不同水培條件對絞股藍生長及總皂苷含量的影響

李瑩　黃雪彥　余麗瑩　姚李祥　周蕓伊　王春麗　藍祖栽　張占江　潘春柳

關鍵詞：絞股藍；水培條件；絞股藍皂苷

中圖分類號：S567.237 文獻標識碼：A

絞股藍[Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）Makino] 為葫蘆科（ Cucurbitaceae ） 絞股藍屬（Gynostemma）多年生草質攀援植物，主要分布于我國陜西南部和長江以南各省區[1]。絞股藍應用歷史悠久，是一種重要的藥食同源植物。絞股藍之名始載于明代《救荒本草》，被作為野菜食用?，F代研究表明，絞股藍具有益氣健脾、補腎溫陽、養心安神等功效[2]，其主要活性成分為絞股藍皂苷[3]，此外還含有黃酮、多糖、氨基酸和微量元素等化學成分。因含有人參皂苷，絞股藍被稱為“南方人參”，并于1986 年被科技部“星火計劃”列為待開發的第一位“名貴中藥材”，于2002 年被衛生部納入保健食品原料目錄[4]。近年來絞股藍作為重要的中藥和保健品原料，被廣泛應用于醫藥和保健領域，具有廣闊的市場開發前景，其應用價值巨大。

由于野生絞股藍資源日益枯竭，為了滿足日益增長的市場需求，人工引種栽培絞股藍已成為必然趨勢。然而，由于土壤灌溉、施肥、農藥使用等因素影響，絞股藍藥材品質不穩定、重金屬含量超標等問題時有發生，嚴重影響其規范化種植和藥材質量安全。水培作為無土栽培的一種方式，具有周期短、產量高、品質好、省地、省水、省肥、省工、病蟲害少、無連作障礙等優點，并且可以有效避免重金屬污染，有利于中藥材有機種植[5]，被廣泛應用于蒲公英[6]、益母草[7]、魚腥草[8]、桔梗[9]、人參[10]等中藥材生產中，已成為近年來中藥材生產的重要技術手段之一。本研究以絞股藍為試驗材料，通過設置不同營養液、不同溫度、不同光照強度和光周期條件開展絞股藍水培對比實驗，以篩選出適合絞股藍生長和有效成分積累的最優水培方式，為絞股藍規?；a和有機種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020 年10—11 月采集絞股藍成熟果實，采集地為廣西金秀縣。植物材料經廣西藥用植物園余麗瑩研究員鑒定。

1.2 方法

1.2.1 播種育苗 將果實置于陰涼通風處晾干，取出種子，以珍珠巖為基質進行播種育苗。育苗期間每天噴水1～2 次，以保證珍珠巖濕度。待幼苗長出后，選取3～5 葉期長勢較好且生長一致的絞股藍幼苗進行水培移栽。

1.2.2 營養液對比實驗 將供試絞股藍幼苗移植至清水中，緩苗2 d 后進行水培處理。溫度條件為25 ℃，光照強度為20 μmol/（m²·s），光周期為每天8 h 光照/16 h 黑暗。分別選用不同pH 的4種水培營養液（改良Hoagland、日本山崎、日本園試和華南農業大學葉菜A）進行培養，使用HCl或NaOH 調整營養液pH。營養液配方見表1 和表2[11-12]。實驗共設13 個處理，分別為：（1）CK：清水；（2）H₆：pH 6.0 的Hoagland 營養液；（3）H₇：pH 7.0 的Hoagland 營養液；（4）H₈：pH 8.0的Hoagland 營養液；（5）S₆：pH 6.0 的日本山崎營養液；（6）S₇：pH 7.0 的日本山崎營養液；（7）S₈：pH 8.0 的日本山崎營養液；（8）Y₆：pH 6.0的日本園試營養液；（9）Y₇：pH 7.0 的日本園試營養液；（10）Y₈：pH 8.0 的日本園試營養液；（11）A₆：pH 6.0 的華南農業大學葉菜A 營養液；（12）A7：pH 7.0 的華南農業大學葉菜A 營養液；（13）A₈：pH 8.0 的華南農業大學葉菜A 營養液。以清水為對照（CK），每處理3 個重復，每重復25 株。每天用通氣泵進行通氣，每7 d 更換一次營養液。處理30 d 后測定絞股藍植株存活率、生長指標及理化指標。

