PRMT7抑制前列腺癌細胞體外遷移和侵襲的研究

胡 平, 何燕燕, 孫馨悅, 王建軍, 陳 平*

(1.同濟大學生命科學與技術學院,上海 200092; 2.同濟大學附屬第十人民醫院病理科,上海 200072;3.同濟大學附屬東方醫院婦產科,上海 200123)

前列腺癌是全球男性生殖系統最常見的腫瘤。在2020年,全世界報道有1 414 259例新診斷的病例,占到所有新診斷癌癥病例的7.3%;375 304例死亡病例,占所有癌癥死亡病例的3.8%[1]。當前列腺癌發生淋巴結轉移及其他遠端轉移時,其死亡率會極大增加。因此,理解前列腺癌轉移的機制對于制定治療策略具有重要意義。

蛋白質精氨酸甲基轉移酶7(protein arginine methyltransferase 7, PRMT7),作為唯一進化保守的Ⅲ型酶,只催化產生單甲基精氨酸殘基[2]。PRMT7參與了不同的生物學過程,包括DNA損傷修復[3]、早期胚胎發育[4]、脂肪形成[5]、成肌細胞分化[6]、神經元興奮性調節[7]。PRMT7在腫瘤組織中也有表達。在腎癌患者中,PRMT7在癌組織中的表達高于非癌組織[8]。在肺癌細胞中,PRMT7的表達與侵襲性呈正相關[9]。在高侵襲性乳腺癌細胞中PRMT7表現為高表達[10]。PRMT7在肝癌癌旁組織的表達率高于癌組織,在肝癌細胞系低表達,且PRMT7降低癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力[11]。本研究旨在分析PRMT7在前列腺癌組織和前列腺癌細胞中的表達水平、過表達PRMT7對前列腺癌細胞表型的影響,通過對過表達細胞株進行轉錄和蛋白測序初步探索其機制,進一步明確PRMT7在前列腺發生發展的作用。

1 實驗與方法

1.1 數據采集

GTEx數據庫(https:∥gtexportal.org/home/)中檢索得到100例正常前列腺組織RNAseq數據,TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫(https:∥www.cancer.gov/)中檢索得到52例正常前列腺組織RNAseq數據以及496例前列腺癌組織RNAseq數據,最終分析的樣本數目: 正常前列腺組織為152,前列腺癌組織為496。將TPM格式的RNAseq數據進行log2轉化后進行樣本間的表達比較。使用R軟件進行統計分析和可視化。

1.2 細胞培養

實驗所用細胞均購自中國科學院細胞庫;胎牛血清、0.25%胰酶、1640培養基、F-12培養基、MEM培養基、Defined Kerntinocyte-SPF培養基購自美國Gibco公司。雙抗(青霉素、鏈霉素)購自上海碧云天生物技術有限公司。所有細胞培養在10%胎牛血清、1%雙抗的培養基中,并在5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養。

1.3 Western印跡法

所有細胞使用RIPA裂解液裂解制備成蛋白懸液,加入上樣緩沖液后制備上樣懸液。一抗、二抗稀釋比為1∶1 000。PRMT7抗體購自美國Abcam公司,β-actin抗體、GAPDH抗體、MAP2抗體和S100A4抗體購自上海碧云天生物技術有限公司,KISS1R抗體購自美國Affinity公司。

1.4 PRMT7過表達穩轉細胞株的構建

將狀態良好的前列腺癌細胞傳代至六孔板中,至第2天匯合度達到40%50%。將病毒濃縮液從-80 ℃拿出放冰上融化,取200 μL病毒濃縮液加入六孔板中,輕輕混勻,放回細胞培養箱中孵育。48 h后,在顯微鏡下觀察細胞狀態,在顯微鏡下觀察感染病毒后細胞的綠色熒光的比率,加入嘌呤霉素進行篩選,每2天更換1次培養基,培養1周左右后,在熒光顯微鏡下觀察熒光達到90%時即構建穩轉株成功,后續降低嘌呤霉素濃度維持培養得到過表達PRMT7的LNCaP細胞株PRMT7-L和過表達PRMT7的PC3細胞株PRMT7-P。

