不同壁材對綠咖啡油微膠囊微觀結構及其熱穩定性的影響

慕靜怡　胡發廣　張珍珍　董文江　李亞男　畢曉菲　胡榮鎖　陳小愛

關鍵詞：綠咖啡油；微膠囊；復合凝聚法；結構表征；熱穩定性

中圖分類號：S571.2 文獻標識碼：A

咖啡是我國重要的熱帶經濟作物，具有極高的經濟價值。我國咖啡種植主要分布在云南、海南、四川、臺灣等地[1]。據統計，2021 年我國咖啡種植面積已達9.39 萬hm²，總產量達10.91 萬t[2]。云南省咖啡面積和產量分別占全國的98.84%和99.61%。中國的咖啡消費正在以每年超過15%的速度增長，2021 年中國咖啡市場規模突破1700億元，居全球第8 位。與咖啡的食用價值相比，作為咖啡衍生產品之一的綠咖啡油（green coffeeoil， GCO）利用率很低，常用于化妝品行業[3]。綠咖啡油富含生育酚和不飽和脂肪酸，如油酸和亞油酸等，可用于生產營養制品[4]。然而其中多不飽和脂肪酸極不穩定且易氧化，導致綠咖啡油保質期縮短及感官、營養品質下降，極大限制了其生物活性的發揮。因此，如何保證綠咖啡油的穩定性，對綠咖啡油的應用具有極其重要的價值。

微膠囊化能使液態的油脂轉變為具有親水性的固體粉末，保護油脂免受外界因素的影響，不僅保持了油脂原有的營養價值，還使其具有穩定的性質和優良的加工特性[5]。微膠囊制備的常用方法包括復合凝聚法、噴霧干燥法和分子包埋法等。韓婕妤等[6]用噴霧干燥法成功制備奇亞籽油微膠囊，有效延緩奇亞籽油的氧化，提高了奇亞籽油的貯藏穩定性。張維等[7]用超聲波輔助分子包埋法制備榛子油微膠囊，減緩榛子油氧化速度的同時延長了其貨架期。COMUNIAN 等[8]通過噴霧干燥法制備綠咖啡油微膠囊，所制備的微膠囊具有良好的穩定性，具有開發營養食品或化妝品配方的潛力。DE OLIVEIRA 等[9]用復合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊并應用到果汁中，綠咖啡油微膠囊可以有效改善果汁流變性，提高感官質量。利用復合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊具有操作簡單、重現性好、無需復雜設備且制備的產品熱穩定性好等優點[9]，目前國內外利用復合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊的報道較少。

目前復合凝聚技術最常用的壁材是明膠和阿拉伯膠（gum arabic， GA）[10]，但牛肉明膠因朊病毒病及其食品安全問題而使其應用范圍下降。在食品領域，多種動、植物源蛋白已被開發為明膠的替代品，并與碳水化合物結合后作為復合凝聚微膠囊技術中的壁材[11]。在前期基礎中，譚睿等[12]初步評價了不同多糖與明膠組合復合凝聚法包埋綠咖啡油的微膠囊性能，而對動、植物源蛋白與阿拉伯膠為壁材復合凝聚制備綠咖啡油微膠囊還有待研究。

本研究以3種疏水性蛋白和阿拉伯膠為壁材，采用復合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊，考察不同壁材對綠咖啡油微膠囊包埋效果、表觀形貌、結構組成的影響；探究壁材及其微膠囊內部的相互作用力及熱穩定性。該研究為制備綠咖啡油微膠囊提供新的思路和途徑，也為綠咖啡油穩定性提升和高值化利用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 綠咖啡油（C16：0， 5%～20%；C18：0， <7.0%; C18：1， 20%～35%; C18：2， 50%～70%）由雅克耶提芳香醫藥（青島）有限公司提供；阿拉伯膠、大豆分離蛋白（soybean proteinisolate， SPI）、尼羅紅（用于熒光分析，≥95.0%）、戊二醛為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；HilmarTM 9410 乳清分離蛋白（whey proteinisolate， WPI; 89%）為美國Hilmar 公司產品；酪蛋白酸鈉（sodium caseinate， SC; >90%）、異硫氰酸熒光素（偶聯級，90%標記率）、異硫氰酸玫瑰紅B（偶聯級，70%標記率）為上海源葉生物科技有限公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備 Seven Compact S220 pH 計[Mettler Toledo 儀器（上海）有限公司]，FJ200-SH型數顯高速分散均質機（上海標本模型廠），數顯懸臂式恒速強力電動攪拌機（江陰市保利科研器械有限公司），DF-101 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司），SynergyH1全波長掃描式多功能讀數儀（美國BioTek 有限公司），Mastersizer 3000 激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司），Phenom Prox 臺式顯微能譜一體機（荷蘭復納科學儀器有限公司），Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher 公司），FV10i 激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司），Ultima IV X 射線衍射儀（日本理學株式會社），DSC25 差示掃描量熱儀（美國TA公司）。

