大鼠螺旋神經節干細胞體外優化培養方法的研究

朱一丹 吳翠萍 金越凡 殷善開 李春燕

上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科（上海 200233）

上海交通大學耳鼻咽喉研究所（上海 200233）

螺旋神經元（Spiral Ganglion Neuron，SGN）一旦損傷很難再生。利用SG 干細胞誘導分化為神經元有望為螺旋神經元的修復提供新的方向[1]。然而，SG 干細胞培養仍有一些亟待解決的關鍵問題。既往研究[2-6]主要采用懸浮培養方法進行SG 干細胞球的培養。但懸浮培養方法存在一定缺陷，如干細胞球內細胞不容易與培養基中營養物質接觸，后期會出現細胞凋亡及自噬等損傷；其次，內部細胞無法進行形態上的直觀觀察。既往研究[7]發現，SG 干細胞與腦來源神經干細胞的形態和生物學特性極其相似。而腦來源的神經干細胞多采用單層貼壁法培養，其優點在于細胞單層貼壁，減少了早期接觸抑制，并且與培養基接觸完全，便于營養物質的交換，更加有利于形態觀察和研究[8]。但SG干細胞的單層貼壁培養方式還鮮有研究報道。因此，本研究利用單層貼壁方式進行大鼠SG干細胞的培養，并首次與傳統懸浮培養法進行比較，對比兩種方法培養的SG干細胞形態、活性、純度、增殖能力及分化潛能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

新生1 天（Postnatal Day1，P1）的SD（Sprague-Dawley）由上海杰思捷實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號：20180004055508。

1.1.2 實驗試劑

改良Dulbecco 細胞培養液（Dulbecco’s odifiedm Eagle’s medium,DMEM／F12培養液;Invitrogen，美國），無血清培養液添加劑N2 和B27（Invitrogen，美國），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF；PeproTech，英國），堿性成纖維細胞生長因子（basic-fibroblast growth factor，bFGF；PeproTech，英國），胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-I,IGF1; PeproTech，英國)，脫氧核糖核酸酶I(Deoxyribo、nucleaseI,DNaseI;Worthington,美國)，大豆胰蛋白酶抑制劑(oybean trypsin inhibitor；Sigma，美國)，青霉素-鏈霉素溶液（Biosharp,中國），0.25%胰蛋白酶（Invitrogen，美國），胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS,Invitrogen，美國）Hanks’平衡鹽溶液（Hanks’balanced salt solution，HBSS；Solarbio,中國），Dulbecco的磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline，DPBS；Solarbio,中國），聚L-賴氨酸（Poly-Llysine，PLL，Sangon biotech，中國），活/死細胞染色試劑盒（Live/Dead Cell Staining Kit; Sciencell,美國），CCK8 試劑盒（CCK-8 Cell Counting Kit; Vazyme,中國）,Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit;Beyotime,中國)

1.1.3 免疫細胞化學染色抗體及試劑

鼠抗Nestin 單克隆抗體,克隆rat-401（sigma，MAB353）；兔抗SOX2多克隆抗體(abcam,ab97959)；鼠抗Ki67 單克隆抗體(abcam,ab279653)；兔抗beta III Tubulin 單克隆抗體（abcam,ab52623）；山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor? 488) (abcam,ab150113)；山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 555)（Thermo Fisher Scientific,A-21429)；Fluoroshield ?封固劑（含DAPI）（sigma,F6057）

1.2 實驗方法

1.2.1 新生大鼠SG干細胞的分離及培養

新生1d SD 大鼠（P1）經水合氯醛腹腔麻醉、75%乙醇浸泡消毒后，迅速斷頭處死，取出雙側顳骨置于4℃預冷的HBSS 溶液中；耳蝸完全暴露；剝除未骨化的蝸殼，沿蝸軸分離螺旋韌帶、血管紋及基底膜，再將螺旋神經節與蝸軸剝離，取螺旋神經節置于預冷的DPBS 溶液中。用Hanks’液清洗2次，使用0.125%胰蛋白酶37℃消化10min，每5min震蕩1 次；用內含10mg/ml 的大豆胰蛋白酶抑制劑和1mg/ml 的DNaseI 的DMEM/F12 培養液重懸細胞終止消化，吸管輕柔吹打，40μm 細胞濾網過濾，獲得均勻的單細胞懸液。一部分以2×105cell/ml 的密度接種于懸浮六孔板中進行懸浮培養；另一部分以相同的密度接種于預先經聚L-賴氨酸包被的培養板中進行單層貼壁培養。培養基為無血清培養基，成分為DMEM/F12（1；1）、N2（1：100）、B27（1：100）、EGF（20ng/ml）、bFGF（10ng/ml）、IGF-1（50ng/ml）、青-鏈霉素(1：100)，每3d半量換液一次。

