新型ISSR分子標記鑒別香菇雙單雜合子

吳圣進　張芳芳　陳雪鳳　劉增亮　張雯龍

關鍵詞：香菇；新型ISSR；雙單雜交；雜合子；分子鑒別

中圖分類號：S961.6 文獻標識碼：A

香菇是我國傳統的菜肴，其味道鮮美、營養豐富，深受人們的喜愛。香菇的人工栽培歷史悠久，近20 年得到迅猛發展，已成為我國栽培規模最大的食用菌品種，年產量達900 多萬t[1]。我國培育出的優良香菇品種不斷增長，為香菇產業的快速發展做出了卓越貢獻[2]。

香菇雜交育種是其新品種選育中最常用、最有效的技術手段，主要包括單單雜交與雙單雜交2 種方法。雙單雜交是以2 個親本中的一個親本的單核體作為受體，以能提供所需優良性狀的另一個親本雙核菌株為供體，其一個核進入受體細胞完成配對的非對稱雜交方法。雙單雜交具有雜交后代篩選工作量相對少、育種周期相對短等優點，從而被廣泛應用[3-6]。

雜交后代的鑒定篩選是香菇雜交育種過程中的關鍵步驟之一，傳統方法通過拮抗試驗和顯微觀察菌絲是否存在鎖狀聯合結構進行判別，非常費時、費工，而且效率低、誤判率高。隨著分子生物技術的快速發展，分子標記技術被越來越多的應用于食用菌雜交育種中，其中ISSR（intersimplesequence repeat）作為一種常用的分子標記，具有穩定性好、可重復性高、引物通用等優點，被廣泛應用于食用菌的遺傳差異分析[7-9]。ISSR 標記已成功應用于香菇單孢雜交后代的分析，王麗寧等[10]應用ISSR 標記分析耐高溫的香菇單孢雜交子時，發現與親本存在一定遺傳差異；宋瑩等[11]利用ISSR 標記分析發現，香菇單孢雜交菌株0912 同時含有2 個香菇親本菌株的特異性條帶，從而判定0912 為兩親本的雜交后代；陳世通等[12]利用ISSR 標記成功從84 個香菇單孢雜交菌株中篩選出45 個真正的雜合子。本研究將ISSR分子標記技術拓展應用于香菇雙單雜交后代的鑒別篩選，同時通過區分供體核對雜交子進行歸類分組，以期為香菇優異單核體菌株材料的創制和篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇親本菌株808 和YX7 均由廣西壯族自治區農業科學院微生物研究所提供。菌株808 是廣西推廣栽培品種，具有外觀品質好，栽培產量高等優良性狀；菌株YX7 是廣西農業科學院微生物研究所分離馴化自廣西野生香菇的菌株，具有較耐高溫、香味濃、出菇早等優良性狀。PDA 培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 孢子單核體菌株的獲取 親本香菇菌株808 栽培出菇后，選擇菇形圓整、開傘七八分的子實體，在無菌環境下采集孢子。采用稀釋涂板法分離單孢子[10， 13]，菌絲萌發并純化一次后，顯微鏡檢測3 次無鎖狀聯合結構的判定為單孢菌株，試管培養保存備用。

1.2.2 雙單雜交及雜交菌株的獲得 參照程爽爽等[14]的方法，將分離自菌株808 的不同孢子單核體菌株，分別與供體親本雙核菌株YX7 同時接種到PDA 平板上進行兩兩配對雜交，兩菌株接種點相距1.5 cm，于25℃下培養15 d，挑取單核體菌株遠離供體親本菌株一邊的菌絲塊接種于新的PDA 平板上純化2 次，保存，作為候選雜交菌株。

1.2.3 雜交子的鏡檢和拮抗試驗 挑取候選雜交菌株菌落邊緣不同部位菌絲，置于顯微鏡下觀察是否存在鎖狀聯合結構。同時挑取候選雜交菌株菌絲塊，接種于新的PDA 平板上，分別與2 個親本菌株對峙，于25℃下培養15 d，觀察候選雜交菌株與兩親本菌株的拮抗反應情況。

