喀斯特山地生態養雞對土壤理化性質及菌群結構的影響

木仁 王鑫 格根圖雅 馬媛 冉田田 陳志 徐文斌 李靜

關鍵詞：喀斯特山地：生態養雞：土壤理化性質；土壤細菌：土壤真菌

蛋雞山地生態養殖條件下，因食物來源廣泛，補飼量減少，可達到一定節約飼料的效果，并可有效提高肉蛋品質。借助山地生態環境的立體復合生產經營，可提高土地利用效率，對企業／合作社和農戶的增收具有重要意義。因此，山地生態養殖已成為家禽行業的重要發展方向。有研究發現，香榧林下養鵝可改變土壤細菌、真菌群落結構，提高微生物多樣性；柑橘林下養雞可有效提高土壤養分含量，改善果品品質：但桑園種草養雞可導致土壤出現酸化趨勢．棗園林下長期養雞會破壞土壤物理性質。前人研究結果存在較大差異，主要與不同種養結合模式、地理環境及養殖條件等綜合因素有關。因此，有必要對不同區域、不同養殖條件下的土壤進行綜合評價，探索其變化規律，為生態養殖提供基礎情報?；诖?，本研究以喀斯特山地生態養雞場為研究對象，分別對養殖區、輪休區和未養殖區的土壤理化性質及菌群組成進行綜合評價，以期為喀斯特山地生態養雞提供參考。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗地位于貴州省長順縣鼓揚鎮某長順綠殼蛋雞山地生態養殖基地。該區域屬亞熱帶季風氣候，氣候溫和、雨量充沛、陰雨天氣較多，年平均氣溫16℃，年平均降水量1260mm。

1.2試驗設計

在同一地域，以山地放養為影響因素，分別設置養殖區（CA組：連續放養3個月的區域，養殖密度為每666.7m260只）、輪休區（RA組：連續3個月未放養區域）和未養殖區（NCA組：從未放養的區域）。每個區域面積約666.7m2，于2020年7月11日按五點取樣法采集0～20cm土層鮮土樣，每區域5份，共15份。

1.3土壤理化性質測定

參考陶彩蝶、盛茂銀等的試驗方法，采用環刀法測定容重；含水率測定采用烘干法（GB/7172-1987）；酸堿度用pH計（PHS-3C）測定；全氮含量測定采用凱氏定氮法（LY/T 1228-2015）；全磷和全鉀含量的測定采用堿熔法（LY/T1232-2015和LY/T 1234-2015）。

1.4土壤菌群結構測定

利用Magen Hipure Soil DNA Kit提取土壤總DNA，使用Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度。參考木仁等的方法對細菌16SrRNA V3-V4區進行擴增，引物為F：5'-CCTACG-GRRBGCASCAGKVRVGAAT-3和R：5'-GGACT-ACNVGGGTWTCTAATCC-3。參考王燦等的方法對真菌ITS2區進行擴增，引物為F：5 7-GT-GAATCATCGARTC-3禾口R：5 7-TCCTCCGCTTAT-TGAT-3'。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過酶標儀（ Tecan，Mannedorf，Switzerland）檢測文庫濃度后，按Illumina MiSeq（ Illumina，SanDiego，CA，USA）儀器使用說明書進行雙端測序。測序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.5數據處理與分析

參照相關文獻對數據進行整理，在97%相似水平下對所有序列進行OTU（operationaltaxonomic units）劃分，并進行生物信息統計分析，得到OTU代表序列。代表序列與Silva 132和U—NITE ITS數據庫進行比對，得到OTU對應的物種分類信息?；赒iime 1.g.1計算Alpha多樣性指數。將土壤理化性質、Alpha多樣性及菌群豐度數據導人SPSS 23.0軟件，滿足正態分布和方差齊性檢驗條件的數據運用單因素方差分析中的LSD法進行多重比較，不滿足正態分布條件的采用非參數檢驗中的Kruskal-Wallis法，結果均以平均值±標準差表示?；贑anoco5對土壤理化性質和菌群結構進行冗余分析（RDA）。采用Pearson相關分析探究土壤理化性質與菌群豐度間的關系。

2結果與分析

2.1不同處理土壤理化性質比較

由圖1可知，土壤pH值從高到低的順序為NCA>RA >CA，處理間差異極顯著。含水率從高到低的順序為NCA>CA>RA，NCA與CA間差異顯著，與RA間差異極顯著。容重從高到低的順序為RA>CA>NCA．RA與CA和NCA間差異極顯著。全氮含量不同處理間差異不顯著。全磷含量從高到低的順序為CA >RA >NCA，CA與NCA間差異顯著。全鉀含量從高到低的順序為CA>RA>NCA，CA與RA間差異顯著，與NCA間差異極顯著。