1.2.2 細胞形態學觀察

倒置顯微鏡觀察細胞的形態及生長情況。

1.2.3 活/死細胞熒光染色

離心收集懸浮培養的SG干細胞，加入1ml含有1μl活/死細胞染液的PBS（1：1000）。室溫靜置10分鐘。熒光顯微鏡觀察。將單層貼壁培養的細胞的培養基吸去。加入1ml含有1μl 活/死細胞染液的PBS（1：1000）。室溫靜置10分鐘，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Annexin V/PI雙細胞熒光染色

離心收集懸浮培養的SG 干細胞，采用Annexin V-FITC/PI 雙標法檢測細胞凋亡,具體操作方法參照試劑盒(Beyotime)說明書進行。

1.2.5 SG干細胞免疫細胞熒光染色

將懸浮球狀和單層貼壁培養5d 的干細胞解離成單細胞，接種于經聚L-賴氨酸包被處理并置于24 孔板中的圓形玻片上,置于5% CO2培養箱37℃培養4h。4%的多聚甲醛固定20min，0.5% TritonX-100 37℃孵育10min,，5%山羊血清封閉30min。除去封閉液，分別加入一抗anti-Nestin 單克隆抗體（1：200）、anti-Sox2 多克隆抗體（1：200）、anti-Ki67單克隆抗體（1：100），4℃下孵育過夜；PBS 洗滌后加二抗Alex Fluor 488（1：500）、Alex Fluor 555（1：500），室溫避光孵育1 h，洗滌后DAPI 染色封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 SG干細胞分化及鑒定

為了分析分化潛能,將懸浮培養5 天的神經球接種在聚L-賴氨酸包被的蓋玻片上，次日換用干細胞誘導分化培養基（DMEM/F12、10%胎牛血清、0.1%青霉素-鏈霉素）誘導其分化,隔天換液,繼續培養3d，進行免疫熒光染色觀察。在貼壁培養中，SG 干細胞接種培養5 天后更換誘導分化培養基以誘導SG 干細胞分化，隔天換液,繼續培養3d，進行免疫熒光染色觀察。

1.2.7 生長曲線的測定

SG 干細胞分別以懸浮和單層的培養方式接種于96 孔板中，采取CCK-8 法于1d、3d、5d、7d 分別測定兩種培養方式所培養的細胞的生長曲線。

1.2.8 統計學處理

熒光顯微鏡在一個視野放大200 倍鏡頭下計數，用GraphPad Prism 8.0 進行統計分析，對所有數據均用±s表示，對差異顯著性進行t檢驗，以P＜0.05 為差異顯著性指標。

2 結果

2.1 懸浮和單層貼壁培養的SG干細胞的形態學觀察

經懸浮培養方式培養1-2 天后的細胞可見“細胞球”，隨著培養天數的增加，細胞球體積逐漸增大；絕大部分細胞球為實心細胞球，呈桑葚狀，細胞球內所含細胞數量不一，細胞球大小不一，周圍可見單個細胞。培養6-7d 時，部分細胞球出現中心顏色加深、透光性變差的現象（圖1A）。

以貼壁細胞培養方式培養的細胞，接種后6h，已有部分細胞貼壁并生長，細胞形態多呈橢圓形。隨后貼壁細胞迅速增多，多呈梭狀，并以簇狀分布，周圍可見單個細胞，有少部分細胞可見小突起。貼壁細胞單層排列，胞體透明，胞漿勻質，折光性良好（圖1B）。

圖1 不同培養方式下的SG 干細胞的光學顯微鏡形態照片。A：體外懸浮培養1、3、5、7 天；B：體外單層貼壁培養1、3、5、7天。7天時，懸浮培養(A)中較大細胞球出現暗色核心（藍色箭頭），可能為細胞死亡現象。Scale bar=50μm。Fig.1 Light micrographs of SG stem cells under different culture methods.A: In vitro suspension culture for 1,3,5,and 7 days; B: In vitro monolayer adherent suspension culture for 1,3,5,and 7 days.On day 7,larger spheroids in suspension culture (A) developed dark cores(blue arrow),likely due to cell death.Scale bar=50μm.