1.2.4 ISSR 分析 將親本菌株和候選雜交菌株分別接種至鋪有玻璃紙的PDA 平板上，于25℃下培養10 d，收集菌絲，采用吳圣進等[9]的方法提取基因組總DNA。ISSR-PCR 反應體系為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL ， Primer 1 μL（10 μmol/L），模板DNA 1 μL（150 ng），ddH2O8 μL。PCR 反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，按表1 所列退火溫度下復性45 s，72℃延伸90 s，循環35 次；72℃延伸7 min，4℃保存。擴增產物采用含有GelRed 染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并于凝膠成像系統中觀察拍照。

1.2.5 ISSR 綜合分析 首先比較2 個親本菌株間的條帶（圖1），相同ISSR 引物下，2 個親本菌株的PCR 電泳條帶中，僅菌株808 擁有的DNA 條帶為該菌株的特異性條帶（圖1 中的箭頭a 所示條帶）；與此相同，僅菌株YX7 擁有的DNA 條帶則為菌株YX7 的特異性條帶（圖1 中的箭頭b 所示條帶）；相同大小位置，菌株YX7 和808 都有的DNA 條帶設為共同條帶（圖1 中的箭頭c 所示條帶）。檢測記錄每個雜交子菌株的電泳圖譜是（標記為●）否（標記為○）存在上述3 類條帶。如圖1 中雜交菌株1、2 和7 擁有3 類條帶（菌株808 和菌株YX7 特異性條帶、共同條帶）情況分別標記為：○●●、●●●和●○○。將同一雜交菌株不同引物的結果進行綜合分析，同一類型條帶只要有一個引物的結果為●，則該類型條帶綜合結果標記為●，若所有引物的結果均為○，則該雜交菌株該類型條帶綜合結果標記為○。

2 結果與分析

2.1 雙單雜交子的鏡檢和拮抗測試

隨機挑取40 個雜交菌株進行顯微檢測和與2個親本菌株的拮抗測試（表2）。顯微檢測結果表明，40 個雜交菌株中共有36 個菌株檢測出鎖狀聯合結構，這些菌株可鑒定為雙核菌株，剩余4個雜交菌株未檢測出鎖狀聯合結構，其可能是單核菌株，初步鑒定為非雜合子。拮抗測試結果表明，與2 個親本菌株的拮抗反應均明顯的雜交菌株共有19 個，可初步鑒定為雜合子。對2 個親本菌株均有拮抗反應，但拮抗反應不明顯的雜交菌株共有5 個；與親本無拮抗反應的雜交菌株共有16 個。不明顯的拮抗反應與無拮抗反應二者較難區分，如菌株808 自身應無拮抗的菌落間也有不明顯的溝痕，菌株YX7 自身應無拮抗的菌落間也有細微隆起（圖2）。因此，菌株15 與YX7 的菌落間有不明顯的溝痕，本研究判斷為不拮抗，菌株47 與808 菌落間有不明顯隆起而判斷為輕微拮抗，菌株24 與YX7、菌株49 與808 菌落間明顯隆起而判斷為明顯拮抗?？梢?，拮抗反應的判斷具有主觀性，存在誤判的可能。19 個與親本均拮抗明顯的雜交菌株同時檢測出鎖狀結構，可確定為雜合子，分別是菌株2、3、7、8、9、13、23、24、31、34、35m、38、39、42、46、52、57、66 和67。與親本拮抗不明顯的5 個雜交菌株中，菌株1、52e 和68 檢測有鎖狀結構，菌株47 和79 未檢測出鎖狀結構。與親本不拮抗的16 個雜交菌株中，菌株15、36m、36e、37m、37e、49、52m、58m、58 e、60、70、70e、74 和78 共14個菌株存在鎖狀結構，菌株56m 和73 未檢測出鎖狀聯合結構。

2.2 傳統ISSR 多引物綜合分析雙單雜交菌株

采用P1、P2、P4 和P9 引物的ISSR 數據對選用的40 個香菇雜交子菌株進行綜合分析（表3）。40 個雜交菌株中，27 個雜交菌株2、3、7、8、9、13、23、24、31、34、35m、37m、37e、38、39、42、46、47、52、52e、57、58e、66、67、70、70e 和79 均具有兩親本的特異性條帶，確定為雜合子；13 個雜交菌株1、15、36m、36e、52m、49、56m、58m、60、68、73、74 和78 僅有單個親本菌株的特異性條帶，不能確定為真正的雜合子，但它們均具有兩親本的共同條帶，由于共同條帶無法確定源自哪個親本，因此也不能排除它們為雜合子的可能性。

