橡膠/香露兜間作對香露兜香氣成分的影響

張昂　李麗華　鐘壹鳴　鐘大玲　秦曉威　吉訓志　周艷飛　魚歡

關鍵詞：橡膠樹；香露兜；間作；香氣成分；土壤；理化性質

中圖分類號：S344.2 文獻標識碼：A

橡膠林是中國熱帶地區最大的熱帶經濟林[1]，其產物天然橡膠是我國重要的戰略物資[2]。橡膠林主要分布于云南、海南等熱帶地區，其株行距寬廣，適宜發展林下經濟[3]。香露兜（Pandanusamaryllifolius Roxb.）是露兜樹科（Pandanaceae）露兜樹屬（Pandanus）特色香料草本植物，又名斑蘭葉，原產于印度尼西亞，20 世紀50 年代引入中國，種植面積約333 hm2[4]。香露兜葉片具有獨特的粽香香氣，經濟價值高且粗生易種，其光飽和點在550～600 μmol/（m2·s）之間，適宜在林下弱光照的環境中種植[5]。因此，大力發展橡膠林下間作香露兜有助于提高橡膠林經濟產值，促進農民增收，以及鄉村振興戰略實施。

香露兜葉片含有的大量揮發性香氣成分，主要由醇類、芳香類、羧酸類、酮類、醛類、酯類、烴類、呋喃類、萜類等化合物種類組成[4-5]。其中吡咯類，如2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）是香露兜的主要香氣成分，也是評價香露兜品質優劣的主要參考指標。2AP 香氣成分在水稻、爆米花、香水椰子中同樣含有[6]，但香露兜2AP 含量是芳香型水稻的10 倍，非芳香型水稻的100 倍[7]，具有廣闊的開發前景。前期研究表明，2AP 等稻米香氣物質受環境因子如光照、土壤濕度、礦物質離子、氮肥等顯著影響[8]，LUO 等[9]在芳香型水稻研究中發現硒的施用可提高2AP 生物合成速率。此外，香露兜葉片中含有大量天然活性物質如角鯊烯、亞油酸、葉綠醇等同樣受到環境因子調控，例如土壤中鎂元素缺乏或土壤鹽脅迫能夠引起香露兜活性物質含量的顯著降低[10-11]。

橡膠間作香露兜具有傳統復合種植模式的優勢，即間作作物之間會產生協同互補效應，使作物生理性狀、產量和品質發生改變[12]。例如前人研究發現，在茶園間作喬木體系中，喬木通過改善光合生態環境，提高土壤養分和土壤酶活性，減少茶樹光合午休和養分供應不足等現象，顯著增加茶中氨基酸和咖啡堿含量，提高茶葉品質[13]；李枝樺等[14]在煙草與香料間作種植中發現，煙草與香料作物間作形成化感物質，導致烤煙增加許多新的致香成分；在檳榔與香露兜間作模式中發現，間作香露兜香氣成分組成與單作相比差異較小，但香氣成分含量顯著增加[4]。然而，橡膠間作香露兜對香露兜香氣成分的影響目前尚未報道，探究橡膠間作香露兜對香露兜葉片香氣成分組成和含量的影響及其關鍵調控因子，能夠為優化橡膠間作香露兜模式提供理論基礎，有助于推廣橡膠與香露兜復合栽培模式，促進相關產業的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗位于中國熱帶農業科學院香料飲料研究所種質資源圃（18°44′15″N，110°11′32″E），該地區屬于熱帶季風氣候，年平均溫度在23～24 ℃，大于或等于10 ℃的積溫6655.7～9855.4 ℃。年平均降水量2100～2200 mm，其中8—10 月雨量占年雨量的40%～50%。年平均日照為1500～2200 h。

選取生長狀態基本一致，健康無病蟲害培育半年的香露兜植株和培育一年的橡膠植株作為試驗材料。試驗用土為以磚紅壤為主混合而成的質地均一的土壤。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 選取直徑35 cm，高50 cm 的圓形花盆進行盆栽試驗。橡膠定植于2020 年10月，一個月以后再進行香露兜定植。觀測時間為2021 年11 月。試驗設計香露兜單作（M）和橡膠香露兜間作（I）2 個處理，每個處理重復10次。試驗期間采用相同的水肥管理措施。