1.2 方法

1.2.1 濁度的測定 采用大豆分離蛋白（SPI）、乳清分離蛋白（WPI）和酪蛋白酸鈉（SC）與阿拉伯膠（GA）分別配制總濃度為0.1%（W/V）的溶液（表1），將溶液置于45 ℃的恒溫水浴環境下，逐滴緩慢滴加鹽酸（0.1、1.0、10.0 mol/L、），調節混合體系的pH，以0.1 梯度調節pH 至2.0左右，分別測定pH 和波長為600 nm 處吸光度。

1.2.2 復聚物的制備工藝 根據表2 混合均勻制備總生物聚合物濃度為1%的溶液，將混合溶液轉移至三口燒瓶，保持體系溫度50 ℃，置于恒溫加熱磁力攪拌器中， 攪拌備用。以攪拌速率400 r/min，在30 min 內緩慢滴加1%或10%鹽酸調節乳液的pH 至前述濁度的最優pH。關閉加熱源，2 h 內自然冷卻至室溫后，用冰水浴降溫至4 ℃，繼續反應1 h。然后將反應體系置于冰水浴中使溶液降溫至15 ℃以下保持30 min，以結束復合凝聚反應。用1% NaOH 溶液調節體系pH 至6.0，然后加入5 mL 戊二醛（1%）進行固化，反應時間為3 h。固化后即為綠咖啡油微膠囊懸浮液，靜置分層、離心分離上清液后在溫度為–80 ℃的超低溫冰箱預凍24 h，在–50 ℃和20 kbar 下真空冷凍干燥48 h。所得樣品盛放于高密度聚乙烯袋中，并保存于棕色干燥器中備用。

1.2.3 微膠囊的制備工藝 采用復合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊（圖1）。按表2 分別配置壁材儲備液，以芯壁比1∶1 添加綠咖啡油，10 000 r/min均質5 min，得到O/W 乳液；再緩慢加入GA 儲備液，10 000 r/min 二次均質5 min，得到生物聚合物濃度為1%的乳液，室溫下以500 r/min 速度攪拌，并用1.0 mol/L HCl 緩慢滴加調節pH 至固定值后，凝聚30 min。后續制備過程同1.2.2。

1.2.4 粒度分布 參照YANG 等[13]的方法，采用Mastersizer 3000 激光粒度儀測定綠咖啡油微膠囊的尺寸分布。每個樣品重復測定3 次。

1.2.5 微膠囊產率、包埋率的測定 根據以下公式計算微膠囊產率（YE）：

微膠囊表面含油量（SO）測定：稱取m0 微膠囊粉末，分次加入30 mL 石油醚快速洗滌，然后過濾至恒重圓底燒瓶m₁，在45 ℃和100 Mpa壓力下進行溶劑回收，收集完畢于恒溫干燥箱中干燥1.5 h，冷卻稱重，重復操作直至恒重m₂。根據以下公式計算表面含油量：