2.3 新型ISSR 技術單引物鑒別分析雙單雜交菌株

新型ISSR 技術采用篩選出的單個引物P1，該引物能擴增出供體菌株YX7 的d、e 和f 3 條特異性條帶（圖3），其中f 條帶在所有雜交菌株中均有出現，而d 和e 條帶則分別出現在不同的雜交菌株中。說明f 條帶位點同時分布在供體親本菌株YX7 的2 個細胞核中，而d 和e 條帶位點則分別分布在菌株YX7 的2 個細胞核中。因此，根據電泳圖譜可將待測菌株分成4 類，第1 類為擁有d 特異性條帶的雜合子（圖3 中的菌株2、3、13、23 和31），第2 類為擁有e 特異性條帶的雜合子（圖3 中的菌株7、24、34、39 和42），第3類為同時擁有d 和e 條帶的非雜合子（圖3 中的菌株1、49 和52m），第4 類為d 和e 條帶都沒有的非雜合子（圖3 中菌株56m）。第3 類非雜合子可能是誤挑取的供體親本菌株YX7 本身，第4 類非雜合子則是未獲得供體核的808 孢子單核體。

研究結果表明，40 個待測菌株中共有27 個為雜合子，其中擁有d 條帶的雜合子為菌株2、3、9、13、23、31、35m、37m、37e、38、46、52e、57、58e、66、67、70、70e 和79，擁有e 條帶的雜合子為菌株7、8、24、34、39、42、47、和52。11 個菌株1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74 和78 為誤挑取的供體親本YX7 雙核菌株；菌株56m 和73 則為未雜交成功的808 孢子單核體菌株。

3 討論

菌絲存在鎖狀聯合和與兩親本存在拮抗反應，是鑒別異宗結合食用菌如姬菇[15]、杏鮑菇[16]、金針菇[17]、香菇[6]等品種雜交后代的最常用方法。本研究中，40 個雜交菌株中有19 個菌株同時與兩親本具有明顯的拮抗反應并具有鎖狀聯合，可以確定是雜合子。但也有存在鎖狀聯合結構而與親本拮抗反應不明顯或無拮抗反應的情況，如菌株1、52e、68、15、36m、36e、37m、37e、49、52m、58m、58e、60、70、70e、74、78 等。由于挑取雙單雜交后代時有可能取到雙核親本的菌絲，它們具有鎖狀聯合結構，而自身又存在輕微拮抗反應，此時很容易將這些非雜合子誤判為雜合子，所以有鎖狀聯合但與親本存在不拮抗或拮抗不明顯的菌株還有待進一步的檢測確定。菌株47 和79 未檢測出鎖狀聯合，但與兩親本均有輕微拮抗反應，這也有待于進一步檢測，以免因鎖狀聯合未被發現導致將雜合子誤判為非雜合子?？梢?，傳統的鎖狀聯合和拮抗反應觀測結果只能確定部分雜合子，尚有許多不能確定的菌株，而且容易產生誤判。

為確保雜合子鑒別的準確性和高效率，分子標記技術被越來越多應用于雜交子的鑒定。王麗寧等[10]和宋春艷等[18]分別采用傳統ISSR 和RAPD 分子標記技術比較香菇雜交子與親本間的遺傳差異，但由于孢子與親本本身存在遺傳差異，不能根據雜交子與親本存在遺傳差異而判斷其為雜合子。陳世通等[12]通過篩選出ISSR 引物6，將香菇單單雜交菌株中同時擁有2 個親本的特異性條帶的菌株成功判斷為雜合子。但傳統ISSR 技術需要多個引物進行分析比較才能辨識出盡可能多的雜合子，而僅憑單個或少數引物的結果則有可能使部分雜合子不被辨識。本研究采用多個引物對香菇雙單雜交菌株進行傳統ISSR 分析，根據雜交菌株是否擁有兩親本特異性條帶判斷其是否為雜合子，結果發現，部分菌株（如菌株8）單個引物（如P1、P2 或P9）的ISSR 圖譜僅有一個親本的特異性條帶，不能被標識為雜合子，但綜合多個引物的結果則同時擁有兩親本特異性條帶，可判斷為雜合子?？梢?，增加引物數量可提高傳統ISSR 技術對雜合子的辨識率。本研究采用4個引物對待檢雜交菌株進行傳統ISSR 分析，結果從40 個雜交菌株中共辨識出27 個雜合子菌株，仍有13 個菌株尚無法判斷是雜合子還是非雜合子?？梢?，傳統ISSR 技術判斷出的雜合子具有較高的準確性，但無法判斷非雜合子菌株。