1.2.2 指標測定 （1）土壤養分含量測定。于2021 年11 月采用環刀法采集土壤樣品，一個完整的環刀土壤樣品在105 ℃下烘干稱重，并計算土壤容重（soil bulk density， SBD），計算公式：SBD = 烘干土樣質量/環刀容積。其余土壤樣品在實驗室避光晾干，研磨過16 目篩（1 mm），采用電位法測定土壤pH；使用硫酸提取-鉬蘭比色法測定土壤速效磷（soil olsen phosphorus， SOP）含量；采用醋酸銨-火焰光度計法測定土壤速效鉀（soil available potassium， SAK）含量；采用堿解擴散法測定堿解氮（soil alkali hydrolyzed nitrogen，SAN）含量。（2）環境指標測定。使用多參數土壤水分速測儀（TZS-2X-G）測土壤溫度（soiltemperature， ST）、土壤濕度（soil moisture， SM）、電導率（conductivity， Cond）。（3）香氣成分測定。a. 萃取方法。與土壤樣品采集同期，每個處理隨機選取10 株香露兜，采集倒5～7 葉位的新鮮葉片，用去離子水沖洗干凈葉面雜質后，用潔凈的紗布擦拭葉表面水分，室內靜置5 min 待其葉片表面水分揮發完全，環境溫度為（20 ± 3） ℃。剪碎并稱取4 g 鮮葉樣品于50 mL 離心管中，加入15 mL 無水乙醇， 使用數控超聲波清洗器（KQ5200DE）在400 W、40 KHz、50 ℃下超聲波萃取60 min，用0.22 μm 有機相針式濾器（尼龍）過濾，獲取提取液，使用Aglient-7890 B/5977B氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）進行檢測。b. 氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS）分析。色譜（GC） 條件： 色譜柱為彈性石英毛細管柱DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），以1 mL/min的高純氦氣（99.999%）為載氣，不分流進樣，進樣口和接口溫度為250 ℃。色譜柱初始溫度為50 ℃，保持2 min 后，以5 ℃/min 的升溫速度升溫至100 ℃，再以6 ℃/min 的速度升溫至250 ℃，保持5 min。質譜（MS）條件：離子源為EI，溫度230 ℃。四極桿溫度為150 ℃，進樣口溫度為250 ℃，電壓為70 eV，掃描質量范圍在30～ 450 amu。

1.3 數據處理

1.3.1 香氣成分數據分析 （1）定性分析。結合質譜和保留指數對香露兜香氣成分進行定性，質譜分析結果在NIST2017 譜庫中進行檢索，對比定性；以相同條件使用C7～C40 正構烷烴混標（上海安譜實驗科技有限公司），進行GC-MS 分析，利用其保留時間按線性方程計算各成分的保留指數，對實測計算的保留指數與文獻進行定性分析。

（2）定量分析。精密吸取角鯊烯標準品（GC≥98%，上海源葉生物科技有限公司）、葉綠醇標準品（GC≥90%，上海源葉生物科技有限公司）、2-乙酰-1-吡咯啉標準品（純度95%， torontoresearch chemicals， Canada）以及甲醇（色譜純），分別配置50、100、150、300、500 μg/mL 溶液濃度，以樣品的色譜條件，標準品濃度由低到高的順序依次進樣，每個濃度進樣3 次，得到各組分的定量線性關系圖表，橫坐標為各組分梯度濃度，縱坐標為3 次測定峰面積的平均值。利用峰面積按照線性方程計算角鯊烯、葉綠醇、2AP 的含量，同時再根據2AP 的含量對其他香氣物質進行半定量。計算公式：

X_i=（A_i / A_s）×C_s

式中，X_i為待測物質含量；A_i為待測物的峰面積；A_s為2-乙酰-1-吡咯啉的峰面積；C_s為樣品中2AP含量。

1.3.2 數據統計分析 使用R 4.0.1 軟件對香氣成分種類及含量進行單因素方差分析，用于判斷間作對香氣成分種類及含量的影響，而后對香氣成分種類及含量樣本進行聚類（NMDS）分析，用于明確間作對香露兜香氣成分的影響。使用Canoco 4.5軟件對不同環境因子和香露兜香氣成分種類及含量進行CCA 分析，并使用Origin 2021軟件進行環境因子和香氣成分種類之間的相關性分析并作圖，用于明確間作影響香露兜香氣成分的關鍵調控因子。