2.2不同區域土壤菌群測序結果

由表1可知，CA、RA和NCA組細菌的原始序列在53303條以上，有效序列50167條以上，平均序列長度分別為451、455、454 bp，OTU數在5952個以上。CA、RA和NCA組真菌的原始序列43709條以上，有效序列數34706條以上，平均序列長度分別為338、349、350bp，OTU數在270個以上。

由圖2A可見，三組共有細菌OTU 4141個，CA組特有3113個，RA組特有5 497個，NCA組特有7637個。三組共有真菌OTU224個，CA組特有55個，RA組特有112個，NCA組特有99個（圖2B）。

2.3不同區域土壤菌群Alpha多樣性分析

如表2所示，土壤細菌Alpha多樣性分析發現，RA組的Ace指數和Chaol指數最高，顯著高于CA組。RA和NCA的Shannon和Simpson指數極顯著高于CA組。真菌Alpha多樣性分析發現，RA組的Ace指數顯著高于CA組，極顯著高于NCA組，CA組顯著高于NCA組。RA組的Chaol指數極顯著高于NCA組．CA組的Chaol指數顯著高于NCA組。Shannon指數和Simpson指數各處理差異不顯著。

2.4不同區域土壤門水平上細菌和真菌相對豐度

共注釋到46個門的細菌，相對豐度高于1%的有12個。如表3所示，變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為各組優勢菌門。與CA組相比，RA和NCA組的變形菌門、擬桿菌門、Latescibacteria和Rokubacteria的相對豐度增加，其中NCA組的變形菌門、擬桿菌門和Latescibacteria顯著或極顯著增加。與CA組相比，RA和NCA組的酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、厚壁菌門和Patescibacteria的相對豐度降低，其中NCA組的酸桿菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門顯著或極顯著降低。NCA組的綠彎菌門極顯著高于CA和RA組．NCA組的疣微菌門極顯著低于RA組。

本研究共注釋到12個門的真菌，相對豐度高于1%的有6個。如表4所示，子囊菌門、擔子菌門和毛霉門為各組優勢菌門，并存在大量未知真核生物（k_Eukaryota_ Unclassified）。與CA組相比，RA組的毛霉門極顯著增加，NCA組的毛霉門顯著降低。

2.5不同區域土壤理化性質與茵群群落結構間的關系

土壤理化性質與主要細菌群落結構的RDA分析（圖3）表明，第一、第二軸的解釋率分別為47.32%和25.12%，土壤pH值、全氮含量分別極顯著、顯著影響細菌群落結構。pH值與擬桿菌門呈極顯著正相關，與變形菌門和Latescibacteria呈顯著正相關，與酸桿菌門和厚壁菌門呈極顯著負相關，與放線菌門呈顯著負相關。全氮含量與疣微菌門呈極顯著正相關，與硝化螺旋菌門呈顯著正相關，與綠彎菌門呈極顯著負相關。

土壤理化性質與主要真菌群落結構的RDA分析（圖4）表明，第一、第二軸的解釋率分別為38.32%和24.10%．全鉀含量和容重顯著影響真菌群落結構。全鉀含量與子囊菌門呈極顯著正相關，與k—Eukaryota—Unclassified呈顯著負相關。容重與毛霉門和壺菌門呈顯著正相關。

3討論與結論

土壤pH值、氮、磷和鉀等土壤物理及養分特性是評價土壤系統質量的重要指標。王介平等研究發現，桑園種草養雞后土壤出現酸化趨勢，并認為這一趨勢與雞糞中有機質被土壤中微生物分解成有機酸等因素有關。陶彩蝶研究發現，在香榧林下養鵝導致土壤容重增高、含水率降低，并認為該現象與鵝長時間踩踏及植被減少而導致的土壤板結、滲透性弱有關。周乃富等研究發現，油茶林下養雞使土壤中鉀和磷的含量增加。以上結果與本研究的養殖區（CA）pH降低、容重增加、含水率降低及鉀、磷含量增高的結果相近。表明喀斯特山地長期連續養雞可造成土壤酸化、持水力減弱，鉀、磷含量增加。