2.2 活/死細胞熒光染色

懸浮培養的神經球，經活/死細胞染色試劑盒熒光染色后可觀測到,神經球整體發綠色熒光，表明神經球細胞多為活細胞（圖2A）。單層貼壁培養的細胞經活/死細胞染色試劑盒熒光染色后細胞發綠色熒光，表明培養體系中的細胞多為活細胞（圖2B）。以上結果表明懸浮和單層貼壁兩種不同方式培養的SG干細胞均具備良好的生長狀態。

圖2 不同培養方式下的SG 干細胞的活/死細胞染色。(A)懸浮培養5天。(B)單層培養5天。綠色：活細胞，紅色：死細胞。Scale bar=100μm。Fig.2 Live/dead cell staining of SG stem cells under different culture methods.(A)Suspension culture for 5 days.(B)Monolayer culture for 5 days.Green:live cells Red,death cells.Scale bar=100μm.

2.3 Annexin V/PI雙細胞熒光染色

Annexin V/PI雙染法是檢測細胞凋亡和壞死的一個敏感且特異的方法,早期凋亡細胞即可表現為細胞膜被Annexin V 熒光染色(呈綠色熒光),晚期凋亡細胞膜染色(呈綠色熒光)的同時核DNA 被PI 染色(呈紅色熒光)，壞死細胞核DNA 被PI 染色(呈紅色熒光)。結果顯示以兩種不同的培養方式培養的細胞群中，凋亡以及死亡的細胞均很少（圖3），絕大部分細胞的均為活細胞。

圖3 不同培養方式下的SG 干細胞的Annexin V/PI 雙染色測定。(A)懸浮培養5 天。(B)單層培養5 天。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC 染色陽性細胞（Annexin V-FITC+），紅色為PI 染色陽性細胞（PI+）。Annexin V-FITC+：凋亡細胞。Annexin V-FITC+/PI+：壞死和晚期凋亡細胞。Annexin VFITC-/PI-：正常細胞。Scale bar=100μm。Fig.3 Annexin V/PI double-staining assay of SG stem cells under different culture methods.(A)Suspension culture for 5 days.(B)Monolayer culture for 5 days.The green fluorescence in the figure is Annexin V-FITC staining-positive cells(Annexin V-FITC+),and the red is PI staining-positive cells(PI + ).Annexin V-FITC + : apoptotic cells.Annexin VFITC+/PI+: necrotic and late apoptotic cells.Annexin VFITC-/PI-:normal cells.Scale bar=100μm

2.4 不同培養方式SG干細胞純度分析

通過免疫熒光染色，可以進一步分析和比較懸浮培養及單層貼壁培養的細胞的SG 干細胞純度。Nestin 是一種中間絲蛋白，Sox2 為轉錄因子家族中的一員，均在神經前體細胞中有大量表達,為神經干細胞的特異性標志蛋白。對經Nestin、Sox2 鑒定為雙陽性細胞進行細胞純度計算，結果顯示以懸浮方式培養的細胞群體中SG 干細胞的純度為（78.43±7.86）%，以單層貼壁方式培養的細胞群體中SG干細胞的純度為（74.42±10.57）%，SG干細胞純度差異無統計學意義(t=0.557;P=0.595,n=4)(圖3)。提示兩種培養方式均可培養出大量保持干細胞生物學特性、具有自我更新能力的SG干細胞。

2.5 不同培養方式SG干細胞增殖活性分析

Ki67是一種細胞增殖狀態的標志蛋白,主要表達于細胞增殖的的各個時期,但在靜息的細胞中不表達。我們用Ki67 和Sox2 對細胞進行雙重熒光標記,其中Ki67和Sox2雙標陽性的細胞為具有增殖特性和自我更新能力的SG 干細胞，這也進一步表明了SG 干細胞的增殖活性。免疫熒光測定結果顯示，懸浮培養中約有細胞群體中Ki67、Sox2 雙陽性的細胞占（9.99±1.03）%，以單層貼壁方式培養的細胞群體中Ki67、Sox2 雙陽性陽性的細胞占（15.64±0.55）%，Ki67、Sox2 雙陽性的干細胞所占比例差異有統計學意義（t=11.84;P＜0.0001,n=7）（圖4）。結果表明以這兩種不同的培養方式培養SGN細胞均可在相應的培養體系中增殖，但貼壁方式培養的細胞中Sox2、Ki67雙陽性的干細胞所占的比例較懸浮培養高，提示貼壁培養的干細胞的增殖活性較懸浮培養的干細胞強。

圖4 不同培養方式下的SG 干細胞純度對比。懸浮培養(A)和單層培養(B)第5天時，使用Nestin（綠色）和Sox2（紅色）特異性抗體對SG干細胞進行免疫熒光標記。C:Nestin/Sox2雙陽性細胞的定量化計算(n=4)。Scale bar=100μm。Fig.4 Purity comparison of SG stem cells under different culture methods.Suspension cultured (A) and Monolayer cultured (B) SG stem cells were subjected to immunofluorescence labeling using antibodies specific for Nestin(green)and Sox2 (red) at day5.Quantification of anti-Nestin and anti-Sox2 double-positive double-positive cells(n=4)(C).Scale bar=200μm.

