響應面法優化振蕩法提取海鮮菇總黃酮的工藝

李昕霖

摘 要：為了優化振蕩法提取海鮮菇總黃酮的工藝條件，提高總黃酮得率，以乙醇為溶劑，設計單因素試驗探究料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數對海鮮菇總黃酮得率的影響，并在此基礎上進行響應面優化試驗。結果表明：在乙醇體積分數為50%、料液比為1∶30、提取溫度為59℃、提取時間為2 h條件下，海鮮菇總黃酮得率為3.22 mg·g-1。

關鍵詞：海鮮菇；總黃酮；提??；響應面法

中圖分類號：S 646.1? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）02-0061-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.010

Abstract： In order to optimize the technological conditions of total flavonoids extracted from Hypsizygus marmoreus by oscillation method and improve the yield of total flavonoids， the single factor experiment was designed with ethanol as the solvent to explore the effects of solidliquid ratio， extraction temperature， extraction time and ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids from Hypsizygus marmoreus， and the response surface optimization experiment was carried out on this basis. The results showed that under the conditions of ethanol volume fraction of 50%， solidliquid ratio of 1∶30， extraction temperature of 59℃ and extraction time of 2 h， the yield of total flavonoids from Hypsizygus marmoreus was 3.22 mg·g-1.

Key words： Hypsizygus marmoreus； Total flavonoids； Extract； Response surface method

海鮮菇Hypsizygus marmoreus又名玉蕈、真姬菇、鴻喜菇（臺灣），屬擔子菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬[1]，因具有海鮮的鮮香氣味而得名，富含蛋白質、礦物元素，以及氨基酸、多糖、黃酮類等多種活性成分[2-3]，是一種藥食兼用的珍稀菇種[4-5]。黃酮類化合物屬于植物次生代謝產物，人體不能通過自身合成，具有抗氧化、抗炎殺菌、改善心腦血管血液循環、增強機體免疫能力等作用，且分子量小，容易被人體吸收[6-7]，被廣泛應用在保健品、藥品方面。

近年來，我國海鮮菇工廠化企業蓬勃發展，鮮菇規?？偭坎粩鄩汛?，但基本以統貨方式銷售，產品附加值還較低。國內外以食用菌為原料提取黃酮類化合物的研究已成為營養學領域研究熱點之一，通常采用的提取方法有溶劑浸提、微波提取、超聲波輔助提取、酶輔助提取法、萃取法和振蕩法等[8-9]，每種方法各有優缺點。韓秋菊等[10]利用乙醇浸提法提取黑木耳中總黃酮，總黃酮提取率達0.43%；崔福順等[11]利用超聲輔助提取美味牛肝菌中總黃酮，總黃酮提取率達1.36%；王廣慧等[12]采用復合酶法從金針菇中提取總黃酮，總黃酮的提取率達4.76%，但采用振蕩法提取海鮮菇總黃酮的研究還較少。本研究在前期研究的基礎上，以海鮮菇總黃酮得率為指標，結合單因素試驗，通過BoxBenhnken響應面法優化振蕩法提取海鮮菇總黃酮的工藝條件，以期對海鮮菇加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以海鮮菇子實體為研究對象，由福建福泉鑫生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

蘆丁標準品、無水乙醇、三氯化鋁、醋酸鉀等均為分析純。

101A型恒溫鼓風干燥箱（上海捷呈實驗儀器有限公司）；SP756P型紫外可見分光光度計（上海滬粵明科學儀器有限公司）；GFSJ8型高效粉碎機（江陰市豐英機械制造有限公司）；SPH103B型恒溫培養振蕩器（濟南禾普儀器設備有限公司）；TGL16MC 臺式高速冷凍離心機（長沙湘銳離心機有限公司）。

1.3 單因素試驗設計

1.3.1 料液比對海鮮菇總黃酮得率的影響 在提取溫度為60℃，乙醇體積分數為60%、提取時間為2.0 h的情況下，分別在1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35的料液比下進行提取。