微膠囊總含油量（TO）測定：稱取1.0 g 微膠囊粉末，用10 mL 蒸餾水（45～50 ℃）分次溶解，加入1.25 mL 濃氨水混勻，置于60 ℃水浴加熱5 min，冷卻加入10 mL 無水乙醇充分搖勻，再加入25 mL 無水乙醚輕輕振蕩1 min 排氣，加入25 mL 石油醚劇烈振蕩30 s 后靜置30 min 分層，待上層澄清時讀取上層清液總體積（V₀），吸取一定體積的上清液（V₁）于已恒重的圓底燒瓶（m₁）中。在45 ℃和100 Mpa 壓力下進行溶劑回收，收集完畢于恒溫干燥箱中干燥1.5 h，冷卻稱重，重復操作直至恒重m₂。根據以下公式計算總含油量：

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 參照周麟依等[14]的方法，利用OMNIC 32 軟件對光譜進行平滑和基線校正處理，光譜數據輸出格式為透光率，重復測定3 次。

1.2.7 掃描電鏡（SEM）分析 參照LAN 等[15]的方法，用掃描電鏡觀察綠咖啡油微膠囊及復聚物的微觀形貌。

1.2.8 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）分析 通過激光共聚焦顯微鏡在雙波長下觀察復聚物和微膠囊的樣品形態。復聚物和微膠囊油滴觀察分別采用DUHORANIMANA 等[16]和BAKRY 等[17]的方法。

1.2.9 X 射線衍射分析（XRD） 參照ALI 等[18]的方法，使用Jade 軟件下對樣品的結晶度進行計算，相對結晶度（relative crystallinity）為衍射峰面積與總衍射峰面積之比。

1.2.10 差示掃描熱量法（DSC） 參照SHI 等[19]方法并稍作修改，采用差示掃描量熱儀分別對綠咖啡油微膠囊和空囊樣品進行掃描，并作差示掃描分析曲線，測定玻璃態轉變溫度。

1.3 數據處理

采用Origin 96（Northampton， MA， USA）軟件繪圖，利用SPSS 26.0 軟件（IBM Corporation，New York， NY ） 進行樣品間的顯著性分析（P<0.05）。每個樣品重復測定3 次，結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 pH 及壁材混合比例對不同蛋白質與阿拉伯膠體系濁度的影響

由圖2 可知，濁度曲線的起始階段為體系初始pH（pH 為7.0）下的狀態，3 種蛋白質與阿拉伯膠體系濁度均隨pH 的減小呈先上升后下降的趨勢。當pH 下降至3.0～4.0 時，濁度急速上升至峰值1.20～1.60，溶液呈現清晰的乳白色，并逐漸轉向非透明狀。濁度跨越峰值后迅速進入下降階段，與濁度上升過程相比，下降階段趨勢相對平緩且出現拐點，隨后進入一個更為遲緩的下降過程。

此外，隨著不同蛋白質與阿拉伯膠二者間混合比例的不同，其濁度曲線也存在較大差異。SPI∶GA、WPI∶GA 和SC∶GA 的壁材質量比分別設定為1∶1、2∶1 和2∶1 用于后續微膠囊制備的最優條件，其濁度最高點所對應的pH 3.5、3.7和3.8 分別為相應微膠囊形態的最佳理論值。

2.2 復聚物的結構表征

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜分析 由圖3 可知，1610.27 cm^?1和1018.23 cm^?1是屬于阿拉伯膠的峰值，前者在3 種復聚物的光譜上左移，后者消失。此外，SPI 在3293.82 cm^?1處的吸收帶于SPIGA 復聚物中移至3208.96 cm^?1處，WPI 位于3299.60 cm^?1處的吸收帶在WPIGA 復聚物中移至3276.40 cm^?1，SC 位于3208.96 cm^?1處的吸收帶在SCGA 復聚物中移至3203.18 cm^?1 處。在SPI光譜中，1671.98、1535.05、1247.71 cm^?1處的峰對應酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ吸收帶，分別轉移到SPIGA 光譜中1643.05、1536.98、1245.79 cm^-1處；在WPI 光譜中，1641.12、1544.70、1249.64 cm^-1處的峰對應酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ，分別轉移到WPIGA 光譜中的1646.91 、1538.91 、1243.86 cm?1 處。