2 結果與分析

2.1 間作對香露兜土壤環境因子的影響

由單因素方差分析（表1）可知，間作與香露兜單作相比，土壤pH 降低1.00，土壤容重（SBD）、堿解氮（SAN）、土壤速效磷（SOP）、土壤速效鉀含量（SAK）分別提高13.63%、59.71%、193.03%、9.78%（P<0.05）。間作對土壤濕度（SM）、土壤溫度（ST）、電導率（Cond）無影響。

2.2 間作對香氣含量物質組成的影響

間作和單作共檢測出68種揮發性香氣成分，間作檢測出44 種，單作檢測出61 種。由表2 可見，間作香露兜的酮類、呋喃類、呋喃酮類、烴類和酚類的物質種類與香露兜單作相比分別減少56.52%、14.29%、33.33%、20.00%、28.57%（P <0.05）。間作對醇類、呲咯類、酯類、醛酮類、酸類等成分種類無影響。

由表3可見，間作處理中，香氣成分含量最多的為醇類，單作香氣成分最多為烴類。間作香露兜香氣成分含量：醇類＞烴類＞呋喃酮類＞呲咯類＞呋喃類＞酯類＞酸類＞酚類＞酮類＞醛酮類。單作香露兜香氣成分含量：烴類＞醇類＞呋喃類＞呋喃酮類＞酚類＞酯類＞呲咯類＞酸類＞酮類＞醛酮類。橡膠香露兜間作與香露兜單作相比分別提高醇類、呲咯類、酯類和呋喃酮類香氣成分含量31.50%、597.56%、122.78%、96.89%（P<0.05），并且顯著降低呋喃類65.28%、烴類20.88%和酮類69.00%的香氣成分含量（P<0.05），卻對醛酮類、酸類、酚類香氣成分含量無影響。

2.3 間作對香露兜香氣成分的影響NMDS分析

對香氣成分種類（脅強系數stress=0.027）和含量（stress=0.079）分別進行NMDS 分析，由圖1 可知，間作處理下香露兜香氣成分組成和含量的重復性較單作更好，單作與間作處理下的香露兜香氣成分組成（stress=0.109）和含量（stress=0.079）均能準確反映數據排序的真實分布，并且單作與間作處理下的香露兜香氣成分組成和含量均存在明顯差異。

2.4 影響香氣成分組成和含量的主要土壤環境因子CCA分析

對香露兜香氣成分組成和土壤環境因子進行CCA 分析，結果顯示所有土壤環境因子共同解釋了間作后香露兜香氣成分組成變化的23.17%。CCA 分析前2 個排序軸分別解釋總方差的16.70%和6.47%（圖2）。影響香露兜香氣成分組成的主要土壤環境因子為土壤pH（F=2.20， P<0.05）、土壤速效磷（F=2.00， P<0.05）

香氣成分含量和土壤環境因子CCA 分析結果顯示，所有土壤環境因子共同解釋了間作后香露兜香氣成分含量變化的55.58%，前2 個排序軸分別解釋總方差的47.59%和7.99%（圖3）。土壤pH（F = 11.70， P<0.001）、土壤速效磷（SOP，F=11.60， P<0.001）、土壤堿解氮（SAN， F=7.10，P<0.001）、土壤容重（SBD， F=6.00， P<0.001）和土壤溫度（ST， F=3.10， P<0.05）等5 個指標是影響香露兜香氣成分含量的主要土壤環境因子。

2.5 影響香氣成分組成和含量的主要因素

通過相關性分析（圖4A）可知，土壤溫度與醇類（R=?0.402， P<0.05）組成呈顯著負相關關系；電導率與呋喃類（R=0.581， P<0.01）組成呈顯著正相關關系；土壤pH 與酮類（R=0.488， P<0.05）、呋喃類（R=0.480， P<0.05）、呋喃酮類（R=0.638，P<0.01）、烴類（R=0.529， P<0.05）和酚類（R=0.398，P<0.05）組成呈顯著正相關關系；土壤容重與醛酮類（R=?0.509， P<0.05）組成呈顯著負相關關系；土壤速效鉀與烴類（R=?0.595， P<0.01）和酚類（R=?0.450， P<0.05）組成呈顯著負相關關系；土壤堿解氮與酮類（ R=?0.552， P<0.05） 、呋喃酮類（R=?0.499， P<0.05）、烴類（R=?0.570， P<0.01）和酚類（R=?0.404， P<0.05）組成呈顯著負相關關系；土壤速效磷與酮類（R=?0.506， P<0.05）、呋喃類（R=?0.463， P<0.05）、呋喃酮類（R=?0.514，P<0.05）、烴類（R=?0.581， P<0.01）和酚類（R=?0.452， P<0.05）組成呈顯著負相關關系。