圖5 不同培養方式下的SG 干細胞增殖活性對比。懸浮培養(A)和單層培養(B)第5 天時，使用Sox2（紅色）和Ki67（綠色）特異性抗體對SG 干細胞進行免疫熒光標記。C:Ki67/Sox2 雙陽性細胞的定量化計算。進行t 檢驗以計算顯著性差異(n=7,****P＜0.0001)。Scale bar=100μm。Fig.5 Comparison of the proliferation activity of SG stem cells under different culture methods.Suspension cultured (A)and Monolayer cultured (B) SG stem cells were subjected to immunofluorescence labeling using antibodies specific for Sox2 (red) and Ki67 (green) at day5.Quantification of anti-Ki67 and anti-Sox2 double-positive double-positive cells (C).The t-tests were performed to calculate significance (n=7,****P＜0.0001).Scale bar=100 μm.

2.6 不同培養方式SG干細胞的誘導分化能力鑒定

將兩種培養方式獲取的SG 干細胞經FBS 誘導分化后，均可觀察到類似SGN 形態的神經元樣細胞，大多數神經元樣細胞呈現類似雙極神經元形態，細胞胞體呈梭形，雙極伸出較長突起，長的達胞體的數倍，細胞狀態良好。神經元特異性管蛋白Ⅲ型(Neuronic-specific tubulin Ⅲ,Tuj1)是SGN 的特異性標志物之一。為了在形態學上鑒定SGN，應用Tuj1標記SGN進行免疫細胞熒光染色，結果顯示兩種培養方式經誘導后均可觀察到全細胞著色呈紅色熒光的SGN樣細胞，橢圓形胞體和神經突起十分清晰，表明具有神經元的特征。根據免疫熒光結果定量分析了SG干細胞向神經元方向的分化效率,即Tuj1陽性細胞占DAPI細胞的百分比。懸浮培養獲取的SG 干細胞向神經元方向的分化效率（3.94±1.18）%，貼壁培養獲取的SG 干細胞向神經元方向的分化效率為（4.70±0.94）%，其差異無統計學差異(t=1.008;P=0.352,n=4)（圖6）。提示兩種培養方式來源的SG 干細胞經過誘導分化后均可以形成螺旋神經元樣細胞，且其分化效率無統計學差異。

圖6 不同培養方式獲取的SG 干細胞的分化鑒定。懸浮培養(A)和單層培養(B)獲取的SG 干細胞應用FBS 誘導分化3d后，使用Tuj1（紅色）特異性抗體對分化的神經元細胞進行免疫熒光標記。明場圖像中的紅色箭頭表示具有雙極形態的神經元樣細胞，兩個神經突起生長在神經元胞體的兩極。C:Tuj1陽性細胞的定量化計算(n=4)。Scale bar=20μm。Fig.6 Differentiation identification of SG stem cells obtained by different culture methods.After SG stem cells obtained from suspension culture (A) and monolayer culture (B) were induced to differentiate by FBS for 3 days,the differentiated neuronal cells were subjected to immunofluorescence labeling using antibodies specific for Tuj1 (red).The red arrows in the bright field image indicate neuron-like cells with bipolar morphology,with two neurites growing at the two poles of the neuron cell body.C:Quantitative calculation of anti-Tuj1 positive cells(n=4).Scale bar=20μm.

2.7 生長曲線的測定

SG 干細胞在懸浮和單層的培養方式下均呈增殖趨勢。自第3 天后，單層貼壁培養的細胞數量每天都略高于懸浮培養的細胞數量（圖7），第3 天時懸浮培養細胞活性高于貼壁培養，其差異有統計學意義（t=7.97;P＜0.01,n=3），提示單層貼壁培養的細胞的增殖能力較懸浮培養的細胞強。兩種方式培養的干細胞增殖均在第5 天時達到巔峰，隨后細胞活性下降。懸浮培養細胞活性下降的速率較單層貼壁培養的細胞快，且懸浮培養細胞活性小于單層貼壁培養的細胞（培養第7 天），其差異有統計學意義（t=11.13;P＜0.001,n=3）。

圖7 不同培養方式下的SG 干細胞生長曲線。進行t 檢驗以計算顯著性差異(**P＜0.01，***P＜0.001,n=3)。Fig.7 Growth curves of SG stem cells under different culture methods.The t-tests were performed to calculate significance(**P＜0.01，***P＜0.001,n=3).