1.2.3 光照對比實驗 將供試絞股藍幼苗移植到清水中，緩苗2 d 后移栽至上述最優營養液中進行培養。為明確絞股藍幼苗對光照條件的要求進行不同光周期（每天8 h 光照/16 h 黑暗、10 h 光照/14 h 黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h黑暗）以及不同光強[弱光20 μmol/（m²·s）、中光100 μmol/（m²·s）、強光200 μmol/（m2·s）]條件下的對比實驗。光周期實驗中溫度條件為25 ℃，光照強度為100 μmol/（m²·s）；光強實驗中溫度條件為25 ℃，光周期為每天12 h 光照/12 h 黑暗。每處理設置3 個重復，每重復25 株。每天用通氣泵進行通氣，每7 d 更換一次營養液。處理30 d 后進行絞股藍生長指標及理化指標測定。

1.2.4 溫度對比實驗 將供試絞股藍幼苗移植到清水中，緩苗2 d 后按照上述最優營養液和光照條件進行移栽，然后分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃共6 種不同溫度條件下進行培養。每處理設置3 個重復，每重復25 株。每天用通氣泵進行通氣，每7 d 更換一次營養液。處理30 d 后進行絞股藍生長指標及理化指標測定。

1.3 指標測定

1.3.1 成活率 觀察記錄不同營養液處理中葉片生長及植株成活情況，統計植株死亡率及葉片枯黃萎蔫率。

死亡率=處理30 d 后死亡的植株數/該處理的總植株數×100%

枯黃萎蔫率=處理30 d 后半數及以上葉片出現枯黃或萎蔫的植株數/該處理的總植株數×100%

1.3.2 生長指標 統計不同營養液處理、光照強度處理及溫度處理的株高、莖粗、葉長、葉寬、根長、葉片數。在每個處理中隨機選取10株長勢均一的植株，將根系表面水分充分吸干，測定植株鮮重。將植株放入80 ℃烘箱中烘干至恒重，測定植株干重。

1.3.3 理化指標 根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法進行測定[13]。用復合酶提取法測定總皂苷含量[14]。每處理3 個重復。

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2013 軟件對數據進行整理，使用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件對數據進行統計分析。利用SPSS 軟件中的ANOVA 方法進行方差分析，采用Duncans 法進行顯著性檢驗（檢驗水平為0.05）。結果表示為平均值±標準誤（SE）。

2 結果與分析

2.1 不同營養液對絞股藍生長及總皂苷積累的影響

2.1.1 不同營養液對幼苗生長指標的影響 從表3 可以看出，不同營養液條件下絞股藍的成活情況存在明顯的差異。水培30 d 后，以S₇、Y₆和A₇營養液培養的絞股藍植株長勢較好，培養后無死亡和葉片枯黃萎蔫現象。其次是H₇、S₈、A₆和A₈營養液，培養后絞股藍植株無死亡現象，僅部分植株的葉片有枯黃或萎蔫現象。而使用H₆、H₈、S₆、Y₇或Y₈營養液進行培養時，會導致絞股藍植株死亡，其中H₈營養液培養后植株死亡株數最多，死亡率達24%；H₈和S₆ 培養后多個植株出現葉片枯黃或萎蔫。此外，營養液對絞股藍莖的伸長有促進作用。清水對照組的株高最小，僅為3.99 cm。Y₆處理的絞股藍平均株高最高，達22.03 cm，與其他處理相比有顯著性差異。H₇、S₈、Y₇、A₆、A₇處理的絞股藍株高較高，均在15 cm以上。H₆、H₈和S₆處理對絞股藍株高影響不大，平均值均在5 cm 以下。營養液對絞股藍莖的增粗也有促進作用。其中，H₆培養的絞股藍平均莖粗最大，為1.98 mm；A₆營養液培養次之，H₇、S₇、Y₆、A₇處理后莖粗無顯著性差異，且均顯著高于對照；A₈和Y₈處理后莖粗最小，與對照相比無顯著性差異。從根長上看，除H₈、Y₈外，其余營養液處理對絞股藍根長生長均有顯著的促進作用。其中A₇營養液處理的絞股藍平均根長最長，為12.44 cm；A₆、A₈和S₈次之，均在9 cm 以上。由此可見，適當的營養液可促進絞股藍植株生長。