土壤濕度與醇類（R=?0.403， P<0.05）含量呈顯著負相關關系；土壤溫度與酮類（R=0.606， P<0.01）和呋喃類（R=0.476， P<0.05）含量呈顯著正相關關系；電導率與呋喃類（R=0.420， P<0.05）和烴類（R=0.571， P<0.01）含量呈顯著正相關關系；土壤pH 與呋喃類（R=0.600， P<0.01）、烴類（R=0.449， P<0.05）和酚類（R=0.459， P<0.05）含量呈顯著正相關關系，與醇類（R=?0.440， P<0.05）、呲咯類（R=?0.824， P<0.01）、酯類（R=?0.644， P<0.01）和呋喃酮類（R=?0.599， P<0.01）含量呈顯著負相關關系；土壤容重與呲咯類（R=0.599， P<0.01）、酯類（R=0.546， P<0.05）和呋喃酮類（R=0.582， P<0.01）含量呈顯著正相關關系，與醛酮類（R=?0.465， P<0.05）、呋喃類（R=?0.497，P<0.05）含量呈顯著負相關關系；土壤速效鉀與酯類（R=0.518， P<0.05）含量呈顯著正相關關系；土壤堿解氮與醇類（R=0.428， P<0.05）、呲咯類（R=0.731， P<0.01）、酯類（R=0.569， P<0.01）和呋喃酮類（R=0.608， P<0.01）含量呈顯著正相關關系，與呋喃類（R=?0.467， P<0.05）含量呈顯著負相關關系；土壤速效磷與呲咯類（R = 0.830，P<0.01）、酯類（R=0.684， P<0.01）和呋喃酮類（R=0.645， P<0.01）含量呈顯著正相關關系，與呋喃類（R=?0.547， P<0.05）、烴類（R=?0.460， P<0.05）含量呈顯著負相關關系（圖4B）。

3 討論

3.1 間作對土壤理化性質的影響

間作是一種能夠改善土壤生態環境的種植模式[15]，已有研究表明，間作能夠顯著影響土壤理化性質[16]，如李楊輝等[17]在蘋果間作苜蓿后發現土壤pH 顯著降低。在本研究中，橡膠香露兜間作同樣降低土壤pH，這可能與橡膠根際分泌物產生大量十六烯酸、油酸等物質有關[18]。土壤容重大小可以反映出土壤孔隙度、田間持水量等土壤物理性質[19]，一般情況下與土壤有機質呈負相關關系[20]。前期研究發現在香蕉[21]和玉米[22]等間作體系中土壤容重呈降低趨勢，但本研究中間作使土壤容重增加，而土壤含水量并無差異，這可能是由于間作香露兜后橡膠林土壤有機質含量顯著降低，土壤團聚體被破壞所致[23]。土壤速效養分是植物從地下部最易獲取的養分[24]，劉在民等[25]在苜蓿/大白菜間作模式下發現間作與單作相比土壤速效養分含量顯著提高，在本研究同樣能夠證實上述結果。首先，土壤pH 的變化會影響土壤中離子交換過程[26]，間作后土壤pH 降低使磷、鉀等離子交換發生改變，加速土壤養分累積[27]；其次，間作后作物土壤菌群改變，土壤菌群的改變增強土壤磷酸酶、過氧化氫酶等酶活性[28-29]，加速土壤中氮、磷、鉀的釋放，提高土壤速效磷、土壤速效鉀、土壤堿解氮含量。眾所周知，土壤養分是植物生長發育的重要養分來源，土壤養分等理化性質的改變將直接影響植物對養分的吸收和利用效率，顯著影響植株的生長發育以及品質形成[30]。因此，土壤理化性質和養分條件的變化可能是顯著調控香露兜香氣成分的主要原因之一。