1.3.2 提取溫度對海鮮菇總黃酮得率的影響 在料液比1∶25、乙醇體積分數為60%、提取時間為2.0 h的情況下，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下溫度進行提取。

1.3.3 提取時間對海鮮菇總黃酮得率的影響 在提取溫度為60℃、料液比1∶25、乙醇體積分數為60%情況下，分別在0.5、1、1.5、2.0、2.5 h提取時間下提取。

1.3.4 乙醇體積分數對海鮮菇總黃酮得率的影響 在提取溫度為60℃、料液比1∶25、提取時間為2.0 h的情況下，分別在30%、40%、50%、60% 和70% 乙醇溶液下進行提取。

1.4 響應面法優化

結合單因素試驗結果，根據BoxBenhnken中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平響應面分析方法進行分析[13]，試驗因素及水平見表1，固定乙醇體積分數為50%，以料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）3個因素為影響因素，總黃酮得率為響應值，探究海鮮菇總黃酮提取的優化提取參數。

1.5 海鮮菇總黃酮的提取

新鮮成熟的海鮮菇（正常生長120 d左右），于60℃干燥箱烘干，經粉碎機粉碎后過50目篩，得到均一的海鮮菇子實體粉末，保存備用。準確稱取1.0 g海鮮菇粉于50 mL容量瓶中，以乙醇為溶劑，在試驗設定的料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數下進行振蕩提取，振蕩速率120 r·min-1。以轉速4000 r·min-1離心15 min，重復提取1次，合并2次上清液，定容至刻度，得到海鮮菇黃酮提取液[14]。

1.6 總黃酮含量的測定

采用蘆丁比色法[15]。

1.6.1 標準曲線的繪制 將干燥后的蘆丁標準品配置成溶度為0.3 mg·mL-1的標準溶液，精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置6支15 mL的容量瓶中，分別加入2.0 mL三氯化鋁溶液，搖勻；加入2.0 mL醋酸鉀溶液，搖勻；用30%乙醇定容至刻度，搖勻，于室溫靜置15 min后測定體系在415 nm處的吸光度，并繪制標準曲線[16]。以濃度C（mg·mL-1）為橫坐標， 吸光度Z為縱坐標，得到回歸方程為Z=0.5885C+0.0078，R2=0.9991。

1.6.2 總黃酮得率計算 精密吸取1.5中海鮮菇黃酮提取液1.0 mL，其他步驟參考1.6.1，由回歸方程計算出待測液中黃酮化合物含量，并按下式計算海鮮菇總黃酮得率。

W=（C×N×V）/M

式中：W表示總黃酮得率（mg·g-1）；C表示總黃酮的濃度（mg·mL-1）；N表示稀釋倍數；V表示海鮮菇黃酮提取原液體積（mL）；M表示樣品質量（g）

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 料液比對海鮮菇總黃酮得率的影響 由圖1可知，當料液比從1∶15提高至1∶30時，海鮮菇總黃酮得率逐漸增大，且在料液比1∶30時達到最大，可能是此時樣品中黃酮類化合物溶出量已趨于飽和，但是當料液比繼續升高時，會使樣品中雜質溶出而影響試驗測定[17]。

2.1.2 提取溫度對海鮮菇總黃酮得率的影響 由圖2可知，當提取溫度從40℃升至60℃，海鮮菇總黃酮得率不斷增加且變化較大，這可能是溫度的增加使海鮮菇黃酮類化合物溶解度增大從而得率增加。當提取溫度達到70℃后，總黃酮得率呈緩慢下降趨勢，可能是高溫使樣品中黃酮類化合物分解。

2.1.3 提取時間對海鮮菇總黃酮得率的影響 由圖3可知，當提取時間在0.5～2.0 h范圍內，隨著提取時間的加長海鮮菇總黃酮的得率呈增加趨勢，超過2.0 h后總黃酮得率下降。其原因可能是提取時間較短時，黃酮類化合物還沒完全溶出，提取時間適當延長有助于提高總黃酮的得率，但當超過一定時間，可能也會破壞黃酮類化合物的分子結構造成得率下降。