由表4 可以看出，清水對照組的葉長和葉寬最小，分別為2.94 cm 和3.25 cm。使用不同營養液進行培養，除H₆、H₈和S₆之外，均可顯著促進絞股藍葉片生長。其中，A₇處理的絞股藍葉片最長，平均值為4.98 cm；A₆和H₇ 次之。S₇處理的絞股藍葉片最寬，平均值為6.35 cm；H₇和Y₇次之。不同營養液處理后葉片數也存在明顯差異。Y₆和A₇營養液處理的水培絞股藍葉片數最多，S₈和Y₇次之。H₆、H₈和S₆處理的葉片數最少，且均低于對照，表明這3 種培養液不利于絞股藍葉片分化。

由表5 可以看出，與對照相比，除H₆、H₈和S₆ 外，其余營養液均顯著提高絞股藍鮮重和干重。其中，Y₆營養液處理的絞股藍單株鮮重和單株干重最大， 平均值分別為1849.63 mg 和136.97 mg；A₇營養液次之，S₇、S₈、Y₇、A₆和A₈鮮重均在1500 mg 以上，干重均在100 mg 以上。H₆、H₈和S₆營養液處理的絞股藍重量較小，且H₆處理的單株鮮重、S₆和H₈處理的單株鮮重和單株干重均低于對照，表明這3 種培養液不利于絞股藍生物量積累。

2.1.2 不同營養液對絞股藍幼苗根系活力的影響從圖1 可以看出，不同營養液培養條件下絞股藍的根系活力差異顯著。其中，Y₆培養的絞股藍根系活力最高，四氮唑還原強度達139.06 mg/（g·h）；其次為S₇、Y₈、A₇和A₈處理，四氮唑還原強度在90 mg/（g·h）以上；而S₆、S₈處理后絞股藍根系活力較低，分別為23.98 mg/（g·h）和33.65 mg/（g·h），顯著低于對照。

2.1.3 不同營養液對絞股藍總皂苷積累的影響從圖2A 可以看出，不同營養液處理后絞股藍總皂苷含量差異較大。清水培養的絞股藍（CK）總皂苷含量僅1.73%，而H₆、H₇、Y₆處理后絞股藍總皂苷含量均超過2.00%，其中以H₇處理的總皂苷含量最高，為2.40%。A₇處理的總皂苷含量顯著低于對照，其余處理的總皂苷含量與對照無顯著性差異。由于不同營養液處理后絞股藍單株干重存在明顯差異，因此對絞股藍單株總皂苷量進行了計算。由圖2B 可知，Y₆處理后絞股藍單株總皂苷量最高，達3.03 mg，顯著高于其他處理。其次為H₇、S₇、Y₇和A₆處理，其單株總皂苷量在2 mg 以上。清水對照（CK）、H₆、H₈、S₆及Y8處理的絞股藍單株總皂苷量較低，均低于1 mg。

對各測定指標進行相關性分析發現，絞股藍單株總皂苷量與株高、葉長、葉寬、葉片數、單株鮮重、單株干重呈高度正相關（相關系數大于0.9，P<0.01）（表6）。因此，在絞股藍水培過程中培育高生物量植株是獲取高活性成分植株的關鍵。對絞股藍水培后植株的生長情況、總皂苷含量等多項指標進行綜合分析，認為pH 為6.0 的日本園試營養液能夠促進絞股藍生長及主要活性物質積累，是絞股藍水培生產的最佳營養液。

