuclease-free water 稀釋10 倍，–20 ℃保存。采用LightCycler? 480 Ⅱ Real-time PCR Instrument（Roche， Swiss）進行Real-time PCR，PCR 反應混合物為10 μL，其中cDNA1 μL，2×ChamQ SYBRqPCR Master Mix 5 μL，正引物0.2 μL，反引物0.2 μL，nuclease-free water 3.6 μL。在384 孔光學板（Roche， Swiss）中95 ℃培養30 s，然后進行40 個循環，95 ℃培養10 s，60 ℃培養30 s。每個樣本重復3 次。據擴增曲線確定基因的Ct 值，表達量的計算采用2-ΔΔCT 法。

2 結果與分析

2.1 PhPIF4 基因序列分析

蝴蝶蘭大辣椒PhPIF4 基因ORF 全長為539 bp，編碼176 個氨基酸。ProtParam 軟件分析表明PhPIF4 分子式為C854H1333N241O250S17，分子量為19 521.46；理論等電點（pI）為7.05，其中包含正電殘基（Asp+Glu）8 個、負電殘基（Arg+ Lys）8 個，理論半衰期為體外哺乳動物網織紅細胞30 h、在酵母體內>20 h、在大腸桿菌體內>10 h，不穩定指數是67.48，脂溶指數是68.24，屬于不穩定蛋白，平均親水性值為-0.38，為兩性蛋白，編碼蛋白不含信號肽。對其二級結構和三維結構的分析發現，PhPIF4 蛋白中不規則卷曲結構所占比例為78%，α-螺旋比例為35%，β-轉角為0%（圖1）。利用NCBI網站進行保守結構域分析，發現PhPIF4 基因編碼的氨基酸具有bHLH_SF super family（cl00081）同源異型盒家族的典型保守結構域（圖2）。將PhPIF4氨基酸序列與小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris，PhaPIF4， XP_020586384.1） 、建蘭（Cymbidiumensifolium， CyPIF4， QDL88406.1 ） 、墨蘭（Cymbidium sinense， CymPIF4， QDH08906.1）、石斛蘭（ Dendrobium catenatum， DePIF13，XP_020694614.2 ） 、鼓槌石斛（ Dendrobiumchrysotoxum， DeIEQ34， KAH0453999.1）進行比對，并與15 個物種PIF4 建立系統進化樹，結果表明，大辣椒PhPIF4 與小蘭嶼蝴蝶蘭親緣關系較近，其次為建蘭、墨蘭和石斛蘭（圖3）。

2.2 PhPIF4 亞細胞定位分析

在瞬時轉化35S-GFP 空載體的擬南芥原生質體中，GFP 基因大量表達，綠色熒光信號在細胞質、質膜和細胞核中均有分布。而在瞬時轉化35S-PIF4-GFP 的擬南芥原生質體中，綠色熒光信號主要分布于細胞器上，細胞質、葉綠體和細胞核中均未檢測到明顯的熒光信號，表明PhPIF4 蛋白定位于非葉綠體的細胞器中（圖4）。

2.3 生長調節劑GA3對成花的影響

不同濃度GA3 處理均增加了蝴蝶蘭花梗長度，使花期提前9～11 d，但對花徑和花量均無顯著影響?；üＷ铋L的處理組是200 mg/L GA3，然而不同濃度GA3 處理的花梗長度增加的差異不顯著。6-BA 可顯著增加蝴蝶蘭花量，花量最多的處理組為300 mg/L 6-BA，但6-BA 對花期和花梗長度無顯著作用。GA3 和6-BA 混合使用時，對蝴蝶蘭開花時間和花期的影響介于二者之間（圖5）。

2.4 PhPIF4 基因表達量分析

在蝴蝶蘭花發育過程中，PhPIF4 基因在花芽、葉和根中的表達量變化不同（圖6）。在花芽中表達量變化相對較小，在葉片中表達量逐漸增加，在根中增加最顯著，FB 期較DBB 期增加了10 倍以上。但不論在哪種器官中，該基因均在FB 期表達量最大。噴施生長調節劑GA3 后，PhPIF4 基因在花芽、葉和根中的表達量均有所增加，且在FB 期增加量最大，表明PhPIF4 基因的表達可能受GA3 影響與調控。