2.2.2 掃描電鏡分析 采用掃描電鏡對未加入綠咖啡油的干燥凝聚物形態結構進行評價（圖4），所有樣品圖像均顯示粉末尺寸較大，形狀不規則，呈團聚狀存在，也有類似碎玻璃或片狀結構。微粒表面較為完整，無明顯的裂縫。

2.2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）分析 采用CLSM 觀察蛋白質和多糖在復聚物中的分布，蛋白質（SPI/WPI/SC）和阿拉伯膠分別用熒光標記物（FITC 和RBITC）染色。如圖5 所示，3 種復聚物大小不規則，凹陷較少且熒光分布均勻。圖5A、圖5D 和圖5G 標記蛋白質顯示綠色結構，圖5B、圖5E 和圖5H 標記阿拉伯膠為紅色通道，均獲得類似的顯微圖像，表明SPI/WPI/SC 和阿拉伯膠同時存在于凝聚的復聚物中；圖5C、圖5F和圖5I 可以清楚地看到復合凝聚體（黃色）的形成，說明阿拉伯膠與蛋白質緊密結合，其中SCGA顆粒外圍有明顯的綠色熒光，可能是由于酪蛋白酸鈉分子比阿拉伯膠分子密度大造成的。

圖片共定位分析常用方法有散點圖（圖6）、共定位相關系數分析（表3），均可直觀說明分子間的相互作用、相對位置關系和空間距離[20]。如圖6 所示，WPIGA 的散點圖分布呈一條直線，說明2 個熒光通道在成像時強度相當，相關性最強且r=0.945，越趨近于1，共定位程度最高；SPIGA共定位程度次之（r=0.930），而SCGA 的散點圖分布偏移對角線，相關性較低（r=0.902），共定位程度最低。共定位分析顯示3 種蛋白質與阿拉伯膠分布相似，重合率>90%。

2.3 微膠囊的理化性質

2.3.1 微膠囊的產率及包埋率 由表4 可知，SPIGA-GCO 微膠囊產率最高，平均為86.40%，WPIGA-GCO 的產率最低，SPIGA-GCO、SCGAGCO微膠囊產率與WPIGA-GCO 差異顯著（P<0.05）。不同壁材的微膠囊之間包埋率存在顯著差異（P<0.05），SPIGA-GCO 的包埋率最高，平均為69.26%，較SCGA-GCO 與WPIGA-GCO具有相對較好的包埋效果。以WPIGA-GCO 的表面含油量最高（15.96%），對應包埋率最低。SCGA-GCO 的TO 含量為三者最高，但包埋率較低。

2.3.2 微膠囊的粒徑分析 3 種蛋白質與阿拉伯膠為壁材制備的綠咖啡油微膠囊粒徑分布均勻，總體上呈正態分布，呈明顯的單峰分布（圖7）。3 種微膠囊的徑距隨壁材種類的不同而無明顯差異（P≥0.05），范圍為0.72～1.87（表5）。壁材種類對綠咖啡油微膠囊平均粒徑有顯著影響（P<0.05 ）， 平均粒徑范圍97.60～162.00 μm， 其中WPIGA-GCO 的粒徑最大（162.00 μm）。

2.4 微膠囊的微觀結構分析

2.4.1 FT-IR 分析 綠咖啡油微膠囊的紅外光譜如圖3 所示。綠咖啡油3464.45 cm^–1（O-H 拉伸）和2935.13、2850.27、1745.26 cm^–1（C=C 伸縮）呈強振動模式，其中1157.08 cm^–1對應C-O-C 伸縮。3 種綠咖啡油微膠囊紅外光譜峰位于3542.00～3507.00 cm^-1區域內，3 種蛋白質在這個區域也存在類似的峰值范圍（3299.00～3208.00 cm^–1），是由于O-H 鍵的伸縮振動，且在GA 粉末中3392.17 cm^–1處發現相同峰，為多糖中O-H 相關的典型吸收帶伸縮（3550.00～3200.00 cm^–1）、脂肪族伯胺（N-H）伸縮（3400.00～3300.00 cm^–1）和仲胺（N-H）伸縮（3350.00～3310.00 cm^–1）。在游離綠咖啡油的光譜中出現吸收帶3465.45 cm^–1分別轉移到3 種綠咖啡油微膠囊光譜中3131.83、3139.54、3145.32 cm^–1處。比較綠咖啡油、3 種復聚物和綠咖啡油微膠囊的光譜， 在2933.00～2850.00 cm^-1處出現特征吸收帶，證明存在類黃酮的伸縮振動（2920.00～2970.00 cm^?1）和亞甲基的不對稱振動（2925.00～2853.00 cm^?1），表示綠咖啡油已成功封裝到3 種不同復聚物中。綠咖啡油光譜中出現1745.26 cm^?1吸收峰為甘油三酯羰基官能團強烈特征吸收帶，且在3 種微膠囊FT-IR圖中1745.00～1743.00 cm^?1處也出現其峰值。