1.5 細胞劃痕

細胞在六孔板中生長匯合度達到80%后,用20 μL移液管尖端借助直尺于六孔板每個孔劃4條平行線。使用PBS輕柔的洗滌3次,加入無血清培養基在顯微鏡下觀察確認無懸浮細胞后,定點在4倍物鏡下拍照。24 h后,再在定點進行拍照。

1.6 Transwell遷移

每個Transwell小室種植50 000細胞,培養48 h后,使用乙醇固定,結晶紫染色,使用棉簽擦去未穿過小室的細胞后在光學顯微鏡下拍照計數。

1.7 Transwell侵襲

基底膜基質(美國BD公司)用1∶5的培養基稀釋,每個Transwell小室加入稀釋后的基質膠50 μL。每個Transwell小室種植50 000個細胞,培養48 h后,使用乙醇固定,結晶紫染色,使用棉簽擦去未穿過小室的細胞后在光學顯微鏡下拍照計數。

1.8 轉錄測序和蛋白組分析

在3個不同時間點收取狀態良好的細胞沉淀送至公司進行轉錄組測序和Label-free蛋白組分析。P<0.05,|log2FoldChange|>0作為篩選差異基因的標準。P<0.05,FoldChange>1.5篩選出表達上調的蛋白;P<0.05,FoldChange<0.67,篩選出表達下調的蛋白。

1.9 siRNA轉染

將狀態良好的細胞傳代至六孔板中使第2天細胞匯合度達到70%,每孔換上2 mL新鮮培養基;每個孔準備1個潔凈無菌的離心管,加入125 μL Opti-MEM培養基(美國Gibco公司),再加入100 pmoL siRNA輕輕吹打混勻后再加入4 μL Lipo8000轉染試劑(上海碧云天生物技術有限公司),輕輕吹打混勻。配制完成后,室溫存放6 h內穩定,取125 μL混合物,均勻滴加到整個孔內,隨后輕輕混勻,繼續培養約23 d后,收取細胞用Western印跡法檢測siRNA對于靶基因的下調效果。

1.10 統計學處理

2 結 果

2.1 PRMT7在前列腺組織和細胞中的表達水平

通過檢索GTEx和TCGA數據庫得到PRMT 7在正常前列腺組織和前列腺癌組織的表達水平。PRMT7在正常152例前列腺組織中的轉錄水平高于496例前列腺癌組織,差異具有統計學意義(P<0.01),見圖1A。本次又檢測了PRMT7在正常前列腺上皮細胞RWPE-1和4種前列腺癌細胞LNCaP、PC3、22RV1、DU145的表達水平,發現PRMT7在正常前列腺上皮細胞的表達高于前列腺癌組織,表達差異具有統計學意義(P<0.001),見圖1B。

圖1 PRMT7在前列腺癌組織和細胞系下調表達Fig.1 PRMT7 is down-regulated in prostate tissues and cell linesA: 數據庫分析正常前列腺組織和前列腺癌組織中PRMT7的表達,**P<0.01;B: Western印跡法檢測PRMT7在正常前列腺上皮細胞和4種前列腺癌細胞的蛋白表達水平;C: PRMT7在不同細胞中表達相對柱狀圖,***P<0.001

2.2 PRMT7抑制前列腺癌細胞遷移和侵襲

通過慢病毒感染構建了雄激素依賴型前列腺癌細胞LNCaP、雄激素非依賴型前列腺癌細胞PC3穩定過表達PRMT7細胞株。通過細胞劃痕實驗、Transwell遷移實驗,檢測PRMT7過表達對前列腺癌細胞的遷移能力的影響,結果顯示PRMT7抑制前列腺癌細胞的體外遷移能力(P<0.000 1),見圖2A、B。通過Transwell侵襲實驗,檢測PRMT7過表達對前列腺癌細胞的侵襲能力的影響,結果顯示PRMT7抑制前列腺癌細胞的體外侵襲能力(P<0.000 1),見圖2C。