3 討論

SGN 再生是耳科學研究的熱點。利用干細胞誘導分化為SGN 是解決這一科學難題的重要研究方向[9-13]。2007年Oshima[14,15]分離了來自新生哺乳動物螺旋神經節部位的干細胞。目前已有研究證實[16-18]，SG 干細胞具有自我更新能力，可分化為類似于神經元和神經膠質的細胞。與其他來源的干細胞如間充質干細胞相比，SG 干細胞理論上分化為螺旋神經元的效率會更高，更容易分化為功能性的SGN 細胞。因此，利用SG 干細胞誘導分化為神經元能為SGN損傷后的修復提供高效手段。然而，SG 干細胞數量少，獲取困難，因此，進行穩定高效的體外培養使其獲得穩定增殖能力尤為重要。

既往研究多使用傳統懸浮培養法來培養小鼠的SG干細胞，SD大鼠的SG干細胞單層貼壁培養方式還鮮有研究報道。本研究嘗試用單層貼壁方式進行SD 大鼠SG 干細胞的培養，并首次與懸浮培養法進行了對比。研究結果證實單層貼壁方式培養同樣可獲得大量具有干細胞特異性的SG 干細胞，且獲得的SG 干細胞純度與傳統懸浮培養方式相比無統計學差異。本研究懸浮方式獲取的SG 干細胞純度與既往文獻懸浮方式培養的小鼠SG 干細胞純度[4]相似。

活、死熒光染色和Annexin V/PI 雙染檢測結果顯示兩種培養方式培獲得的SG 干細胞的生長狀態均良好，其中凋亡細胞和死細胞很少。誘導分化實驗結果證實，兩種培養方式培獲得的SG 干細胞均可誘導分化為SGN樣神經元細胞。

免疫熒光與生長曲線實驗證實，單層貼壁培養法獲得的SG 干細胞增殖活性較懸浮培養的干細胞強。這種差異的存在可能歸結于以下兩個原因。一．相比懸浮培養方式，SG 干細胞的單層貼壁可以顯著增加細胞與培養液的接觸面積，從而更有利于其充分獲取細胞因子刺激和營養成分滋養，因此增殖更快。二．貼壁培養更有利于SG 干細胞的快速穩定增殖可能與貼壁培養方式中使用聚L-賴氨酸（Poly-L-lysine，PLL）作為粘附基質有關。PLL是一種細胞外基質蛋白,可通過其上的正電荷與細胞膜的負電荷相互結合以促進細胞粘附與存活，在細胞培養中廣泛被用于包被物促進細胞貼壁，也是細胞增殖的合適基質。既往研究表明，PLL 可能同干細胞表面一些與細胞外基質相互作用的受體分子如整合素家族成員相結合,從而影響干細胞存活、遷移、增殖、分化等行為。例如Park 等[19]報道稱PLL 可以促進人類造血干細胞的離體擴增。也有報道[20]稱PLL 可以促進神經干細胞功能。近年來也有研究表明[21]，PLL 能夠為間充質干細胞的細胞培養提供良好的微環境，顯著促進間充質干細胞的增殖，并引起干性標記物基因表達的一致上調。此外，PLL 還可以增強細胞對培養基質的吸附，從而可能進一步提升干細胞的活力。

此外，懸浮方式培養的細胞進行免疫熒光等操作時，需要對細胞進行消化破球，不可避免地會損失一部分細胞，這可能是免疫熒光實驗中懸浮培養細胞密度低于貼壁培養細胞密度的原因。而SG 干細胞的貼壁培養可以有利避免消化破球時的細胞損傷，有益于對SG 干細胞進行穩定準確的定量研究，從而提供更精準科學的數據。

綜上所述，本研究創新性探索了SG 干細胞的單層貼壁培養方式，通過與傳統懸浮培養方式進行對比發現單層貼壁培養的SG 干細胞的增殖活性較懸浮培養的干細胞更強,更有利于細胞的形態觀察及定量。本研究提供了SG 干細胞培養的優越方式，不僅為進一步開展SG 干細胞的研究奠定了實驗基礎，也為該領域SG 干細胞的優化培養提供了方法學上的參考。