2.4.2 SEM 分析 3 種微膠囊粉末微觀結構如圖8 所示。所有樣品粉末都具有碎玻璃結構和萎縮的紋理，且顆粒形狀和大小不同，呈不規則片狀結構。SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO微膠囊由于蛋白質的乳化特性，油滴在光滑無孔的表面形態下分散，圖像顯示微粒表面沒有裂紋或裂縫的跡象。

2.4.3 CLSM 分析 由圖9 可以發現，綠咖啡油微膠囊是不規則粒子，由于CLSM 的景深有限，凹陷表面的掃描盲區顯示為黑色。綠色圖層（圖9A、圖9D、圖9G）為FITC 所染不同的蛋白質，紅色圖層（圖9B、圖9E、圖9H）為尼羅紅所染的綠咖啡油， 后者的熒光強度反映油量。在WPIGA-GCO和SCGA-GCO顆粒表面有部分強烈的紅色熒光，說明表面油量較多且相對包埋率低（圖9E、圖9H）。SPIGA-GCO 圖像顯示的熒光強度較低且均勻，表明綠咖啡油被較好地包埋在顆粒內部（圖9B）。此外，從圖9C、圖9F、圖9I 中觀察到油滴（紅色部分）被均勻地嵌入在蛋白質基質（綠色部分）中，無論是外層還是內層，表明綠咖啡油被SPIGA、WPIGA 或SCGA 成功封裝。其中SPIGA-GCO 中紅色熒光分布更為均勻，說明綠咖啡油被有效包埋在SPIGA 中；而WPIGA-GCO 中部分油滴被組織成小液滴外露在壁材表面（箭頭所示）。

2.4.4 XRD 分析 圖10 所示，3 種壁材（SPIGA、WPIGA、SCGA）與其綠咖啡油微膠囊的衍射圖形大致相似，為一個較寬的漫反射峰，表明綠咖啡油微膠囊具有無定形結構的特征；3 種綠咖啡油微膠囊衍射角（2θ）范圍為19.38～20.92°與壁材相比（19.18～19.58°），微膠囊的特征峰都發生了偏移。表明SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO 的絡合是成功的。此外，3 種壁材與綠咖啡油微膠囊的2θ 附近其峰值銳度和強度存在差距，綠咖啡油微膠囊峰值較窄且強度增加，表明添加綠咖啡油不會顯著改變主衍射峰的位置，但會使衍射峰變窄且強度增加。本研究中SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO 3 種微膠囊的相對結晶度分別為45.99%、46.37%和42.23%，其中WPIGA-GCO 顯示出很小的結晶傾向，與其他壁材相比具有較高的相對結晶度。

2.5 微膠囊的熱性能分析

由圖11 可知，3 種綠咖啡油微膠囊的玻璃化轉變溫度均在100 ℃ 以上， SPIGA-GCO 、WPIGA-GCOH 和SCGA-GCO 分別在107.60、108.33、103.93 ℃有明顯的吸熱峰，而3 種壁材分別在112.12、110.21、109.46 ℃達到熱變性溫度，三者變化趨勢相似，峰位略有移動。