圖2 PRMT7抑制前列腺癌細胞LNCaP和PC3遷移和侵襲Fig.2 PRMT7 inhibits the migration and invasion of prostate cancer LNCaP and PC3 cellsA: 細胞劃痕實驗檢測過表達PRMT7對前列腺癌細胞LNCaP、PC3遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;B: 細胞Transwell遷移實驗檢測過表達PRMT7對前列腺癌細胞LNCaP、PC3遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;C: 細胞Transwell侵襲實驗檢測過表達PRMT7對前列腺癌細胞LNCaP、PC3侵襲的影響(n=3),****P<0.000 1

2.3 PRMT7影響前列腺癌細胞的轉錄水平

通過對PRMT7過表達穩轉細胞株LNCaP及其對照組細胞進行RNA-seq,PRMT7上調545個基因轉錄,下調612個基因轉錄(P<0.05)。GO分析顯示,差異表達基因富集的信號通路包括細胞外基質,見圖3A。KEGG分析顯示,差異表達基因富集的信號通路包括細胞黏附分子(CAMs),見圖3B。在腫瘤轉移相關基因中,PRMT7顯著上調KISS1R的轉錄水平,見圖3C。

2.4 PRMT7影響前列腺癌細胞的翻譯水平

通過對PRMT7過表達穩轉細胞株LNCaP及其對照組細胞進行蛋白測序,PRMT7上調17個蛋白,下調22個蛋白的表達(P<0.05),見圖3D。上調最顯著的蛋白是MAP2,它與腫瘤轉移相關,見圖3E。Western印跡法結果顯示,LNCaP和PC3細胞中MAP2表達上調。本研究發現PRMT7通過RNA測序在LNCaP細胞中下調S100A4的表達(P<0.01);通過Western印跡法檢測LNCaP細胞中S100A4的水平;在PC3中,觀察到同樣的趨勢,S100A4表達下調,見圖3F。

圖3 PRMT7影響前列腺癌細胞的轉錄和蛋白水平Fig.3 PRMT7 affectes transcription and protein levels in prostate cancer cellsA: 差異基因GO功能分析 ;B: 差異基因KEGG功能分析;C: 轉錄測序檢測KISS1R基因轉錄水平,*P<0.05;D: 蛋白測序差異蛋白熱圖;E: 蛋白組分析檢測MAP2蛋白表達水平,*P<0.05;F: Western印跡法檢測在過表達PRMT7穩轉株中與前列腺癌細胞轉移相關蛋白的表達水平

2.5 PRMT7調控下游蛋白KISS1R的表達

為了研究KISS1R是否能挽救PRMT7對前列腺癌細胞遷移和侵襲的抑制作用,在PRMT7-L和PRMT7-P中敲低KISS1R蛋白。通過細胞劃痕實驗、Transwell遷移實驗,檢測在PRMT7-L和PRMT7-P細胞株中敲低KISS1R對前列腺癌細胞的遷移能力的影響,結果顯示siKISS1R能夠逆轉PRMT7抑制前列腺癌細胞的體外遷移能力(P<0.000 1),見圖4A、B。通過Transwell侵襲實驗,檢測在PRMT7-L和PRMT7-P細胞株中敲低KISS1R對前列腺癌細胞的侵襲能力的影響,結果顯示siKISS1R能夠逆轉PRMT7抑制前列腺癌細胞的體外侵襲能力(P<0.000 1),見圖4C。Western印跡法顯示,在PRMT7-L和PRMT7-P中,siKISS1R還逆轉了與前列腺癌轉移相關蛋白的表達,MAP2表達下調,S100A4表達上調,見圖4D。PRMT7通過上調KISS1R的表達抑制前列腺癌細胞的遷移和侵襲并且改變了前列腺癌轉移相關蛋白S100A4、MAP2的表達。

