MutYH相關息肉病患者的基因變異特點分析*

趙子夜，汪昭明，高顯華，尹書怡，鄭建明，方瑞華，邢俊杰，王顥，張衛，于恩達△

1 上海長海醫院肛腸外科/遺傳性結直腸癌篩查防治中心 上海 200433

2 上海長海醫院病理科 上海 200433

遺傳性結直腸癌綜合征是一類具有遺傳背景的結直腸癌。目前發現的遺傳性結直腸癌均為單基因遺傳病。在過去的20年里，醫學界對遺傳性結直腸癌綜合征，尤其是息肉病型遺傳性結直腸癌綜合征（即結腸息肉?。┑恼J識和理解有了快速而廣泛的提高。結腸息肉病可根據息肉的病理性質和數量進行分類。若能明確致病或變異基因，則可獲得遺傳學診斷。美國胃腸病學會（American College of Gas?troenterology，ACG）指南明確了結腸息肉病的7種類型，并提供了具體的診斷和治療建議。這7中類型分別是家族性腺瘤性息肉?。╢amilial adenomatous pol?yposis，FAP）、衰減型家族性腺瘤性息肉?。╝ttenu?ated familial adenomatous polyposis，AFAP）、MutYH相關息肉?。∕utYH-associated polyposis，MAP）、黑斑息肉綜合征（Peutz–Jeghers syndrome，PJS）、幼年性息肉?。╦uvenile polyposis syndrome，JPS）[1]、PTEN錯構瘤腫瘤綜合征/Cowden 綜合征（PTENHamartoma Tumor Syndrome/Cowden syn?drome，PHTS/CS）及鋸齒狀息肉病綜合征（serrat?ed polyposis syndrome，SPS）[2]。隨著基因檢測和分子診斷技術的發展，通過識別遺傳學改變對結腸息肉病進行分型已經成為可能并逐漸形成趨勢，這對遺傳咨詢、家系風險評估大有幫助。

結腸腺瘤性息肉?。╟olorectal adenomatous pol?yposis，CAP）是最常見的結腸息肉病類型。MutYH（原名MYH）較早（2002年）被證實為CAP 的致病基因，由Al-Tassan 等[3]在英國威爾士地區的一個CAP家系中發現。此類CAP表型多為AFAP，在明確致病基因后命名為MAP，人類孟德爾遺傳在線（https://omim.org/）分類名為 FAP2 型（OMIM 608456），是一種常染色體隱性遺傳病。MutYH即mutY homolog，意為大腸桿菌腺嘌呤DNA 糖基化酶的同源基因，是DNA 修復途徑——堿基切除修復（base excision repair，BER）的成員之一。堿基切除修復途徑的另一個成員——NTHL1，也可導致CAP和結直腸癌[4]。MutYH功能缺失可引起基因組中特異性的G>T顛換[5]，由此可導致病理學及分子生物學方面一系列獨特的改變。目前已在MAP 和結直腸癌患者中發現了100 多種MutYH致病性變異（www.lovd.nl/MUTYH），相關病例大部分屬于歐美學者報道的高加索人種[6]。MAP 在東亞人群[7]中鮮有報道，其變異特點、臨床表現及病理特征尚未得到全面描述。本研究基于本中心MAP 患者的臨床資料，分析基因變異及臨床病理特征，并部分呈現中國MAP 患者的臨床和遺傳學特點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

上海長海醫院遺傳性結直腸癌篩查防治中心登記有各類息肉病患者共500 多例。筆者團隊于2020年12月對其中166 例CAP 患者進行了結直腸癌相關致病基因胚系突變檢測。從醫院信息系統（hospital information system，HIS）獲取CAP 患者的臨床信息和家系信息，并通過隨訪補充部分信息?；颊咴谧≡夯螂S訪期間被招募進入CAP 監測及研究計劃，其結腸病變石蠟包埋標本保存于長海醫院病理科，患者及其親屬的外周血及口腔黏膜標本于隨訪時獲取。所有患者在入院時均簽署知情同意書，并授權使用其臨床信息及生物標本。此外，在隨訪期間補充采集的標本也均獲得患者及其親屬的知情同意和書面授權。本研究經醫院倫理委員會審批通過。

1.2 納入與排除標準

納入標準：臨床診斷為CAP 的患者且經MutYH胚系變異檢測明確為MutYH基因雙等位基因變異攜帶者（純合變異或復合雜合變異），此類患者親屬若經基因檢測證實為相同變異攜帶者（雙等位基因變異）也納入研究。排除標準：生物樣本不能滿足檢測所需，拒絕參與研究，關鍵臨床信息缺失。