細菌是土壤微生物中的最大類群，也是評價土壤健康與否的重要微生物指標之一。Chaol指數和Ace指數用來度量菌群豐富度，Shannon指數和Simpson指數可以反映物種多樣性。王永宏等研究發現，短期牦牛重度放牧可導致土壤細菌Alpha多樣性呈減少趨勢。臧曉琳等研究發現，重度放牧條件下，冷蒿根際土壤微生物群落Shannon指數和Simpson指數極顯著降低（P<0.01）。本研究發現，養殖區細菌Alpha多樣性指數最低，并且相對于未養殖區（NCA），Shannon指數和Simpson指數極顯著降低，與前人研究結果相近。輪休區（RA） Alpha多樣性指數最高。表明喀斯特山地長期連續養雞可造成細菌豐富度和多樣性降低，但輪休后可得到良好恢復。

真菌是土壤中非?；钴S的一類微生物群體，具有多種功能，包含有機質的降解等，與土壤健康密切相關。黃維等研究發現，隨著放牧強度的增加，荒漠草原非植物根際土壤中可培養真菌的總量呈下降趨勢，尤其是表層（0～10cm）土壤中的真菌數量。楊晶晶等研究發現，重度放牧導致伊犁絹蒿荒漠草地土壤真菌Chaol指數顯著降低（P<0.05），Shannon指數無顯著變化。但陶彩蝶研究發現，香榧林下養鵝導致鵝活動區土壤真菌Chaol、Ace及Shannon指數增加，但不顯著（P>0.05）。本研究發現，養殖區和輪休區（RA） Chaol指數和Ace指數顯著或極顯著高于未養殖區，與前人研究結果具有一定差異。指數變化表明，喀斯特山地養雞可導致土壤真菌豐富度明顯增加，但物種多樣性有所降低（Shannon指數最低）。輪休后真菌豐富度增加，物種多樣性也得到一定恢復（Shannon指數最高）。

本研究發現，土壤細菌的優勢菌門為變形菌門（36.452%～42.378%）、酸桿菌門（23.362%～31.836%）和擬桿菌門（4.710%～11.488%）。相對于未養殖區，養殖區的變形菌門和擬桿菌門顯著或極顯著降低，酸桿菌門極顯著增加。相關研究表明，荒漠草原放牧后土壤變形菌門豐度降低；高寒草地放牧區變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門均表現出降低趨勢，但無顯著差異（P>0.05）：香榧林下養鵝導致鵝活動區酸桿菌門豐度顯著下降（P<0.05）。以上研究的變形菌門和擬桿菌門變化趨勢與本研究相近，但酸桿菌門相對豐度變化與本研究有較大差異，具體原因需進一步探索。

本研究土壤優勢真菌為子囊菌門（17.453%～31.368%）、擔子菌門（13.295%～19.737%）和毛霉門（7.253%～21.492%），并存在大量未知真核生物（k_Eukaryota—Unclassified，36.706%～52.867%）.大量研究表明，土壤優勢真菌為子囊菌門和擔子菌門，與本研究結果相近，但不同區域優勢菌門豐度具有較大差異。本研究發現，相對于未養殖區，養殖區和輪休區的子囊菌門和毛霉門表現出增加趨勢，擔子菌門和k_Eukaryota_Unclassified表現出下降趨勢。前人研究發現，荒漠草原放牧后土壤子囊菌門的相對豐度降低，擔子菌門的相對豐度升高。香榧林下養鵝、稻田養鴨后土壤子囊菌門豐度顯著下降（P<0.05），與本研究結果相比具有較大差異。土壤真菌群落組成除受地表植被、地理環境和土壤類型等因素影響外，還可能受到放養動物類別的影響，因此，土壤真菌豐度的差異性需從多種因素綜合考慮。

土壤為微生物的生存提供了環境條件，并認為土壤pH值和容重及水分、氮、磷和鉀含量是影響土壤菌群結構的重要因子。本研究RDA分析發現，土壤pH值、全氮含量分別極顯著、顯著影響細菌群落結構。土壤pH值與6種細菌菌門豐度、全氮與3種細菌菌門豐度呈顯著或極顯著相關性。表明土壤pH值和全氮含量為細菌群落結構的主要影響因素。土壤全鉀和容重顯著影響真菌群落結構，與細菌群落結構的主要影響因素具有一定差異．這可能與以上菌群的功能特性及環境互作機制有關。

綜上所述，喀斯特山地長期連續養雞可導致土壤酸化、持水力減弱及鉀、磷含量的增加；并造成細菌豐富度和多樣性及真菌多樣性的減少，而且對菌群結構具有較大影響。輪休后以上情況得到較好改善。因此，在山地生態養殖中，應避免同一地點連續養殖，并制定科學合理的輪休機制。