雙單雜交的供體是雙核菌株，其2 個核的基因型是固定的，雜交時單核體只能接受其中一個核形成新的雜合子，不同雜合子接受到的核只有2 種，它們受單核體基因型的控制[3]。因此，可通過標記區分供體2 個細胞核，對雜合子進行鑒定。本研究構建了一種新型ISSR 分子標記技術鑒別香菇雙單雜交雜合子，該技術利用單個引物（P1）可擴增出雙單雜交中供體親本菌株的2 個細胞核的特異性條帶，擁有其中任意一條特異性條帶的雜交菌株可判斷為雜合子，無特異性條帶或同時擁有2 個細胞核的特異性條帶的雜交菌株均可判斷為非雜合子。本研究結果表明，新型ISSR 分子技術從40 個雜交菌株中檢測出27 個菌株為雜合子，檢測出的雜合子菌株與傳統ISSR 方法檢測的結果完全一致，同時確定其余13 個菌株為非雜合子。27 個雜合子中，有19 個雜合子接受了供體相同的一個細胞核，另外8 個雜合子則接受了供體的另外一個細胞核，從而可將雜合子分為2 類，有利于后續的農藝性狀定位和遺傳分析。

與傳統顯微觀察與拮抗試驗方法相比，新型ISSR 技術可鑒定出待檢菌株中的全部27 個雜合子菌株，而傳統顯微觀測與拮抗試驗方法只能確定19 個菌株為雜合子；傳統方法容易將有鎖狀聯合但無拮抗或拮抗不明顯的菌株（如菌株52e、37m、37e、58e、70 和70e），以及未檢測出鎖狀聯合的菌株（如菌株47 和79）誤判為非雜合子，而新型ISSR 技術可準確鑒定它們為雜合子，菌株47 和79 未檢測出鎖狀聯合可能是顯微檢測時視野數量不夠多所致；傳統方法有時也容易將非雜合子誤判為雜合子，如菌株1 與808 有明顯拮抗，與YX7 有輕微拮抗，且菌絲有鎖狀聯合，按傳統方法判斷應為雜合子，但新型ISSR 技術結果表明，菌株1 同時具有供體2 個核的特異性條帶，為YX7 自身而非雜合子?？梢?，新型ISSR 分子技術可以完美解決傳統顯微觀察和拮抗試驗對雜合子鑒別結果不夠全面和容易產生誤判的問題。

與傳統ISSR 技術相比，新型ISSR 技術采用單個引物就可確定全部27 個雜合子菌株，而傳統ISSR 技術需采用4 個引物才能鑒別出27 個雜合子。新型ISSR 技術可確定剩余13 個菌株為非雜合子，其中有11 個菌株（分別為1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74 和78）同時擁有供體親本2 個核的特異性條帶，說明它們是供體菌株YX7 本身，可能是挑取菌絲時誤取到供體菌絲所致；另外2 個非雜合子菌株56m 和73 不擁有供體任一核的特異性條帶，說明是受體菌株808 的孢子單核體。而傳統ISSR 技術則無法確定剩余13 個菌株為雜合子還是非雜合子，更無法解釋非雜合子的來源。新型ISSR 技術能根據導入的供體細胞核類別將雜合子歸為2 類，而傳統ISSR則不能對雜合子進行分類。

綜上所述，基于供體親本菌株雙核特異性條帶的單引物新型ISSR 分子標記技術可準確鑒別待測菌株是雜合子還是非雜合子，解決了傳統顯微觀察和拮抗試驗方法效率低、準確性差的問題，同時解決了傳統ISSR 技術需要采用多引物而程序復雜、雜合子鑒別結果全面性不確定、無法判定非雜合子、不能對雜合子歸類的問題，是一種簡便、快速和有效的香菇雙單雜交后代鑒定技術。該技術不僅可運用在香菇雜交育種中，還可拓展到其他食用菌品種的雜交育種中，缺點是不能用于單單雜交中的雜合子鑒別。