1.3 研究方法

采用動物基因組DNA 提取試劑盒提取生物標本的基因組DNA。采用Sanger 測序、下一代測序（next generation sequencing，NGS）或多重連接探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplifica?tion，MLPA）等技術進行MutYH變異檢測。NGS 及其涉及的DNA 提取、PCR 擴增等實驗內容由上海鑒研生物技術公司完成。Sanger測序及其涉及的MutYH的16 個外顯子擴增等實驗內容由上海邁浦生物技術公司完成，具體實驗方法可參考文獻[8]。MutYH的擴增引物及測序引物見表1。

表1 MutYH基因外顯子擴增及測序引物

對于NGS 未檢出致病變異的CAP 患者（即未發現APC致病變異及MutYH雙等位基因變異者），由病理科醫師復查病理切片結果，再次確認其臨床診斷。非CAP 患者終止試驗，確診為CAP 的患者繼續進行APC及MutYH的MLPA 實驗。MLPA 實驗使用SALSA MLPA Probemix P043 APC 試劑盒，該試劑盒包含MutYH的第1、第2、第11、第16號外顯子檢測探針。由上海生工生物工程公司完成，具體實驗方法可參考文獻[9]。使用coffalyser 軟件解讀結果（www.mlpa.com/coffalyser）。

1.4 臨床數據收集及指標分析

本研究將攜帶MutYH雙等位基因變異（復合雜合變異/純合變異）的患者診斷為MAP，總結其Mu?tYH變異及臨床表型。根據息肉數量將CAP分為衰減型CAP（息肉數量10～99枚）和經典型CAP（息肉數量≥100 枚），其中經典型CAP 可進一步分為稀疏型CAP（息肉數量100～1 000 枚）和密集型CAP（息肉數量>1 000 枚）。匯總分析患者的息肉/腫瘤病理結果，包括內鏡切除標本和手術標本的病理性質、錯配修復（mismatch repair，MMR）蛋白表達情況（錯配修復功能完整或缺失），以及KRAS基因突變情況。其中，MMR 蛋白完整表達稱為錯配修復完整（MMR proficient，pMMR），MMR蛋白表達缺失稱為錯配修復缺陷（MMR deficient，dMMR）。

1.5 統計學方法

使用SPSS 25.0 進行統計分析，計量資料以M（QL，QU）表示；計數資料以[n(%)]表示。

2 結果

2.1 變異檢測及致病性分析

在166 例CAP 患者中，10 例患者攜帶MutYH雙等位基因變異，修正診斷為MAP。在這10 例攜帶MutYH雙等位基因變異的患者中，有2例患者屬于同一家系（MAP-2），共確認了9 個MAP 家系，見圖1（MAP-6/7 無詳細家系信息）。僅MAP-5 家系為純合變異，其余均為復合雜合變異。其中6 個家系（MAP-1/2/3/4/5/7）中的8種變異（c.55C>T、c.799C>T、c.467G>A、 c.1435G>T、 c.733C>T、 c.1187G>A、c.857G>A、c.1214C>T）已被報道，另外5 種變異（c.307T>G、 c.1047G>A、 del exon2、 del exon11、del exon16）在數據庫（dbSNP，ClinVar，ExAC，HG?MD，LOVD）中未見報道或記錄，4種變異（c.55C>T、c.799C>T、c.857G>A、del exon2）在本隊列中重復檢出（表2）。上述13種變異中，10種為點突變/單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV），3 種為大片段缺失，屬于拷貝數變異（copy number varia?tion，CNV）。SNV 中的5 種無義變異（c.55C>T、c.467G>A、c.799C>T、c.1047G>A、c.1435G>T）和3種CNV（del exon2、del exon11、del exon16）均可導致MutYH蛋白截短或降解，可直接判定為致病變異。c.1187G>A是最早發現于高加索人種中的始祖變異，且在歐洲MAP 患者中多次檢出，可判定為致病變異[10]。另外4 種錯義變異（c.307T>G、c.733C>T、c.857G>A、c.1214C>T）會導致單個氨基酸的替換，根據PolyPhen-2工具（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）預測均可導致顯著的功能改變（圖2）。綜合人群（不可用）、計算機預測（相同氨基酸改變已被證實為致病變異/PS1）、功能學（不可用）、分離（與MAP表型共分離/PP1）、新發變異（不可用）、其他信息（患者表型高度特異/PP4）等數據分析致病性，根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（Ameri?can College of Medical Genetics and Genomics，AC?MG）標準[11]最終判定上述4 種錯義突變均為可能致病變異（1PS+2PP）。