2.2 不同光照條件對絞股藍生長及總皂苷積累的影響

2.2.1 不同光周期對絞股藍生長及總皂苷積累的影響 為明確水培過程中絞股藍幼苗對光照條件的要求，開展了光周期及光照強度對比實驗。由表7 可以看出，當光周期為每天8 h 光照/16 h 黑暗時，絞股藍株高和莖粗較高，但根長、葉長、葉寬、葉片數、單株鮮重及單株干重均顯著低于其他光周期處理。10 h 光照/14 h 黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h 黑暗3 種光周期處理對絞股藍株高、莖粗、根長、葉長、葉寬、葉片數、單株鮮重及單株干重無顯著性影響。

對絞股藍干樣品進行總皂苷含量測定，發現8 h 光照/16 h 黑暗處理的總皂苷含量平均為2.3%；10 h 光照/14 h 黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h 黑暗處理的絞股藍干樣品中總皂苷含量平均值達4.0%以上，且各處理間無顯著性差異（圖3A）。從單株總皂苷量上看，10 h 光照/14 h黑暗、12 h 光照/12 h 黑暗、14 h 光照/10 h 黑暗3種光周期處理顯著高于8 h 光照/16 h 黑暗處理（圖3B）。因此，絞股藍水培生長過程中適宜的光周期為每天光照10～14 h。

2.2.2 不同光照強度對絞股藍生長及總皂苷積累的影響 從表8 可以看出，光照強度對絞股藍生長有顯著性影響。在20 μmol/（m²·s）和100 μmol/（m²·s）條件下，絞股藍株高較高，二者之間無顯著性差異。從莖粗、根長、葉長、葉寬、葉片數、單株鮮重及單株干重來看，以100 μmol/（m²·s）處理最高，表明100 μmol/（m²·s）更適合絞股藍生物量積累。由圖4A 可以看出，各光照處理對絞股藍干樣品總皂苷積累無顯著性影響。從單株皂苷量來看，以100 μmol/（m²·s）處理最高，且顯著高于20 μmol/（m²·s）和200 μmol/（m²·s）的光照處理。（圖4B）。

2.3 不同溫度條件對絞股藍生長及總皂苷積累的影響

從表9 可以看出，溫度對絞股藍幼苗生長有顯著性影響。在恒溫處理（15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃）中，以25 ℃和30 ℃處理的絞股藍株高、單株鮮重和單株干重較高。在變溫條件下，20 ℃/30 ℃變溫處理的絞股藍的株高、根長、葉片數、單株鮮重及單株干重均顯著高于15 ℃/25 ℃變溫處理。從總皂苷含量上看（圖5A），以20 ℃、25 ℃、30 ℃、15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃處理較高，其中20 ℃/30 ℃處理最高，達5.26%。從單株皂苷量來看（圖5B），以20 ℃/30 ℃處理最高，達16.96 mg。綜合絞股藍生長及有效成分積累情況，認為20 ℃/30 ℃是絞股藍水培的最適溫度。

3 討論

無土栽培中營養液是植物賴以生存的根際環境，也是植物生長的主要營養來源。研究發現，不同營養液對植株產量和品質的影響不同[15-16]。田雅楠等[17]研究發現，日本山崎茄子配方對潮汐式育苗的番茄植株各項生理指標均有促進作用，處理后壯苗指數比霍格蘭和阿農配方、日本園試配方高28.26%和81.53%。韋秀葉等[18]利用標準霍格蘭營養液（1H）和自主設計的營養液配方（1Z、1/2Z、1/4Z 和1/8Z）對大麻幼苗進行處理，結果表明1/4Z 和1/8Z 為大麻水培的適宜營養液配方。此外，水培植物的生長還與營養液的酸堿度有關。崔佳維等[19]研究發現，生菜、奶白菜、青菜和杭白菜4 種葉菜的產量和營養品質在不同營養液pH 條件下表現不同。隨著水培液酸堿度增加，柳枝稷不同品種（系）幼苗的分蘗數、株高、苗鮮重、根冠比、根系活力以及凈光合速率均顯著降低[20]。本研究對絞股藍水培的營養液條件進行探索，發現絞股藍生長及有效成分積累不僅與營養液種類有關，還與營養液的pH 密切相關。使用pH 為6.0 的日本園試營養液進行培養可以獲得高生物量和高總皂苷含量的絞股藍植株。相關性分析結果顯示，絞股藍單株總皂苷量與株高、葉長、葉寬、葉片數、單株鮮重、單株干重呈高度正相關。因此，在絞股藍水培過程中培育高生物量植株是提高絞股藍藥材質量的關鍵。