3.2 間作對香氣成分組成的影響

香露兜是一種熱帶香料作物，香氣成分是其次生代謝產物， 主要分布在葉片[31-32]。運用GC-MS 技術比較分析不同種植模式下香露兜香氣成分組成和含量的變化規律，結果發現，香露兜香氣成分由醇類、呲咯類、酮類、酯類、醛酮類、呋喃類、呋喃酮類、酸類、烴類、酚類等10類物質組成[33]。在前期相似的研究中發現煙草在間作模式中顯著增加新的致香物質主要與土壤理化因子的變化密切相關[14]。土壤中養分含量的變化通過影響作物對養分的吸收速率，進而調控某些香氣成分前體物質的合成和基因的表達，造成香氣成分組成發生改變[34]。本研究結果證實土壤pH、土壤容重、土壤速效磷是主要影響香露兜香氣成分組成的主要環境因子。土壤速效磷與酚類、烴類、呋喃類、呋喃酮類、酮類物質組成均呈顯著負相關關系表明，間作處理下適宜的光合有效輻射以及土壤速效鉀和磷等土壤養分含量的增加可能改變了香露兜生長速率與香氣成分合成的平衡關系，通過加速香露兜的營養生長，抑制部分香氣成分的合成路徑，進而減少香氣成分種類[33-35]。本研究中，pH 與酮類、呋喃類、呋喃酮類、烴類和酚類的香氣成分組成數量呈正相關關系表明，土壤pH 的降低通過抑制植物對土壤養分的吸收[35]及其基因表達[27]是使酮類、呋喃類、呋喃酮類、烴類、酚類香氣成分組成減少的另一個主要因素。

3.3 間作對香露兜香氣成分含量的影響

OKPALA 等[36]、LUO 等[37]、XIE 等[38]在香稻試驗中發現，環境因子對香米的香氣成分含量有顯著影響。在檳榔間作香露兜的研究中發現，光合有效輻射同樣是調控香露兜香氣成分含量的主要因素。但在本研究中，影響香露兜香氣成分含量的主要環境因子是土壤pH、土壤容重、土壤堿解氮和速效磷含量。究其原因，首先，前人研究認為土壤pH 變化是影響作物品質產生的主要因子之一[39]，在本研究中，土壤pH 與醇類、呲咯類、酯類、呋喃酮類含量呈負相關關系，卻與呋喃類和烴類含量呈顯著正相關關系，可能是由于pH降低調控土壤細菌種類及土壤酶活性變化[40-41]，影響土壤中含有氮磷鉀等有機質的礦化速率，進而改變香露兜的養分吸收速率[42-43]，使醇類、呲咯類和酯類香氣成分含量增加，呋喃類和烴類香氣成分含量降低；其次，氮和磷是作物促進香氣成分物質合成和代謝的主要元素之一[24， 44]。有研究指出土壤中的氮和磷含量缺乏會降低煙葉中部分與香氣成分相關的次生代謝產物合成，進而減少部分香氣成分含量[42， 45]。本研究結果與上述研究保持一致，即土壤堿解氮和速效磷與香露兜香氣成分呲咯類、酯類和呋喃酮類含量呈顯著正相關，間作處理下土壤速效磷含量的增加顯著促進醇類、呲咯類、酯類和呋喃酮類等香氣成分含量的提高。然而，間作后提高土壤速效磷含量卻可能抑制呋喃類和烴類的前體物質的合成。綜上所述，橡膠間作香露兜模式通過顯著降低土壤pH，以及提高土壤堿解氮和速效磷含量，顯著促進醇類、呲咯類、酯類和呋喃酮類等香氣成分含量的提高，以及呋喃類和烴類物質含量的下降。

呲咯類物質中的2AP 是香露兜棕香香氣的主要來源，也是評價香露兜品質好壞的主要參考依據，在本研究中發現橡膠香露兜間作顯著提高呲咯類物質含量，表明間作對香露兜品質的提高有顯著促進作用。但以上研究僅對間作模式下香露兜香氣成分與環境因子間的關系進行初步探討，間作模式對香露兜2AP 物質合成路徑，及相關基因表達的作用機制還有待進一步探究。

4 結論

橡膠間作香露兜后，土壤pH 降低是香露兜葉片酮類、呋喃類、呋喃酮類、烴類和酚類等香氣組分減少的主要原因；間作模式在通過降低pH、提高土壤速效磷和堿解氮含量，顯著提高醇類、呲咯類、酯類含量的同時，減少呋喃類、烴類含量。呲咯類物質是香露兜棕香香氣的主要來源，間作模式對香露兜品質的提高有顯著促進作用。優化和推廣橡膠間作香露兜模式有助于提高膠農收益以及相關產業的可持續發展。