3 討論

在蝴蝶蘭生產栽培中，低溫、長日照和植物生長調節劑是重要的催花技術手段。夜間18～20 ℃、白天23～26 ℃的相對低溫處理40～50 d[16]以及增強光照可提前蝴蝶蘭的自然花期以供應我國年宵用花。光照可促進蝴蝶蘭成花，光周期對蝴蝶蘭開花的影響不明顯，但增加光強可增加花序數量，加速抽梗[17]。降低光輻照可以延緩蝴蝶蘭的花梗發育，從而推遲蝴蝶蘭的開花時間[18]。這可能與蝴蝶蘭屬于景天酸代謝（CAM）植物有關，CAM受晝夜節律和光質[19]影響。擬南芥中許多bHLH轉錄因子的表達具有晝夜節律性，如bHLH69 和bHLH92[20]。bHLH 轉錄因子家族的PIFs 可以通過與遠紅光吸收型光敏色素互作來調控植物開花，其中，PIF4 和PIF5 的表達具有節律性，可能通過與節律鐘基因的相互作用來調控植物的生長和開花[21]。受光照激活的光敏色素既可以通過光誘導的磷酸化作用與PIFs 蛋白互作，也可與其直接互作，誘導PIFs 蛋白迅速降解[22-24]。同時光敏色素還可以通過調控COP1 （ constitutivelyphotomorphogenic 1）-SPA（suppressor of phytochromeA）復合體的活性，間接影響PIFs 蛋白的穩定性[25-26]，降低PIFs 的表達水平。PIFs 能夠結合生物鐘的核心組件CCA1/LHY 啟動子的G-box 區域，參與生物鐘的調節[27]。本研究發現PhPIF4 基因編碼的氨基酸具有bHLH_SF superfamily（cl00081）同源異型盒家族的典型保守結構域，bHLH 家族是植物中第二大類轉錄因子家族，參與植物不同組織眾多代謝過程的調控，在植物光信號傳導、抗逆脅迫和次生代謝等過程中發揮重要作用。本研究發現PhPIF4 與蝴蝶蘭花發育過程緊密相關，隨著花發育其表達量逐漸加倍，但其與光敏色素和節律鐘基因的互作關系有待進一步研究驗證。

生長調節劑可影響蝴蝶蘭成花轉變。赤霉素被認為是促進蝴蝶蘭花芽分化與花期提前最重要的生長調節劑[28-29]。鄭錦凱等[30]研究發現250、500、1000 mg/mL 赤霉素處理后蝴蝶蘭花期分別提前了5、9、17 d。此外，GA 可有效提高蝴蝶蘭雙梗率、花芽分化率和分枝率[31]，可代替環境信號來縮短植物的開花時間。BLANCHARD 等[32]研究發現單獨噴施200 mg/L 或400 mg/L BA（0.2 L/m²）的植株比未處理的植株早3～9 d 出現明顯的花序，平均每株多0.7～3.5 個花序、多3～8朵花，但BA 不能完全替代低溫誘導。BA+GA 處理對不同速率下的花序數和總花數均無顯著影響。劉曉榮[31]研究發現蝴蝶蘭大花品種2048 對植物生長調節劑較小花品種如滿天紅更敏感，10 mg/L 6-BA 顯著增加了花芽分化速度， 而25 mg/L 與對照差異不顯著。涂抹花芽處理試驗中，25 mg/L 和50 mg/L 6-BA、50 mg/L GA 均提高了雙梗率。因此不同激素聯合處理蝴蝶蘭的成花作用效果在品種間存在差異。本研究僅針對大辣椒品種展開試驗，發現GA3 處理增加了花梗長度，并使花期提前。6-BA 可顯著增加蝴蝶蘭花量，但對花期和花梗長度無顯著作用。2 種激素聯合使用效果介于二者之間。

植物成花過程赤霉素信號轉導通路主要包括GID1、DELLA蛋白以及介導DELLA蛋白降解的其他調控因子。當GA 在細胞外的濃度較高時，GA 上的C 端結構域會與GID1 結合，從而引發一系列相關應答反應；當細胞外GA 濃度低時，GA則不與GID1 結合，這時GA 應答基因與DELLA蛋白結合，并被其抑制活性[33]。擬南芥PIF1 能夠與2 個DELLA 蛋白基因RGA1 和GAI 的啟動子結合抑制黑暗中種子萌發[34]。擬南芥DELLA蛋白通過抑制PIF4 的活性，調節植物開花時間，在缺乏DELLA 蛋白時植物會表現出提前開花的表型[35]。GA 降解DELLA 蛋白，在GA 缺乏的植株中，DELLA 蛋白積累，PIF4 的活性被抑制，抑制FT 相關基因的表達，導致開花延遲[36]。本研究中，噴施生長調節劑GA3 后，PhPIF4 基因在花芽、葉和根中的表達量均有所增加，且在FB 期表達量最大，表明PhPIF4 基因的表達可能受GA3影響與調控。但赤霉素是直接調控PhPIF4，還是通過赤霉素調節DELLA 蛋白含量，使DELLA 蛋白與PIF4 蛋白互作，進而間接調節PhPIF4 的表達量，仍有待進一步研究。

PIF 基因在植物生長發育中起到“樞紐”作用[37]，本文研究了GA3 等生長調節劑對蝴蝶蘭生殖生長的影響，探究了PhPIF4 基因響應赤霉素的表達情況，為揭示其在蝴蝶蘭生長發育過程中的作用奠定基礎，進一步完善PhPIF4 在赤霉素調控生長發育的調控網絡，為其遺傳育種應用做準備。