2.1.4 乙醇體積分數對海鮮菇總黃酮得率的影響 從圖4可知，乙醇體積分數對海鮮菇總黃酮得率的影響相對較小，當乙醇體積分數達到50%時，海鮮菇總黃酮得率達到最大。當乙醇體積分數繼續提高時，海鮮菇總黃酮得率略有下降。

2.2 響應面結果分析

海鮮菇總黃酮提取工藝響應面分析試驗設計及結果見表2。采用Design Expert 8.0.6軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到以海鮮菇總黃酮得率為響應值的回歸方程式：

Y=3.192-0.03125X1-0.08875X2-0.08X3-0.03X1X2+0.0075X1X3-0.0225X2X3-0.396X12-0.321X22-0.3035X32

2.2.1 回歸模型方差分析 由表3可知，失擬項P=0.1415＞0.05，說明差異不顯著，模型的F=836.8946且P<0.0001，說明回歸模型擬合項高度顯著，能通過該近似模型進行后續的優化設計。從F值的大小可以判斷，3個因素對響應值Y的影響排序從大到小依次是：X2（提取溫度）、X3（提取時間）、X1（料液比）。一次項X1、X2、X3，二次項X12、X22、X32，以及交互項X1X2對響應值Y的影響均極顯著（P<0.01），交互項X2X3對響應值Y的影響顯著（P<0.05），X1X3對響應值Y的影響不顯著。

2.2.2 因素交互作用對海鮮菇總黃酮得率的影響 由圖5可知，在固定提取時間（X3）的條件下，隨著料液比（X1）或者提取溫度（X2）的增加，海鮮菇總黃酮得率呈現先增加而后減少的趨勢。響應面坡度陡峭，說明料液比（X1）和提取溫度（X2）兩因素的交互作用對海鮮菇總黃酮得率影響很顯著[18]，和方差分析結果一致。由圖6可知，在固定料液比（X1）的條件下，隨著提取溫度（X2）和提取時間（X3）的提高，海鮮菇總黃酮得率呈先增加后減少的趨勢。響應面坡度較陡峭，說明提取溫度（X2）和提取時間（X3）兩因素的交互作用對海鮮菇總黃酮得率影響顯著，和方差分析結果一致。

2.2.3 最佳提取工藝及驗證試驗 經響應面分析得出，響應面優化提取海鮮菇總黃酮的最佳工藝條件為：料液比1∶29.82、提取溫度58.68℃、提取時間1.94 h，該工藝條件下，預測海鮮菇總黃酮得率為3.21 mg·g-1。為滿足實際操作，特將海鮮菇總黃酮的最佳工藝參數調整修正為：料液比1∶30、提取溫度59℃、提取時間2 h。在該提取條件下，經過6次平行驗證試驗，測得海鮮菇總黃酮得率的均值為3.22 mg·g-1，與預測值基本接近，說明該方法對預測海鮮菇中總黃酮的實際提取率準確可靠，具有一定應用價值。

3 結論與討論

單因素試驗基礎上，通過BoxBenhnken響應面法優化并結合操作實際，得到海鮮菇總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分數50%、料液比1∶30、提取溫度59℃、提取時間2 h，總黃酮得率為3.22 mg·g-1，且各因素對總黃酮得率的影響排序從大到小依次是：提取溫度、提取時間、料液比、乙醇體積分數。

調查顯示，每年3月、6月海鮮菇鮮品市場菇價波動較大，前兩年受新冠疫情的影響甚至出現一家企業就滯銷千余噸海鮮菇的情況，因此從海鮮菇中提取功能性成分進而開發高價值產品，不僅僅可以提升產品附加值，更有利于促進行業健康發展。本試驗通過響應面優化振蕩法提取海鮮菇總黃酮的工藝，該方法經濟簡單，為海鮮菇進一步加工利用提供了理論依據[19]。

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（責任編輯：柯文輝）