圖1 MAP家系圖

表2 先證者所攜帶的MutYH基因變異

2.2 臨床表現

10例MAP患者分屬9個獨立家系，除MAP-5家系存在近親結婚且為MutYH純合變異外，其余8個家系中未發現近親結婚，致病變異為復合雜合變異（圖1）。10例MAP患者中，有6例結腸息肉數量不足100 枚，屬于衰減型CAP；其余4 例息肉數量大于100 枚，但不足1 000 枚，屬于經典型（稀疏型）CAP（圖3A、圖3B），病理證實均為腺瘤（圖4A、圖4B）。1 例患者罹患胃息肉?。∕AP-7 1）（圖3C）。這10例MAP患者接受治療時，6例已發生結直腸癌（圖3D、圖4C），1例發生腺瘤高級別上皮內瘤變（表3）。6例結直腸癌患者中的5例術后標本進行了KRAS基因檢測和免疫組化實驗，其中4 例為KRAS突變型，2 例為dMMR。10 例患者中，1 例始終采取結腸鏡治療；9 例接受外科手術治療（其中1人接受兩次手術），其中3 例接受全大腸切除術（2例回腸儲袋肛管吻合、1例回腸造口術）（圖3E、圖3F），5例接受全結腸切除術（回腸直腸吻合），1例接受次全大腸切除術（升結腸肛管吻合）。1例患者術后15個月死于結腸癌肝轉移（MAP-8 Ⅱ:1）。10例MAP 患者的中位發病年齡為42（27，62）歲，中位治療年齡為48（31，62）歲。發生癌變的6 例MAP患者中，經典型CAP 和衰減型CAP 各3 例，治療年齡分別為41 歲、43 歲、58 歲，31 歲、48 歲、62歲。MAP-2 家系中的2 例患者均從42 歲開始內鏡監測，癌變者手術時年齡為48 歲，未癌變者手術時年齡為53歲（表3）。

圖3 部分MAP患者的內鏡圖

圖4 部分MAP患者的病理結果圖

表3 MAP患者的表型特征

表3（續）

3 討論

根據致病基因的不同，CAP 可分為APC相關息肉?。ˋPC-associated polyposis，AAP）、MAP、AX?IN2相關CAP、聚合酶校對相關息肉?。╬olymerase proofreading associated polyposis，PPAP）及結構性錯配修復缺陷綜合征（constitutional mismatch re?pair deficiency syndrome，CMMRD）[12]。由于臨床診斷時通常不能獲得基因檢測結果，CAP 既往幾乎均被診斷為FAP，暗示著APC是最可能的致病基因，其在CAP患者中的檢出率為70%～90%。隨著CAP患者數量的增加，越來越多的CAP 患者被發現不攜帶APC基因變異，而發現了其他CAP 相關基因。本研究在166 例CAP 患者中鑒定到10 例MAP 患者，分屬9個獨立家系。經典型CAP患者4例，衰減型CAP患者6 例。這10 例患者的中位發病年齡為42 歲，平均發病年齡為48 歲，診斷時癌變比例為6/10，均與文獻報道相似[13]。MAP患者腫瘤的KRAS突變型比例為4/5，dMMR 也存在（2/5）。在9 個家系18 個MutYH變異中有非重復變異13 種，其中5 種未見于既往報道，且有大片段缺失CNV 3種。既往應用MLPA檢測MutYH的CNV僅見于兩項研究[14-15]，本研究結果提示該基因CNV 存在的客觀性，尤其對于SNV 檢測未發現致病變異者，一定要完善CNV 檢測以避免得出假陰性結論。

由結腸息肉病綜合征導致的結直腸癌僅占1%～3%，且不同CAP 在臨床表現上并不存在明確界線而是相互混雜，因此目前無法僅憑臨床表現確診一種CAP，這一情況在無家族史的患者中尤其明顯。對MAP 這類隱性遺傳病而言，可能引起混雜的因素至少包括以下兩個：（1）罕見的跨世代家族史；（2）息肉數量極少以致不能引起醫師對CAP 的懷疑。MAP 總體上具有息肉數量較少、發病時間較晚、腸外表現不鮮明的特點，因此現階段確診MAP 的時間總體上是落后的，很多患者確診時已有癌變。在基因診斷方法改進和介入時機恰當選擇上進行嘗試是提升MAP 診療效果的必由之路。同時，結合在散發性結直腸癌中發現MutYH雙等位基因變異的事實綜合分析，一旦實現早期診斷，極有可能面對MAP 表型進一步復雜化的情況，尤其當面對未生長結腸息肉或息肉數量極少而不能達成CAP 診斷標準時，需要考慮對MAP 進行重新定義，類似于BMPR1A相關息肉病的情況[16]。