鈣、鎂、磷、鉀是植物生長發育和形態建成所必須的礦質元素。有研究表明，低濃度的磷和適當濃度的鉀有利于紅椿水培幼苗生長[21]。在低鈣濃度范圍內，增加鈣濃度能夠促進煙草水培幼苗對鉀的吸收[22]；當鎂濃度低于40 mg/L 時，煙草水培幼苗中鈣、鎂、磷、鉀的積累量與營養液中鎂濃度呈正相關關系。本研究中不同營養液配方中鈣、鎂、磷、鉀含量不同，但4 種礦質元素的含量對絞股藍幼苗生長的影響未呈現明顯的規律性，其原因可能與絞股藍生長周期較長而幼苗培養時間較短，導致植株形態特征差異不明顯有關。氮素水平和氮素形態配比不但影響植物生長，還影響植物次生代謝產物積累。研究發現，當硝態氮與銨態氮配比為75∶25 時，三七的生物量及皂苷含量較高[23]。在水培液中增加氮的濃度可顯著增加擬巫山淫羊藿的生物量，并影響黃酮的積累[24]。本研究中，日本園試營養液中氮含量最高，華南農業大學葉菜A 營養液中氮含量最低；改良Hoagland 營養液中硝態氮與銨態氮的比例最高，其次為日本山崎和日本園試配方。絞股藍單株總皂苷量與營養液中氮含量的高低無關，但較低的硝態氮與銨態氮配比更有利于絞股藍皂苷積累，其原因有待進一步研究。

光照和溫度是植物生長發育的重要影響因素。前人研究表明，絞股藍生長及有效成分積累與光照條件和環境溫度密切相關。劉世彪等[25]研究發現，絞股藍葉的形態結構受光照強度影響較大，適當遮蔭處理有利于植株生長發育；絞股藍生長發育的最適溫度為25 ℃，有效成分積累的最適溫度為25～30 ℃[26]。鄧銘等[27]認為40%～85%的相對照度有利于絞股藍生長，相對照度為70%左右時其干物質產量和總皂苷含量最高。本研究發現100 μmol/（m²·s）光照條件及20 ℃/30 ℃變溫處理有利于絞股藍生物量和皂苷積累，與前人研究結果較為一致。其原因可能與絞股藍對生境的需求有關，絞股藍原生境為山谷密林、山坡疏林或路旁草叢，均為蔭蔽且陰涼的環境。

多項研究表明，不同產地絞股藍總皂苷含量存在明顯差異。彭亮等[28]研究發現，不同產地絞股藍總皂苷含量相差可達10 倍以上。馬澤剛等[29]研究發現，絞股藍總皂苷含量從高到低的產地排序為：江西>廣東>云南>陜西>內蒙古>福建>四川>湖北。潘春柳等[30]發現廣西不同產地來源的絞股藍總皂苷含量亦存在明顯差別。實現絞股藍標準化生產是獲取高質量藥材的關鍵，然而目前在絞股藍藥材質量控制方面尚無統一定論?！渡綎|省中藥材標準》（2002 年版、2012 年版）[31-32]、《湖北省中藥材標準》（2009 年版）[33]規定絞股藍總皂苷含量分別為2.0%和0.18%，其他省區中藥材標準未涉及絞股藍藥材質量要求。本研究中，使用pH 為6.0 的日本園試營養液對絞股藍進行水培，在環境溫度為20～30 ℃，光周期為每天光照10～14 h，光照強度為100 μmol/（m²·s）時，培養30 d后其干樣品總皂苷含量高于3%，高于現有標準。因此，使用規范化水培技術可同步實現絞股藍產量和品質的雙精準調控。本研究為今后開展絞股藍規?；a、質量標準研究打下了基礎。