3 討論

本研究提出了綠咖啡油與3 種蛋白質和阿拉伯膠復聚物作為微膠囊載體的結合條件。

3.1 復聚物最佳pH 和壁材比研究

3種蛋白質與阿拉伯膠體系濁度均隨pH 的減小呈先上升后下降的趨勢，當pH 下降至3.0～4.0時，濁度急速上升至峰值，濁度跨越峰值后迅速進入較為遲緩的下降階段。主要是由于隨著靜電相互作用的增強，先前形成的可溶性復合物發生了結構間的重排，從而形成某種相對緊密的結構。復聚物濁度的峰值還意味著不同蛋白質與阿拉伯膠間的靜電相互作用達到了最大值，此刻發生相分離，具備了形成微膠囊的可能性[21]。濁度跨越峰值后迅速進入下降階段，這可能是由于不可溶性復合物基本消失，體系過渡到可溶性復合物的解體過程中，發生“破乳”現象。不同蛋白質與阿拉伯膠混合比例的不同，其濁度曲線也存在較大差異，說明pH 和壁材質量比都極大地影響了蛋白質和多糖的相互作用以及微膠囊的形成?；陟o電相互作用最大即等同于濁度最大的原理，各曲線濁度最大點均為各比例下的靜電中和點[22]，達到該點可使壁材最大程度被利用。本研究結果與賈聰等[23]和夏慧亭等[24]的報道一致，酪蛋白酸鈉和阿拉伯膠的最適pH 與劉春花等[25]的研究結果略有不同，可能是由于在制備蛋白儲備液時，鹽離子使得后續復合物體系發生改變，最佳條件也會發生細微影響。

3.2 蛋白質與阿拉伯膠制備復聚物的結構表征

3.2.1 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 紅外光譜是生物聚合物結構分析的有力工具，可提供蛋白質和阿拉伯膠復雜凝聚過程中相互作用的信息[26]。本研究通過FT-IR 掃描圖譜和熒光共定位分析證實了蛋白質與阿拉伯膠之間存在靜電相互作用，獲得了穩定、表觀完整的復聚物，為后續的綠咖啡油包埋工作奠定了基礎。SPI、WPI 和SC 吸收帶在復聚物中發生偏移，表明SPI、WPI和SC 中的O-H 基團與阿拉伯膠中的C=O 基團之間形成了氫鍵[27]。3 種蛋白質與阿拉伯膠形成復聚物，單一組分的壁材在形成復聚物后在酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的吸收峰分別有偏移，說明蛋白質的氨基與阿拉伯膠的羧基確實發生靜電相互作用。QIU等[28] 通過紅外光譜發現綠豆蛋白吸收峰從3294.01 cm-1 移動到綠豆蛋白和杏皮果膠復聚物中的3293.46 cm?1 處，表明綠豆蛋白與杏皮果膠之間發生靜電相互作用，與本研究結論一致。

3.2.2 掃描電鏡（SEM）分析 SEM 下未加入綠咖啡油的干燥凝聚物微粒表面較為完整，無明顯裂縫。說明SPI、WPI、SC 與阿拉伯膠相互作用，構建了致密性良好的壁材體系，促進微膠囊的形成[17]。碳水化合物的添加使得壁材體系在結構形態上更加穩定，對于芯材的保護和避免氧化，提高微膠囊穩定性至關重要。本研究復聚物形態結果與CHARLES 等[29]的研究結果一致，后者發現以麥芽糊精和乳清分離蛋白制備的復聚物其結構不規則，缺乏正常的球形，呈現高度多孔。

3.2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）分析CLSM 下3 種復聚物大小不規則，凹陷較少且熒光分布均勻，這可能是因為碳水化合物組成的壁材體系具有更高的分子柔性，表現出更多的分子構型，導致成膜均勻[18]，提高微膠囊穩定性。DUHORANIMANA 等[16]研究表明，蛋白多糖復合凝聚的膠囊壁外部界面上高密度的明膠分子有利于保護芯材。CLSM 分析發現，3 種蛋白質和阿拉伯膠在復聚物內均勻分布，構成穩定的骨架，可賦予微膠囊壁一定的機械強度和致密性，對提高微膠囊的氧化穩定性有重要作用。