圖4 PRMT7調控下游蛋白KISS1R的表達Fig.4 PRMT7 regulates downstream protein KISS1R expressionA: 細胞劃痕實驗檢測敲低KISS1R對PRMT7-L和PRMT7-P遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;B: 細胞Transwell遷移實驗檢測敲低KISS1R對PRMT7-L和PRMT7-P遷移的影響(n=3),****P<0.000 1;C: 細胞Transwell侵襲實驗檢測敲低KISS1R對PRMT7-L和PRMT7-P侵襲的影響(n=3),****P<0.000 1;D: Western印跡法檢測KISS1R敲降后PRMT7-L和PRMT7-P中KISS1R、S100A4、MAP2的表達水平

3 討 論

前列腺癌轉移機制的表觀遺傳學研究是當前研究的熱點。有報道稱,Ⅰ型和Ⅱ型PRMTs的過表達參與了前列腺癌的發生、發展、侵襲和轉移。通過生物信息學數據挖掘,本研究發現PRMT7表達與前列腺癌分期呈負相關[12]。前列腺是男性特有的器官;PRMT7在雄性生殖細胞中大量表達,PRMT7敲除小鼠在胚胎發育過程中生殖細胞數量和睪丸大小顯著減少[13]。PRMT7在雄性生殖細胞系H19印跡基因甲基化過程中起關鍵作用[14]。因此,PRMT7是研究前列腺癌發生發展的一個有前景的上游靶點。本研究選取了雄激素依賴型和雄激素非依賴型前列腺癌細胞,結果顯示,PRMT7在前列腺癌中與雄激素敏感無關。

KiSS-1轉移抑制受體(KISS1R),又稱G蛋白偶聯受體54(GPR54),最初被歸類為黑色素瘤轉移抑制因子。在許多不同的癌癥中,KISS1/KISS1R系統發揮著抑制腫瘤轉移的作用。在一項66例患者研究中,KISS1R高表達的結直腸肝轉移患者(67.9%)的5年生存率是KISS1R低表達患者(39.3%)的1.7倍。在另一項研究中,66例患者中較高的KISS1R表達與長期總生存期呈正相關[15]。在子宮內膜癌中,KISS1R已被確定為抑制轉移的靶點[16]。在食管鱗狀細胞癌中,KISS1R的丟失容易導致淋巴轉移[17]。一項研究基于186例手術前列腺組織標本,免疫組化顯示KISS1R在正常前列腺組織中表達較高[18]。另一項研究也發現,KISS1R在原發性和轉移性前列腺癌中的表達水平較低,且與臨床分期密切相關。在細胞水平上,高轉移細胞系PC-3M的KISS1R表達低于PC3、DU-145和MDA-PC-2b[19]。KISS1R參與前列腺癌細胞的遷移和侵襲。

前列腺癌轉移相關蛋白S100A4、MAP2的表達變化調控前列腺癌細胞侵襲和遷移的表型。S100A4是鈣結合蛋白,是S100蛋白家族的成員,參與細胞骨架與細胞膜的相互作用。它與多種惡性腫瘤的轉移有關,可在前列腺癌中發揮作用。在73例患者的組織中,S100A4的表達隨著惡性程度的增加而增加。在前列腺增生中,染色較弱或無染色是常見的,然而在癌癥中可觀察到強染色[20]。骨轉移性前列腺癌細胞在mRNA和蛋白水平上可存在S100A4高表達[21]。在前列腺癌細胞中,S100A4敲低可以抑制PC3[22]和LNCAP-LA[23]的遷移和侵襲能力。在裸鼠皮下注射S100A4的siRNA,可通過減少腫瘤血管抑制腫瘤生長[24]。前列腺根除手術后S100A4蛋白表達水平顯著降低,在良性前列腺增生男性血清中表達水平較低[25]。微管相關蛋白2是MAP家族成員之一,通過附著在微管上增加蛋白的穩定性。Fisetin通過上調MAP2的表達抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[26]。

綜上所述,PRMT7對前列腺癌的轉移具有保護作用。PRMT7在前列腺癌組織和細胞系中下調表達。PRMT7通過上調KISS1R抑制體外前列腺癌細胞的遷移和侵襲。這些發現表明了PRMT7在前列腺癌遠處轉移中的潛在重要作用。