MutYH作為一種BER 基因，其蛋白產物可以修復DNA的特定氧化損傷，降低DNA復制過程中的錯誤概率[17]。因為MutYH有多種轉錄本及蛋白異構體，所以在識別該基因變異的歷程中經歷過若干次參考序列的改變，當前參考轉錄本為NM_001128425，包含氨基酸殘基549個，對早期文獻報道及數據庫記錄的變異應注意對序列差異的識別。p.Y179C 和p.G396D在高加索人種MutYH變異中約占80%[6]，被認為是歐洲的“始祖變異”。Aretz等[18]專門對這兩個變異的發生時間進行推算，得出這兩個變異分別出現于約305世代和350世代之前，即公元前8 000—4 000年的新石器時代。有關MAP的早期文獻和部分地區的報告中存在著較高比例的純合變異患者（6/7和13/13）[19-20]，這與本研究隊列顯著不同（1/9），其中的重要原因在于我國的計劃生育制度很大程度避免了近親結婚的出現。因為已確診的MAP 患者數量有限，其基因型—表現型相關性分析較難開展。來自英國加迪夫大學、德國波恩大學和荷蘭萊頓大學的數據共匯總了257 例MAP 患者信息用于相關性分析，得到的核心結論是p.Y179C導致臨床表現更嚴重而p.G396D相對較輕，臨床現象與體外實驗結果一致[21]。但上述結論的意義相對有限，僅能對攜帶上述“始祖變異”的個體提供預測信息，對其他族群或其他變異攜帶者并不具有參考價值。再分析腸外表現時病例數增加到了276例，結果發現十二指腸腺瘤最為常見，發生率為17%～34%[22]。本研究僅1例患者在胃鏡檢查中發現胃息肉病，說明我們在臨床實踐中對此類患者上消化道的監測較為薄弱。研究數據還提示MAP 患者的膀胱癌、卵巢癌的風險有所增加，值得進一步關注。

隱性遺傳病致病變異往往以一定的比例廣泛存在于人群中，且具有人群特異性。歐美國家的數據表明，MutYH雜合變異攜帶者在無癥狀人群中的比例為1%～2%，按照隱性遺傳病發生率粗略計算方法推斷，MAP 的自然發生率為（2.5～10）/10 萬。MutYH變異雜合攜帶者雖然不會發展為CAP，但其罹患結直腸癌、胃癌、子宮內膜癌的風險也有所增加[23]。美國、加拿大、澳大利亞的結直腸癌匯總數據表明，結直腸癌患者攜帶MutYH雜合變異的比例高達1/45[24]，這表明散發以及無息肉病表現的結直腸癌患者中存在著相當數量的MutYH變異攜帶者，那么Mu?tYH變異所導致的特異性病理學及分子生物學特征對于識別此類患者具有重要的價值。目前已經發現MAP 患者除發生結腸腺瘤外，可能同時存在增生性息肉和鋸齒狀病變（息肉/腺瘤）[25]。鋸齒狀病變的特點是不經過經典腺瘤癌變途徑而發生癌變，可伴隨BRAF突變、KRAS突變、微衛星不穩定性等特征。另一方面由于MutYH功能缺失會導致基因組內大量G>T 顛換，導致MAP 相關結直腸癌具有較高比例的KRAS突變發生，也可以導致MMR 基因的變異繼而引起dMMR腫瘤的發生。Lynch綜合征在結直腸癌中占比約為3%，與此同時，具有dMMR表現卻無相應MMR 基因及其相關基因胚系變異的Lynch 樣綜合征占比也接近3%，其中部分患者可檢測到MutYH雙等位基因胚系突變[14]。上述現象存在廣泛重疊，其深層次原因值得進一步研究?，F階段臨床實踐中需要注意：（1）加強KRAS突變型結直腸癌患者的MutYH胚系突變檢測；（2）dMMR不是排除MutYH胚系突變的標準。

本研究的不足之處主要有以下兩點：（1）樣本量太小以至于不能進行統計推斷。雖然研究呈現出了息肉病表型與癌變比例無顯著相關、腫瘤KRAS突變型比例高（4/5）、dMMR比例低（2/5）等與既往研究接近的結果，但不能獲得統計推斷的佐證。（2）沒有進行非息肉病結直腸癌患者的MutYH胚系檢測，從而不能進行兩組間的對比，不能獲得進一步的基因型—表現型數據。以上缺陷值得進一步積累數據或進行多中心研究來獲得更可信、更有價值的結果。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關的利益沖突。