3.2.4 共定位分析 不同蛋白和阿拉伯膠復合凝聚后具有良好的相關性，其中WPIGA 相關性最強，說明乳清分離蛋白與阿拉伯膠之間有較強的靜電相互作用。本研究發現蛋白質和多糖在顆粒內部均勻分布，構成高穩定性的骨架，共定位分析也顯示蛋白與多糖分布相似，重合率達到70%以上，與ZHANG 等[30]的研究結果類似。

3.3 蛋白質與阿拉伯膠制備微膠囊的理化性質、結構及性能特點

3.3.1 理化性質 不同壁材對微膠囊的產率有顯著影響，本研究結果與肖軍霞等[31]以大豆分離蛋白阿拉伯膠為壁材包埋甜橙油的結果一致。包埋率用來評價粉末狀微膠囊內油脂的保護程度，是微膠囊粉末的重要特征。ILYASOGLU 等[32]通過冷凍干燥獲得的魚油微膠囊包埋率為29.40%～81.60%。與本研究所得包埋率相似，說明3 種壁材均有效包埋綠咖啡油。SHAO 等[26]以麥芽糖糊精-蛋白為壁材制備靈芝多糖微膠囊，與大豆分離蛋白和酪蛋白酸鈉相比，乳清蛋白和麥芽糖糊精絡合制備的微膠囊包埋率達到89.80%，說明適當添加蛋白可改善麥芽糊精的性能，提高包封效率。由此可知，壁材的選擇也可改變微膠囊包埋率，且與壁材的種類無線性關系。表面油（SO）表示存在于微膠囊表面未被包埋的綠咖啡油，易發生氧化變質，從而降低功能成分的保質期[33]，是導致包埋率較低的主要因素之一。因此應盡量減少脂質封裝中的表面油量。WPIGA-GCO 的SO 較高，對應包埋率較低。SCGA-GCO 的SO 含量為最高，但包埋率較低，由此可知，盡管粉末中的高含油量是理想的，但相對較高的包埋率也可能導致芯材損失[34]，因此還需最大限度保護油的同時減少表面油含量。

3.3.2 粒徑 粒徑大小是微膠囊應用于食品基質的一個主要特征。壁材種類對綠咖啡油微膠囊平均粒徑有顯著影響，本研究表明WPIGA-GCO 的粒徑最大，可能是由于WPI 的乳化和成膜能力在干燥過程中誘導微膠囊膨脹或膨化，通過增加封閉空氣含量來增加粒徑尺寸。這一結果與石澤棟等[10]對牛至精油微膠囊化的結果相似，其微膠囊平均粒徑為147.00 μm。

3.3.3 FT-IR FT-IR 是生物大分子及其聚合物結構分析的有力工具，通過FI-TR 掃描分析，可以顯示各物質的分子結構和特征化學鍵[35]，可以證明微膠囊的形成以及物質之間是否存在相互作用。綠咖啡油微膠囊的紅外光譜顯示，綠咖啡油具有強烈的疏水性[36]，壁材和芯材之間發生氫鍵效應，對應酯的存在[28]，綠咖啡油成功包埋于3種復聚物中，且與壁材未發生化學反應。

3.3.4 微觀結構 SEM 顯示3 種微膠囊粉末微觀結構，顯示微粒表面無裂紋或裂縫的跡象，但是不同微膠囊截面存在相似的微腔和孔隙，可能是由于乳狀液在冷凍過程中形成較小的冰晶，且在冷凍干燥過程中升華，從而形成多孔結構。YANG等[37]研究解釋了微膠囊表面光滑是因為蛋白質構象會隨著蛋白質與不同材料的相互作用而改變，趨向于更有利的相互作用，如通過靜電相互作用能夠穩定復合物和降低系統的表面張力。本研究結果顯示，3 種配方制備的綠咖啡油微膠囊壁結構相對完整，由此可推斷微膠囊對芯材具有良好的保護作用。此外，實驗結果與其表面油含量和包埋率的測定結果一致，以SPI 和阿拉伯膠為壁材制備的綠咖啡油微膠囊表面最平整光滑，其表面油含量最低，包埋率最好。SEM 顯示了綠咖啡油微膠囊的表觀形態，但不能直觀地觀察到微膠囊的油滴分布，因此，使用多重標記的CLSM觀察3 種綠咖啡油微膠囊中油滴分布，CLSM 圖像證實了綠咖啡油已成功包埋在3 種復合壁材中，且印證了SEM 圖像的觀察結果。這一結果進一步說明SPIGA、WPIGA 和SCGA 可作為包埋綠咖啡油的微膠囊壁材。

3.3.5 XRD為了研究復合壁材和綠咖啡油微膠囊的晶體結構及其結晶度進行了XRD 測定。一般來說，晶體材料的峰較尖，而非晶材料的峰較寬。本研究顯示，芯材和壁材之間具有高度相容性，且包埋后不會在很大程度上破壞壁材的無定形結構，說明綠咖啡油微膠囊已經形成，與曹俊英等[38]的研究結果一致。一般來說，無定形壁材比結晶壁材具有更強的吸濕性和水溶性，因此在貯藏過程中會吸附更多的水，并通過微觀結構的破壞、營養物質的降解和微生物的不穩定性降低了微膠囊的貯藏穩定性。為了研究綠咖啡油微膠囊的穩定性，計算了微膠囊的結晶度。本研究中SPIGA-GCO、WPIGA-GCO 和SCGA-GCO 3 種微膠囊的相對結晶度分別為45.99%、46.37%和42.23%，表明該晶體結構是理想的，所得結果與ALI 等[18]報道苦參提取物微膠囊的相對結晶度（34.03%～46.52%）類似。其中WPIGA-GCO 顯示出很小的結晶傾向，與其他壁材相比具有較高的相對結晶度，可能是由于分子間相互作用，結晶度和游離體積均會影響勢壘的滲透率，具有相對較好的貯藏穩定性。

3.3.6 熱性能 采用DSC 測定樣品在控溫過程中吸收或釋放的熱量，以評價樣品的熱力學性質。在DSC 測量中，熱分析譜上的吸熱峰代表了試樣的熱變性溫度區，該峰值對應的溫度即為熱變性溫度（玻璃化轉變溫度），樣品的變性溫度越高，熱穩定性越高[39]。本研究中，3 種綠咖啡油微膠囊的玻璃化轉變溫度均在100 ℃以上，說明微膠囊化對綠咖啡油具有良好的保護作用。SPIGA-GCO、WPIGA-GCOH 和SCGA-GCO 出現明顯的吸熱峰與達到熱變性溫度時二者趨勢相似，峰位略有移動，其原因可能是2 種體系的孔隙率和微觀結構的差異。BURHAN 等[39]制備的肉桂精油納米微膠囊具有較高的熱穩定性，發現高熱穩定性與蛋白質和多糖分子間的相互作用有關，與本研究結果相似。

綜上，微膠囊實驗表明，不同蛋白質與阿拉伯膠的組合對微膠囊的粒徑和包埋率有顯著影響；通過傅里葉紅外光譜發現壁材和芯材之間存在較強的氫鍵效應；SEM 和CLSM 表征結果證明綠咖啡油最終包埋在3 種壁材中；XRD 圖譜表明3 種微膠囊具有無定形結構，且綠咖啡油的嵌入對微膠囊的結晶狀態無顯著影響；通過DSC 對不同蛋白質與阿拉伯膠形成的復聚物熱穩定性進行分析，得出其微膠囊產品性質比較穩定，整體結構完整，表明3 種復合壁材可對綠咖啡油有良好的保護作用。其中SPIGA-GCO 的產率最高（86.40%）、粒徑最?。?7.60 μm）、包封率最大（69.26%）、油滴能夠均勻嵌入壁材并具有更好的熱穩定性（107.60 ℃），表明用大豆分離蛋白和阿拉伯膠對綠咖啡油包埋效果更優，更有利于綠咖啡油的儲存和使用。以3 種疏水蛋白質與阿拉伯膠為壁材，通過復合凝聚法制備綠咖啡油微膠囊具有可行性，所制備的綠咖啡油微膠囊表現出優良的熱穩定性，為綠咖啡油在食品領域的深加工利用提供了理論依據和技術支撐。